小鼠生活籠實驗引入適應(yīng)期的必要性研究

尹 媛,陸 璐,王 蘊,,楊 景,,付鶴玲

(南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實驗動物中心,南京210000)

隨著人們生活水平的提高，膳食習(xí)慣和生活方式發(fā)生改變，代謝異常疾病如糖尿病等的發(fā)病率正逐年增高。代謝異常疾病是影響現(xiàn)代社會人群健康和生活質(zhì)量的一類常見疾病，還會增加其他疾病如心血管疾病等的患病風(fēng)險［1］。目前，很多實驗動物代謝疾病模型尤其是小鼠或大鼠代謝異常模型發(fā)展迅速［2］，而對這類疾病動物模型的代謝或行為指標(biāo)的評價成為了研究方法中的重點。

各類代謝籠系統(tǒng)由于能實現(xiàn)無干擾的長時程連續(xù)動態(tài)觀察，獲得小鼠或大鼠的自發(fā)行為和實時代謝指標(biāo)，贏得了研究者的青睞［3］。常見的代謝籠系統(tǒng)都是1籠1只動物的設(shè)計，實驗時長至少24 h以上。在動物數(shù)量較多、實驗設(shè)計時間較長時，如何加快實驗進程，提高儀器和時間的利用率，同時又保證最終結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性是很多研究者關(guān)注的焦點。在本文研究者所在的實驗平臺，早期的數(shù)次大鼠生活籠實驗發(fā)現(xiàn)部分超重大鼠適應(yīng)期效果不佳。查閱已發(fā)表文獻時發(fā)現(xiàn)，很多研究者為提高動物適應(yīng)性，會將適應(yīng)期延長至3 d甚至1周［4-6］。為提高實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可比性，同時顧及動物模型的檢測時間點，本研究采用已發(fā)表文獻的方案，將生活籠實驗的適應(yīng)期強制延長至3 d即72 h。但適應(yīng)期的延長，增加了實驗的整體時長和儀器的周轉(zhuǎn)周期，對研究者的實驗時間點設(shè)計也帶來一些不便因素。為了優(yōu)化實驗日程，科學(xué)設(shè)計實驗進程，本研究進一步收集了1年內(nèi)31次實驗數(shù)據(jù)，對適應(yīng)期數(shù)據(jù)和適應(yīng)效果做了多方比較評價，以期為適應(yīng)期的必要性和時長選擇提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、儀器和耗材

1.1.1 實驗動物

8周齡以上SPF級成年小鼠，體質(zhì)量為15～55 g，雌雄未限定。統(tǒng)計中包含C57BL/6J小鼠、糖尿病等各類代謝相關(guān)疾病模型小鼠，均由南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實驗動物中心［SCXK（蘇）2016-0002］提供。動物飼養(yǎng)和代謝籠實驗均在南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實驗動物中心屏障設(shè)施［SYXK（蘇）2020-0022］內(nèi)開展，環(huán)境溫度為22～24℃，相對濕度40%～70%，晝夜節(jié)律為12 h，光照時間為上午7∶00至下午19∶00。

1.1.2 儀器

小動物代謝功能監(jiān)測系統(tǒng)購自德國TSE公司，型號為TSE PhenoMaster system。實驗中使用接近小鼠正常飼養(yǎng)籠的生活籠具，1次實驗可以同時開展12籠檢測。實驗中所用水瓶、食瓶是儀器配套的圓柱形懸掛式器具。每籠配有實時重力感應(yīng)探頭，用于飲水量、進食量和體質(zhì)量檢測。通過氣體探頭檢測氧氣（O2）和二氧化碳（CO2）含量變化，間接計算產(chǎn)熱率，以此反映動物代謝功能。

1.1.3 墊/飼料

飲水是與常規(guī)飼養(yǎng)相同的酸化水。飼料由各次實驗的實驗者自行攜帶。墊料使用玉米芯顆粒墊料。

1.2 實驗方法

1.2.1 儀器設(shè)置

選擇小鼠生活籠具，提前1 d將水瓶、食瓶和體質(zhì)量籃組裝好，掛在重力感應(yīng)探頭下豎直懸掛過夜。實驗開始前完成開機預(yù)熱和探頭校正等步驟，在籠盒底部均勻鋪灑一層玉米芯顆粒墊料。實驗開始時，將不同組別的動物間隔排布，1籠放置1只，裝填對應(yīng)的水和飼料，并保證水瓶和食瓶的開口朝向籠內(nèi)，以便于小鼠接觸。啟動軟件，設(shè)置72 h適應(yīng)期檢測。在72 h適應(yīng)期后，新建正式檢測文件，開始正式實驗。

1.2.2 動物適應(yīng)期檢查

在適應(yīng)期內(nèi)，每日2～3次定時檢查儀器和小鼠狀態(tài)，查看小鼠飲水、飲食和氣體數(shù)據(jù)等。如果小鼠在24 h后飲水或飲食數(shù)據(jù)仍然偏低，給予小鼠適當(dāng)誘導(dǎo)。飲水?dāng)?shù)據(jù)偏低時，輕輕提起水瓶，輕觸水瓶口滴下1～2滴水滴，誘導(dǎo)小鼠舔舐；效果不好時重復(fù)2～3次，并繼續(xù)觀察24 h。飲食數(shù)據(jù)偏低時，取出小顆飼料，放置在食瓶開口處，誘導(dǎo)小鼠啃食，并繼續(xù)觀察24 h。正式檢測開始后，減少檢查次數(shù)和檢查時間，盡量不干擾實驗環(huán)境。

1.2.3 數(shù)據(jù)收集和分析

收集了2016—2017年1年內(nèi)的31次小鼠生活籠實驗數(shù)據(jù)，全部采用72 h適應(yīng)期的實驗設(shè)計。剔除部分動物狀態(tài)極度惡化或中途死亡的數(shù)據(jù)后，共收集到356只小鼠的適應(yīng)期和正式檢測數(shù)據(jù)。以24 h為時間節(jié)點，整理匹配了每只小鼠的24 h、48 h、72 h和96 h時間點的各項數(shù)據(jù)。

1.3 觀測指標(biāo)

由于生活籠具接近但不完全等同于小鼠正常飼養(yǎng)籠，小鼠面對此新奇環(huán)境需要適應(yīng)，首日運動數(shù)據(jù)可能不同于后幾日數(shù)據(jù)，同時運動數(shù)據(jù)并不直接影響動物的生理數(shù)據(jù)和適應(yīng)情況，因此本次實驗中未納入運動數(shù)據(jù)。本研究選擇了飲水、進食、體質(zhì)量和產(chǎn)熱率數(shù)據(jù)來評估小鼠的適應(yīng)期效果，其中重點關(guān)注指標(biāo)為飲水和進食數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件包進行結(jié)果分析。飲水、進食、體質(zhì)量和產(chǎn)熱率數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布計量資料，采用±s表示。第1輪飲水、進食、體質(zhì)量和產(chǎn)熱率數(shù)據(jù)分析是對同一只小鼠不同時間點的數(shù)據(jù)進行比較，采用配對t檢驗；第2輪對進食適應(yīng)性存在差異的小鼠體質(zhì)量數(shù)據(jù)進行比較，采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 約12%的小鼠對生活籠具適應(yīng)性較差

在收集到的356只小鼠中，有80只小鼠（22.5%）在48 h后累計飲水量低于1 mL，在72 h適應(yīng)期結(jié)束時仍有59只小鼠（16.6%）累計飲水量低于1 mL。繼續(xù)觀察到正式實驗階段，59只小鼠中有42只小鼠（11.8%）在正式檢測第1天即72～96 h階段飲水量低于1 mL，即有近12%的動物直到正式檢測期或?qū)嶒灲Y(jié)束仍無法適應(yīng)生活籠飲水條件。在各項數(shù)據(jù)中，飲水對小鼠正常生存和生理狀態(tài)的影響最大，正常飼養(yǎng)狀態(tài)下小鼠日飲水量均值約為4 mL，連續(xù)72 h或96 h飲水量低于1 mL可能對小鼠生理狀態(tài)產(chǎn)生較大的負面影響，實際實驗中應(yīng)對這部分小鼠予以剔除。

2.2 適應(yīng)期第3天與正式檢測期的飲水、體質(zhì)量和產(chǎn)熱率數(shù)據(jù)無明顯差異

剔除72 h累計飲水量低于1 mL的小鼠，對剩余297只小鼠的各項數(shù)據(jù)進行整理分析。適應(yīng)期第2天即24～48 h時間段的數(shù)據(jù)與適應(yīng)期第3天即48～72 h時間段的數(shù)據(jù)相比，飲水量、體質(zhì)量和產(chǎn)熱率都存在明顯差異，說明適應(yīng)1 d不足以獲得良好的適應(yīng)效果（P＜0.01，表1）。適應(yīng)期第3天即48～72 h時間段的數(shù)據(jù)與正式檢測期第1天即72～96 h時間段的數(shù)據(jù)［飲水量（2.74±1.72）mL，進 食 量（3.67±1.48）g，體 質(zhì) 量（31.11±8.97）g，產(chǎn)熱率（78.62±19.28）J·kg-1·h-1］相比，飲水量、體質(zhì)量和產(chǎn)熱率均無明顯差異（P＞0.05），說明適應(yīng)2 d已經(jīng)獲得充足而良好的適應(yīng)效果，適應(yīng)期第3天的數(shù)據(jù)可以作為正式檢測數(shù)據(jù)來分析（表1）。

表1 小鼠適應(yīng)期第2天與適應(yīng)期第3天各指標(biāo)適應(yīng)效果評價Table1 Evaluation of theadaptation effect on each index on thesecond and the third daysof theacclimatization period(±s)

表1 小鼠適應(yīng)期第2天與適應(yīng)期第3天各指標(biāo)適應(yīng)效果評價Table1 Evaluation of theadaptation effect on each index on thesecond and the third daysof theacclimatization period(±s)

指標(biāo)飲水量/mL進食量/g體質(zhì)量/g產(chǎn)熱率/（J·kg-1·h-1）動物數(shù)/只297 297 297 297適應(yīng)期第2天（24～48 h）2.42±1.60 2.96±1.47 30.85±9.40 77.12±18.94適應(yīng)期第3天（48～72 h）2.68±1.56 3.32±1.35 31.12±9.15 78.96±19.74 t值3.61 5.68 2.66 4.10 P值＜0.001＜0.001 0.008＜0.010

2.3 進食量的適應(yīng)效果存在差異，與小鼠體質(zhì)量呈負相關(guān)

對納入分析的297只小鼠的進食量數(shù)據(jù)進行第1輪配對t檢驗，發(fā)現(xiàn)適應(yīng)第2天與適應(yīng)第3天的進食數(shù)據(jù)存在明顯差異（P＜0.01，表1），適應(yīng)第3天與正式檢測第1天的進食數(shù)據(jù)也存在明顯差異（P＜0.05），提示適應(yīng)72 h仍無法使小鼠適應(yīng)實驗籠中進食器具。對31次實驗的進食數(shù)據(jù)進行分次獨立分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有18次實驗中適應(yīng)期第3天與正式檢測第1天的進食數(shù)據(jù)無明顯差異（P＞0.05），提示取得了良好適應(yīng)效果；另外有13次實驗適應(yīng)期第3天的進食數(shù)據(jù)與正式檢測第1天存在明顯差異（P＜0.05），提示適應(yīng)3 d效果不佳。

為了分析進食數(shù)據(jù)出現(xiàn)適應(yīng)差異的原因，對小鼠的體質(zhì)量數(shù)據(jù)進行了獨立樣本t檢驗。第2輪分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，取得良好適應(yīng)效果的小鼠群體平均體質(zhì)量為（28.08±8.43）g，適應(yīng)效果不佳的小鼠群體平均體質(zhì)量為（34.22±10.00）g，兩個樣本群的體質(zhì)量和進食量都存在明顯差異，體質(zhì)量偏高的小鼠進食適應(yīng)效果較差（表2）。

表2 小鼠進食適應(yīng)性與體質(zhì)量相關(guān)分析Table 2 Correlation analysis of food intake and body weight of mice(±s)

表2 小鼠進食適應(yīng)性與體質(zhì)量相關(guān)分析Table 2 Correlation analysis of food intake and body weight of mice(±s)

指標(biāo)動物數(shù)/只體質(zhì)量/g進食量/g適應(yīng)良好179 28.08±8.43 3.90±1.58適應(yīng)不佳118 34.22±10.00 3.33±1.24 t值-5.51 3.51 P值-＜0.001 0.001

3 討論

本文研究使用德國TSE公司的PhenoMaster系統(tǒng)，該系統(tǒng)有兩類不同設(shè)計的籠具。其中生活籠具由于設(shè)計更接近小鼠的正常飼養(yǎng)籠具和正常飼養(yǎng)環(huán)境，獲得研究者更多偏好，也是本研究中使用的對象。生活籠具可以提供無干擾的連續(xù)動態(tài)觀測數(shù)據(jù)，包括小鼠自發(fā)的飲水、進食、行為、運動數(shù)據(jù)等，同時也可以采集小鼠的體質(zhì)量數(shù)據(jù)，并能持續(xù)精準(zhǔn)監(jiān)測密封籠具內(nèi)的溫度、O2、CO2含量的動態(tài)變化，提供小鼠呼吸交換率、產(chǎn)熱率等代謝指標(biāo)數(shù)據(jù)［4-7］。生活籠雖然趨于接近小鼠正常飼養(yǎng)籠，但實驗開端對于小鼠仍然是進入新環(huán)境的過程，同時為了獲得飲水、進食數(shù)據(jù)，生活籠配套的水瓶和食瓶也不同于常規(guī)的器具，需要小鼠學(xué)習(xí)適應(yīng)。而這個新奇環(huán)境探索和適應(yīng)的過程，可能會對小鼠的各種行為數(shù)據(jù)和代謝指標(biāo)產(chǎn)生一定影響，這段時間的數(shù)據(jù)或許并不能體現(xiàn)小鼠真實的行為代謝功能。為了避免環(huán)境變化和適應(yīng)學(xué)習(xí)過程對獲得數(shù)據(jù)的影響，該系統(tǒng)建議在正式實驗之前設(shè)置2 d適應(yīng)期。適應(yīng)期內(nèi)儀器各項設(shè)置和數(shù)據(jù)采集與正式實驗階段完全一致，這部分數(shù)據(jù)是否可以用于分析也是很多實驗者關(guān)心的問題［3］。由于關(guān)注方向不同，已發(fā)表文獻中代謝籠系統(tǒng)的實驗日程設(shè)計也存在很多差異：有少部分研究并未設(shè)置適應(yīng)期；大部分研究者雖然設(shè)置了適應(yīng)期，但適應(yīng)期的時間從2 h到7 d不等［8-10］；有些研究還額外增加了在實驗室環(huán)境的預(yù)適應(yīng)期［5］。

本研究通過分析了1年內(nèi)31次生活籠實驗數(shù)據(jù)，重點關(guān)注可能影響小鼠生存和代謝的飲水、進食指標(biāo)，同時也分析了反映小鼠代謝狀態(tài)的體質(zhì)量變化和產(chǎn)熱率數(shù)據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)適應(yīng)期是必要且非常關(guān)鍵的設(shè)計要點。適應(yīng)期的第2天與第3天的數(shù)據(jù)相比，飲水、進食、體質(zhì)量和產(chǎn)熱數(shù)據(jù)都存在顯著差異，小鼠在第2天仍然處于學(xué)習(xí)或探索階段，適應(yīng)期第2天的數(shù)據(jù)不能用于分析。在這個階段需要設(shè)置定時檢查，重點關(guān)注小鼠的適應(yīng)情況，并且對適應(yīng)效果較差的小鼠給予適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)教學(xué)，以期加快小鼠的適應(yīng)進程，獲得良好的適應(yīng)效果。適應(yīng)期第3天與正式檢測第1天的數(shù)據(jù)相比，飲水、體質(zhì)量和產(chǎn)熱數(shù)據(jù)都已經(jīng)達到穩(wěn)定，各項數(shù)據(jù)自身對照無明顯差異，說明適應(yīng)2 d取得了良好的適應(yīng)效果，第3天的數(shù)據(jù)實際可以作為正式實驗數(shù)據(jù)納入最終結(jié)果分析。與預(yù)期不同的是，進食數(shù)據(jù)在適應(yīng)期第3天仍未達到穩(wěn)定，第3天與正式檢測第1天的進食數(shù)據(jù)仍存在明顯差異。

有部分研究者發(fā)現(xiàn)動物的品系、體質(zhì)量，甚至周齡都會對代謝實驗產(chǎn)生影響［11］。本次納入分析的31次實驗中涵蓋了不同周齡和體質(zhì)量的小鼠，對這31次實驗數(shù)據(jù)分別進行分析的結(jié)果提示，進食適應(yīng)性與小鼠體質(zhì)量存在負相關(guān)。因此，推測部分體質(zhì)量超重的小鼠模型，如糖尿病模型鼠等，對進食器具適應(yīng)性可能較差，在日程允許的情況下可以考慮對這類實驗適當(dāng)延長適應(yīng)期。

綜上所述，在小鼠生活籠實驗中，適應(yīng)期是非常必要且關(guān)鍵的設(shè)計。為了獲得更加真實準(zhǔn)確的動物行為代謝數(shù)據(jù)，正式實驗開始前需設(shè)置至少2 d的適應(yīng)期。部分超重小鼠模型的進食適應(yīng)效果可能較差，如果重點關(guān)注進食數(shù)據(jù)，可能需要延長適應(yīng)期至3 d以上，或增加整個實驗時長，并在實驗結(jié)束后對數(shù)據(jù)進行分段分析，然后再決定納入正式分析的時間范圍。對適應(yīng)階段始終無法學(xué)會飲水進食、適應(yīng)效果一直較差的小鼠，要重點關(guān)注其生理狀態(tài)，必要時可以及時中止這類小鼠的實驗進程，以免動物狀態(tài)惡化甚至死亡，造成寶貴動物模型的損失。在實驗設(shè)計時也要考慮到這部分無法適應(yīng)的小鼠的比例，適當(dāng)增加組內(nèi)動物數(shù)量，以保證最終能獲得足夠分析的樣本數(shù)據(jù)。