小鼠嗜肺巴斯德桿菌檢測方法優(yōu)化及感染小鼠的藥物凈化

張 韜,崔 璨,馬貫中,張愛華

(1.南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實驗動物中心,南京211166;2.上海南方模式生物科技股份有限公司,上海200120)

嗜肺巴斯德桿菌（Pasteurella pneumotropica）屬于巴斯德菌科巴斯德菌屬，為革蘭陰性短桿或球桿菌［1］。嗜肺巴斯德桿菌是條件性致病菌，多數(shù)動物感染后無任何臨床癥狀，但在動物免疫機制受到抑制和應(yīng)激因子的作用下，容易發(fā)生呼吸道疾病，還可與仙臺病毒、肺支原體等呼吸道病原微生物合并感染［2］，因而影響實驗動物質(zhì)量；而且使用隱性感染的小鼠進行動物實驗，也會對實驗結(jié)果產(chǎn)生嚴重干擾［3］。

由于嗜肺巴斯德桿菌對外界理化因素抵抗力不強，生長條件相對苛刻，在檢測中與其他細菌涂布于同一培養(yǎng)基上同時培養(yǎng)時為弱勢菌落，故傳統(tǒng)的血瓊脂平皿直接分離培養(yǎng)法易造成漏檢［4］。因此，優(yōu)化嗜肺巴斯德桿菌檢測方法以提高檢測敏感度，可避免檢測假陰性的發(fā)生。目前，針對嗜肺巴斯德桿菌感染，最有效的清除方式是剖宮產(chǎn)和胚胎移植。然而這兩種方法耗時且費用昂貴，不適用于飼養(yǎng)量大、品系多的設(shè)施［3］。因此，需要建立一種應(yīng)急情況下快速去除嗜肺巴斯德桿菌的藥物凈化方案。

本研究評價了直接涂板法和改良增菌法對嗜肺巴斯德桿菌的檢出情況，并對本地分離出的嗜肺巴斯德桿菌進行了抗生素敏感性測試；然后用該菌株感染小鼠后隔離飼養(yǎng)，進一步進行藥物安全性和凈化效果分析。本研究旨在優(yōu)化嗜肺巴斯德桿菌檢測方法，提高檢測敏感性，以強化嗜肺巴斯德桿菌的日常監(jiān)測，并對嗜肺巴斯德桿菌感染小鼠的藥物凈化方案進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

評價檢測方法時，選取某設(shè)施實驗用小鼠152只。

藥物安全性評價用SPF級C57BL/6小鼠48只，雌性，7～8周齡。藥物凈化效果評價用SPF級C57BL/6小鼠80只，雌性，16～17周齡。以上實驗小鼠均購自南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實驗動物中心［SCXK（蘇）2016-0002］，飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實驗動物中心［SYXK（蘇）2015-0015］。動物飼養(yǎng)條件：室溫（22±1）℃，相對濕度40%～70%，給予12 h晝夜光照循環(huán)，自由進水進食。實驗過程中，藥物凈化效果評價的實驗小鼠均在屏障設(shè)施內(nèi)的獨立房間內(nèi)，以IVC籠具進行隔離飼養(yǎng)，籠器具等裝置單獨進行高壓滅菌處理。動物實驗經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物福利倫理委員會批準(zhǔn)［IACUC-1701021］。

1.2 主要試劑和藥品

腦心浸液培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基購自上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司；特級馬血清購自南京貝斯特生物技術(shù)有限公司；PCR相關(guān)試劑購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；抗菌藥物藥敏紙片（包括頭孢氨芐30μg/片、頭孢西丁30μg/片、頭孢噻吩30μg/片、頭孢羥唑30μg/片、頭孢克洛30μg/片、青霉素10U/片、四環(huán)素30μg/片、復(fù)方新諾明（磺胺甲噁唑/甲氧芐啶）23.75或1.25μg/片、丁胺卡那30μg/片、慶大霉素10μg/片、妥布霉素10μg/片、恩諾沙星10μg/片）購自杭州微生物試劑有限公司；微需氧產(chǎn)氣袋購自日本Mitsubishi Gas Chemical公司；拜有利10%恩諾沙星注射液購自德國Bayer公司；三溴乙醇、叔戊醇購自美國Sigma公司。

1.3 菌株

本研究第一部分優(yōu)化檢測方法時，從待檢小鼠咽拭子和氣管中分離獲得并檢測確認為嗜肺巴斯德桿菌的菌株，收集后用于藥敏實驗和藥物凈化研究。

1.4 主要儀器

生物安全柜（BIOⅡAdvance 6）購自西班牙Telstar公司；生化培養(yǎng)箱（SPX-150BS-Ⅱ）購自上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；三目生物顯微鏡（CX31RTSF）購自日本Olympus公司；全波長酶標(biāo)儀（Multiskan Spectrum）購自美國Thermo公司；NEW ATB自動細菌鑒定分析儀（IAF020480）購自法國BioMérieux公司；PCR儀（S1000）購自美國Bio-Rad公司；電泳儀購自上海天能科技有限公司。

1.5 嗜肺巴斯德桿菌檢測方法優(yōu)化

小鼠經(jīng)三溴乙醇（250 mg/kg）腹腔注射麻醉，采集咽拭子后，安樂死小鼠，無菌解剖小鼠；采集氣管內(nèi)壁分泌物，涂布于血瓊脂平皿，37℃培養(yǎng)18～24 h（直接涂板法）。然后截取0.5 cm氣管組織，將咽拭子和氣管組織一同放入增菌液（腦心浸液培養(yǎng)基+體積分數(shù)為5%的馬血清）［5］中，37℃培養(yǎng)18～24 h（改良增菌法）。培養(yǎng)結(jié)束后，直接涂板法的血瓊脂平皿按照國家標(biāo)準(zhǔn)［4］觀察培養(yǎng)結(jié)果；增菌培養(yǎng)的菌液接種于血瓊脂平皿，37℃分離培養(yǎng)18～24 h后觀察培養(yǎng)結(jié)果。上述步驟中觀察到的可疑菌落，均按國家標(biāo)準(zhǔn)［4］繼續(xù)進行純化，用梅里埃NEWATB自動化微生物鑒定分析系統(tǒng)以及16SrRNA通用引物PCR序列比對法［6］進行菌株鑒定。兩種方法同時鑒定為嗜肺巴斯德桿菌者，判定為陽性。記錄兩種方法的檢測結(jié)果，比較檢出率。

1.6 抗生素敏感性測試

采用紙片擴散法，將嗜肺巴斯德桿菌菌株增菌過夜后，制成0.5麥?zhǔn)暇鷳乙骸⒕鷳乙壕鶆蛑旅芡坎加诟餮傊矫蟊砻?，室溫下放?5 min。然后將頭孢氨芐、青霉素、恩諾沙星等12種抗菌藥物藥敏紙片分別平貼于已涂布菌液的各培養(yǎng)基表面，與微需氧產(chǎn)氣袋一起置于密封袋中，37℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌環(huán)直徑并進行比較分析。

1.7 恩諾沙星飲水給藥安全性實驗

48只雌性C57BL/6小鼠隨機分為6組，每組8只，飲水給藥。實驗組每天攝入恩諾沙星劑量分別為85、150、200、250和300 mg·kg－1·d－1，配制方法是將1.73、3.05、4.08、5.10和6.10 mL恩諾沙星原液分別溶于300 mL滅菌水。連續(xù)給藥6周，對照組正常飲用滅菌水。每天觀察小鼠狀態(tài)，記錄給藥后2、6、24、48 h各組小鼠的異常表現(xiàn)和死亡情況。實驗結(jié)束時，剖檢各組實驗動物，取肝、腎組織，用體積分數(shù)為10%的甲醛溶液固定標(biāo)本，脫水，石蠟包埋，切片后行HE染色，用于組織病理學(xué)檢查。

1.8 嗜肺巴斯德桿菌陽性鼠藥物凈化研究

制作1×107CFU/mL（菌落形成單位，colony forming unit）的嗜肺巴斯德桿菌菌液，以100μL/只的劑量對C57BL/6小鼠進行灌胃處理。1周后，采集咽拭子，將咽拭子放入增菌液中，按1.5節(jié)中改良增菌法進行嗜肺巴斯德桿菌檢測。檢測出嗜肺巴斯德桿菌陽性后，將小鼠分為實驗組和對照組。實驗組小鼠每天攝入的恩諾沙星劑量分別為50、85、150 mg·kg－1·d－1，連續(xù)給藥2周后停藥6周；對照組正常飲水。每個劑量組和對照組均4籠，每籠5只小鼠。其間每周以籠為單位，對籠內(nèi)所有小鼠采集咽拭子，按1.5節(jié)中改良增菌法進行嗜肺巴斯德桿菌檢測。這部分實驗中，相關(guān)微生物和感染小鼠的實驗操作均在生物安全柜內(nèi)完成；實驗結(jié)束后，對所有小鼠尸體以及實驗廢棄物等做高壓滅菌處理。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對各實驗結(jié)果數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。檢測方法優(yōu)化實驗結(jié)果分析采用Fisher精確概率法；血液生化指標(biāo)結(jié)果以-±s表示，多組間比較先進行方差分析，然后組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 嗜肺巴斯德桿菌檢測方法優(yōu)化

對152只小鼠同時采用直接涂板法和改良增菌法進行嗜肺巴斯德桿菌檢測。結(jié)果顯示，直接涂板法只有極個別平板分離出可疑菌落（圖1A），改良增菌法平板可疑菌落生長更具優(yōu)勢（圖1B）。挑取可疑菌落分離培養(yǎng)后，該菌在血平皿上呈灰白色的光滑滴露樣（圖1C）；染色后油鏡下觀察顯示，該菌為兩端鈍圓的革蘭陰性小桿菌（圖1D）。然后經(jīng)NEWATB微生物鑒定分析系統(tǒng)和16 SrRNA通用引物PCR序列比對法（圖1E）鑒定，結(jié)果均證明是嗜肺巴斯德桿菌（相似度均≥99%）。

圖1 直接涂板法（A）和改良增菌法（B）分離結(jié)果對比，以及菌落分離純化后在血平皿上的菌落形態(tài)（C）、革蘭染色鏡檢（D，×1 000）及PCR序列比對（E）結(jié)果Figure1 Results of isolation by routine procedure(A)and modified method(B)，as well as the colony morphology on blood plateafter purification(C)，microscopic result of Gram staining(D，×1 000)and sequencealignment(E)

最終，152只小鼠中一共檢出嗜肺巴斯德桿菌陽性樣品23份（對應(yīng)23只小鼠）。其中，直接涂板法檢出率為1.3%（2/152），改良增菌法檢出率為15.1%（23/152）。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示改良增菌法優(yōu)于直接涂板法。

將鑒定為嗜肺巴斯德桿菌的分離株進行凍存，用于后續(xù)的藥敏實驗和藥物凈化研究。

2.2 嗜肺巴斯德桿菌藥敏試驗

選用青霉素、四環(huán)素等12種常見抗生素對嗜肺巴斯德桿菌做藥敏試驗。結(jié)果顯示，所試嗜肺巴斯德桿菌菌株對恩諾沙星、頭孢西丁、頭孢羥唑、頭孢克洛、四環(huán)素、慶大霉素和妥布霉素敏感；對頭孢噻吩、復(fù)方新諾明和丁胺卡納中度敏感；對頭孢氨芐和青霉素則具有耐藥性（表1）。因此，選用恩諾沙星對小鼠進行后續(xù)藥物凈化研究。

表1 嗜肺巴斯德桿菌菌株對12種抗生素的藥敏試驗結(jié)果Table1 Antimicrobial sensitivity test resultsof Pasteurella pneumotropica to 12 antibiotic

2.3 恩諾沙星飲水給藥的安全性

恩諾沙星注射液配制成不同的質(zhì)量濃度，對小鼠進行連續(xù)飲水給藥，實驗期內(nèi)各劑量組小鼠飲食和精神均未見異常，未出現(xiàn)跛行、嘔吐、腹痛、皮膚紅斑瘙癢等異常反應(yīng)或死亡，各時間點大體剖檢也未見異常。HE染色結(jié)果（圖2）顯示，與對照組相比，實驗組的肝、腎病理學(xué)檢查均未見明顯變化。實驗組各劑量下的血液生化指標(biāo)檢測結(jié)果的平均值與對照組比較，肝功能相關(guān)的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）和腎功能相關(guān)的血肌酐（CREA）的測量值較為一致，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表2）；各劑量實驗組的堿性磷酸酶（ALP）含量高于對照組（P＜0.05），但仍在正常范圍（118±15.9）［7-8］；血尿素氮（BUN）和血尿酸（UA）水平均低于對照組（P＜0.05），但沒有明確提示意義。

表2 恩諾沙星不同劑量組小鼠的血液生化指標(biāo)Table2 Blood biochemical indexesin miceat different dosesof enrofloxacin

圖2 各組小鼠肝臟（A）和腎臟（B）組織的病理學(xué)結(jié)果（HE染色，×400）Figure 2 Histological observation on liver(A)and kidney(B)in each group(HE staining，×400)

2.4 恩諾沙星的凈化效果

綜合文獻［3，9～10］和安全性實驗結(jié)果，通過設(shè)計3個劑量梯度（50 mg·kg－1·d－1、85 mg·kg－1·d－1、150 mg·kg－1·d－1）來測試恩諾沙星飲水給藥的療效，結(jié)果如表3所示。各劑量實驗組給予恩諾沙星飲水給藥1周后，嗜肺巴斯德桿菌陽性小鼠均轉(zhuǎn)陰；50 mg·kg－1·d－1劑量組在停藥第6周后，4籠中有2籠出現(xiàn)嗜肺巴斯德桿菌轉(zhuǎn)陽；但85 mg·kg－1·d－1和150 mg·kg－1·d－1劑量組維持6周仍未轉(zhuǎn)陽。

表3 恩諾沙星藥物凈化效果Table 3 Effect of drug purification with enrofloxacin

3 討論

嗜肺巴斯德桿菌是目前國內(nèi)外實驗小鼠感染率最高的病原菌之一［11-12］。因為嗜肺巴斯德桿菌本身比較脆弱、動物感染后帶菌量較少［12］、在血平皿上屬于非優(yōu)勢菌落等原因，直接分離容易造成漏檢，因此提高嗜肺巴斯德桿菌的檢測敏感性十分重要。已有報告顯示，從小鼠咽部采樣，嗜肺巴斯德桿菌分離率最高［12］。因此，本研究使用增菌液（腦心浸液培養(yǎng)基+體積分數(shù)為5%的馬血清）對小鼠咽拭子和氣管組織進行增菌。結(jié)果顯示，相比于直接涂板法，改良增菌法的嗜肺巴斯德桿菌檢出率更高，提示后者可用于動物房的日常健康監(jiān)測。

除了胚胎移植和剖宮產(chǎn)凈化外，嗜肺巴斯德桿菌感染鼠的藥物凈化方法值得進一步探討。本研究中，本地分離的嗜肺巴斯德桿菌菌株對7種抗生素敏感。其中，恩諾沙星口服吸收較快且完全，組織分布濃度高［13］，能購買到液體制劑，而其他抗生素存在口服不易吸收或劑型不方便操作等問題。因此，本研究選擇恩諾沙星經(jīng)飲水給藥進行后續(xù)研究。此前，有研究者嘗試用恩諾沙星治療嗜肺巴斯德桿菌陽性小鼠，給藥劑量為8.5～85 mg·kg－1·d－1［3，9-10］。本 研 究 以85 mg·kg－1·d－1為最低劑量，設(shè)置了梯度遞進的高濃度劑量組，進行安全性測試。結(jié)果顯示，本實驗條件下300 mg·kg－1·d－1以下劑量的恩諾沙星飲水給藥安全性良好，與前人在大鼠上進行的毒理實驗結(jié)論一致［14］。因為文獻［3］中25.5 mg·kg－1·d－1劑量治療曾出現(xiàn)過疑似復(fù)發(fā)，結(jié)合安全性試驗的結(jié)果，本研究進一步設(shè)置50 mg·kg－1·d－1、85 mg·kg－1·d－1和150 mg·kg－1·d－1三個劑量組，探尋合適的藥物凈化劑量。既往研究中往往以單只鼠為單位進行檢測評估療效，本研究選擇以籠為單位評估凈化效果，更接近實際飼養(yǎng)狀態(tài)，能準(zhǔn)確地反映恩諾沙星飲水給藥的效果。結(jié)果顯示，85 mg·kg－1·d－1以上劑量的恩諾沙星飲水給藥2周能有效清除感染小鼠體內(nèi)的嗜肺巴斯德桿菌，且在停藥6周后未出現(xiàn)復(fù)陽。綜合考慮，筆者認為每天85 mg·kg－1·d－1恩諾沙星是清除感染小鼠體內(nèi)嗜肺巴斯德桿菌的推薦劑量。

綜上所述，改良增菌法提高了嗜肺巴斯德桿菌檢測的靈敏度，可用于動物房的日常健康監(jiān)測。在飼養(yǎng)繁育量大的非生產(chǎn)種群內(nèi)，85 mg·kg－1·d－1以上劑量的恩諾沙星飲水給藥作為一種藥物凈化手段，可以成為除剖宮產(chǎn)和胚胎移植以外清除嗜肺巴斯德桿菌的應(yīng)急替代方案。