龍眼成花與氧化損傷的關系探討

楊子琴　陳星星　張蕾　洪繼旺　陳業(yè)淵　李松剛

摘 要 以儲良龍眼為試材，通過分析低溫誘導、氧化脅迫、自然低溫+藥劑處理龍眼成化過程中氧化損傷各指標變化，研究龍眼成花和氧化脅迫之間的相關性。結果表明，氧化脅迫有利于龍眼成花。對頂芽和葉片活性氧、抗壞血酸和丙二醛（MDA）含量的檢測結果也表明，氧化脅迫誘導龍眼成花的同時，也導致了龍眼樹各組織活性氧的累積，且抗壞血酸抑制龍眼成花，MDA促進龍眼成花。因此認為活性氧與龍眼成花呈正相關。

關鍵詞 龍眼；成花；氧化損傷；活性氧；丙二醛；抗壞血酸

中圖分類號 S667.2 文獻標識碼 A

Relationship Between Longan Flower and Oxidative Damage

YANG Ziqin1， CHEN Xingxing2， ZHANG Lei1， HONG Jiwang1， CHEN Yeyuan1 *， LI Songgang1 *

1 Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China， Tropical Crops Genetic

Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， National Cultivar Improvement Center of

Tropical Fruit Tree， Danzhou，Hainan 571737， China

2 Henan Vocational College of Agriculture， Zhengzhou， Henan 451450， China

Abstract Low temperature induced， oxidative stress， natural low temperature combined with medicament spraying were used to study the correlation between longan-flowering and oxidative stress. Results indicated that oxidative stress induced longan flower， and led to the accumulation of reactive oxygen in parts of longan tree organizations， while ascorbic acid inhibited longan flower， MDA promoted longan flower. It confirmed there was a positive correlation between longan flower and active oxygen.

Key words Longan； Flower； Oxidative damage； Reactive oxygen species； MDA； Ascorbic acid

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.01.020

花芽分化標志著植物從營養(yǎng)生長向生殖生長的轉化。經驗發(fā)現(xiàn)，在植物與環(huán)境的互作中適當?shù)拿{迫往往促進開花，如適當?shù)臄喔透珊得{迫有利于柑桔成花[1]；低溫、氧化脅迫、甚至嫁接不親和都能誘導龍眼果樹的成花[2-4]；干旱脅迫誘導枇杷[5]的成花；高溫脅迫可誘導水仙花FT-like NFT1基因高量表達[6]；干旱脅迫造成了擬南芥中包括FLOWER LOCUS T（FT）基因在內的4 153個成花相關基因差異表達[7]。脅迫條件的發(fā)生同時伴隨著活性氧的累積，低溫可使荔枝花芽的H2O2含量升高，相對電導率增大，對冷敏性強的荔枝會造成氧化脅迫與活性氧產生/清除的平衡失調[8]，植物的防御系統(tǒng)在低溫逆境條件下會被破壞，導致活性氧大量積累，進而造成生物膜的嚴重損害[9]。外施H2O2和NO促進劑可以誘導蝴蝶蘭花器官中游離氧離子的濃度增加，進而增加氧化損傷和脂質過氧化及SOD、APX和非特異性過氧化物酶（POD）的活性，同時造成過氧化氫酶（CAT）和GR的活性降低[10]。

Lokhande[11]等發(fā)現(xiàn)H2O2是誘導擬南芥開花的一個因子。低溫脅迫可誘導荔枝混合花芽中H2O2和NO含量上升；H2O2和NO發(fā)生劑硝普鈉和百草枯處理同樣增加荔枝混合花芽中NO和H2O2含量，促進抽生純花芽。NO合酶抑制劑L-NNA和H2O2清除劑DMTU抑制荔枝成花，這間接證明H2O2和NO對荔枝成花有調控作用[12]。而有相反的報道認為，NO供體硝普鈉的應用導致擬南芥開花延遲，通過遺傳篩選發(fā)現(xiàn)擬南芥突變體具有高或低的內源性NO水平，從而延遲或提早開花；高濃度的NO抑制花分生組織中LFY基因的表達和CO基因對成花的促進作用；此外，增加了成花限制基因FLC的表達[13]。但是，這些脅迫信號分子與成花之間的作用機理目前尚不明確。對于龍眼而言，低溫及氧化脅迫究竟引發(fā)了怎樣的生理變化，這些信號物質是如何參與龍眼成花的誘導，從而開啟開花程序并關閉營養(yǎng)生長的程序還尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為8年生的石硤龍眼（Dimocarpus longan Loureiro），試材均常規(guī)管理。

1.2 方法

試驗材料包含3種處理方式龍眼果樹。人工低溫誘導采用8～10 ℃（12 h）/18～22 ℃（12 h），光照模擬自然光，在末次冬梢成熟后進行人工低溫誘導，脅迫后42 d側花原基形成。低溫誘導試驗系統(tǒng)以單株為實驗單元，設5次重復。每隔7 d采集樣品1次，采集的樣品包含葉片與頂芽。

氧化脅迫采用的龍眼樹在正造季節(jié)摘除花序，在新梢抽生3次后進行催花，催花藥劑為：土施氯酸鉀+氯化鉀誘導成花（W氯酸鉀 ∶ W氯化鉀=6 ∶ 4，

0.5 kg/m樹冠直徑），催花后28 d側花原基形成。氧化脅迫試驗以單株為試驗單元，設5次重復。每隔7 d采集樣品1次，采集的樣品包含葉片與頂芽。

藥劑處理：對冬季自然低溫龍眼樹末次冬梢成熟后20 d的梢芽噴施藥劑，以單株為試驗單元，設5次重復。每個藥劑處理每株樹噴施15個枝梢，每天采集樣品1次，直至側花原基形成，采集的樣品為頂芽。藥劑處理包含：脫落酸（ABA）100 mg/L；ABA阻斷劑，鎢酸鈉（Sodium tungstate dihydrate， STD）5 mmol/L；H2O2清除劑，二甲基硫脲（DMTU）1 g/L；H2O2發(fā)生劑，百草枯（MV）20 mg/L；NO發(fā)生劑，硝普鈉（SNP）0.1 mmol/L；NO合酶抑制劑，（L-NNA） 0.1 mmol/L；以噴施水為對照。噴施方式為枝梢噴施，噴施至滴水。

活性氧檢測采用DAB染色法：將需要檢測的組織浸泡于DAB染液中（1 mg/mL，pH5.8）28 ℃避光保存8 h；倒棄染液，80%乙醇沸浴2 min，重復2次；用無水乙醇沸浴至顏色不變；倒棄液體，再浸泡于無水乙醇中于4 ℃保持4 h后觀測并拍照，活性氧含量越高則顏色越深。

抗壞血酸含量采用高俊鳳的方法[14]測定。

MDA含量采用硫代巴比妥酸法[15]測定。

抗壞血酸、MDA含量均以樣品鮮重（FW）為基數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS16.0軟件處理試驗數(shù)據(jù)和方差分析。

2 結果與分析

2.1 氧化脅迫對成花過程中龍眼各部分活性氧分布的影響

DAB染色結果（圖1）顯示：氧化脅迫導致龍眼樹體各組織出現(xiàn)不同程度的活性氧累積；隨著龍眼成花進程的推進，活性氧累積也在加重。尤以頂芽、老莖髓部及韌皮部積累活性氧最多，嫩莖積累活性氧次之。氧化脅迫對葉片活性氧累積影響不大。

2.2 龍眼成花與抗壞血酸含量的關系

抗壞血酸在植物體遭遇逆境時具有重要的抗氧化作用，而逆境中抗壞血酸含量越高，植物體逆境傷害就會越輕。在整個花芽形成過程中，龍眼葉片的抗壞血酸含量（W抗壞血酸）遠低于頂芽（圖2）。在枝梢成熟后0 d，葉片抗壞血酸含量為2.83 mg/g，直至側花原基形成之前都在此水平上下波動；至側花原基形成時才上升至4.71 mg/g，并在隨后的1周內迅速下降。而頂芽中的抗壞血酸含量在枝梢剛成熟時雖僅有4.92 mg/g，但隨后7 d內上升至8.42 mg/g，并在枝梢成熟14 d時上升至最高峰（8.93 mg/g）；在枝梢成熟后28 d頂芽抗壞血酸含量降到低谷（5.20 mg/g），在側花原基形成時頂芽中抗壞血酸含量再次上升至峰值（8.38 mg/g）。

氧化脅迫龍眼頂芽的抗壞血酸含量也遠高于葉片（圖3）。催花對葉片中抗壞血酸含量影響不大，催花之初為2.24 mg/g，隨后僅有小幅上升，并在小范圍內波動（2.48～3.16 mg/g）；頂芽中抗壞血酸含量在催花之初較高，達到9.91 mg/g，而在催花后下降，并在7 d中跌至低谷（6.07 mg/g），隨后又緩慢上升，側花原基形成時達到7.02 mg/g。

2.3 龍眼成花與MDA含量的關系

MDA是細胞膜脂過氧化作用的產物之一；MDA產生數(shù)量的多少，代表細胞膜脂過氧化的程度，可間接反映植物組織受傷的程度。除了個別時段（枝梢成熟后14 d）以外，低溫誘導龍眼枝梢成熟后的葉片MDA含量CMDA均高于頂芽（圖4）。在枝梢成熟后0 d，葉片中MDA含量為16.83 nmol/g，頂芽中MDA含量為14.45 nmol/g；枝梢成熟后7 d，葉片中MDA含量出現(xiàn)小幅下降（12.67 nmol/g），并維持該水平直至枝梢成熟后42 d（此時為側花原基形成時），MDA含量上升至36.73 nmol/g，隨后下降到枝梢成熟時水平；頂芽中MDA含量變化除枝梢成熟后14 d時出現(xiàn)1個高峰（26.80 nmol/g）外，在整個花芽形成階段均徘徊在10.44～16.10 nmol/g。

在催花之后，龍眼葉片和頂芽的MDA含量均出現(xiàn)了2次高峰（圖5）。其中，葉片的高峰分別出現(xiàn)在催花后0 d（21.35 nmol/g）和21 d（18.98 nmol/g），其他階段均在14.22～17.12 nmol/g內波動；頂芽的高峰分別出現(xiàn)在催花后14 d（25.06 nmol/g）和28 d（21.98 nmol/g），其他階段均在14.02～16.53 nmol/g范圍內。在整個氧化脅迫成花過程中，除了頂芽出現(xiàn)2次高峰的時間外，其余時間均以葉片的MDA含量最高。

為了弄清楚活性氧及其上下游產物對龍眼成花的作用，本研究采用了信號清除劑及阻斷劑處理，以期探明活性氧損傷在龍眼成花中的確切作用。這些信號類藥劑對頂芽MDA含量的影響差別很大（圖6）：在噴藥1 d后，DMTU和SNP處理的MDA含量上升最多，分別達到62.88和32.74 nmol/g，其它各處理略高于對照水平（14.97 nmol/g）；噴藥3 d后，又回復到處理之前的水平；噴藥5 d后，仍然以SNP處理的MDA含量最高，達到34.54 nmol/g，DMTU、MV、L-NNA的MDA含量也略高于對照水平，而STD和ABA處理卻導致了頂芽MDA含量低于對照水平；噴藥7 d后，除了STD和ABA處理外其它各處理均達到了前所未有的MDA含量水平，STD和ABA處理分別為16.23和18.03 nmol/g，SNP、DMTU、MV和L-NNA的MDA含量依次為47.04、70.58、40.93、46.62 nmol/g。

3 討論與結論

3.1 活性氧與龍眼成花的關系

活性氧信號在調節(jié)植物發(fā)育和應對脅迫反應方面具有重要作用，但關于活性氧如何調節(jié)花芽分化的報道很少。作為比較穩(wěn)定的一種活性氧信號分子，H2O2可調節(jié)基因的表達，進而調控許多生理過程，包括產生系統(tǒng)抗性、誘導氣孔關閉、誘發(fā)過敏性反應等[16]。Lokhande等[11]發(fā)現(xiàn)，擬南芥開花前的抗壞血酸過氧化物酶活性越高則開花越遲，氧化脅迫越強開花早，即抗壞血酸含量越低，開花越早，抗壞血酸與開花呈負相關，這與本試驗結論相同。對于低溫脅迫誘導龍眼成花，葉片中抗壞血酸在側花原基形成時含量上升的原因可能是葉片在此階段已不需要過多的活性氧來促進花芽形成，而過多的活性氧在側花原基形成之后阻礙了花序的抽生。頂芽是龍眼花芽分化的發(fā)生部位，在遭遇冷脅迫之后，應激性的抗壞血酸含量上升是緩沖頂芽對氧化損傷的反應。而后頂芽啟動花芽分化則需要活性氧的累積，抗壞血酸出現(xiàn)下降，并在側花原基形成之后繼續(xù)起到抑制頂芽氧化傷害的作用。氧化脅迫較低溫脅迫所產生的氧化損傷更為直接，作用部位直接在頂芽組織上，對葉片的影響不大，這與活性氧在龍眼各組織中的分布互相印證。頂芽中抗壞血酸含量的下降預示著氧化脅迫所產生的活性氧將更多的累積于頂芽而無抑制因素的參與。這使得氧化脅迫誘導成花周期較低溫誘導更短。這與低溫誘導龍眼在末次冬梢成熟后42 d形成側花原基，而氧化脅迫龍眼在催花之后28 d形成側花原基互為佐證。

3.2 MDA、抗壞血酸與龍眼成花的關系

MDA與抗壞血酸所表示的氧化損傷意義恰恰相反，如葉片抗壞血酸含量低于頂芽，葉片MDA含量高于頂芽。低溫脅迫初期頂芽MDA曾一度高于葉片，可能是啟動側花原基的標志，而后期葉片MDA在側花原基形成前后的爆發(fā)可能是因為頂芽活性氧的下降，使得葉片活性氧向頂芽極性運輸所致。NO是動物細胞重要的第二信使，但更多的試驗表明，它同時也是植物細胞中一種重要的信號分子，在超氧陰離子的配合下信號分子NO可以轉變成具有毒性的亞硝酸根陰離子[17-19]，NO作為信號分子與活性氧協(xié)同作用啟動植物的應逆反應[20]。Zafra等[21]發(fā)現(xiàn)油橄欖成花過程有賴于H2O2和NO的參與。本試驗中NO促進劑噴施導致龍眼頂芽MDA含量升高，對龍眼頂芽的損傷較大，但卻促進了龍眼早花的出現(xiàn)，這與Zafra的結論相同。

綜上所述，氧化損傷與龍眼成花呈正相關，抗壞血酸抑制龍眼成花，而MDA促進龍眼成花。

參考文獻

[1] 劉春榮. 溫州蜜柑斷根和留葉對成花的效應[J]. 福建果樹， 1991， 2（1）： 6.

[2] 黃旭明， 陸潔梅， 王惠聰. 氯酸鹽在龍眼生產上的應用和研究現(xiàn)狀[J]. 中國南方果樹， 2004， 31（1）： 62-64.

[3] 張海嵐， 吳定堯， 林曉東. 氧化劑催花可使龍眼周年開花著果[J]. 中國南方果樹， 2002， 31（1）： 26-27.

[4] Yamada M， Takeno K. Stress and salicylic acid induce the expression of PnFT2 in the regulation of the stress-induced flowering of Pharbitis nil[J]. Journal of Plant Physiology， 2014， 171（3-4）： 205-212.

[5] 陳貴虎， 張云鵬， 蔣建國， 等. 枇杷幼旺樹促花技術研究[J]. 西南園藝， 2004， 32（3）： 40-42.

[6] Li X F， Jia L Y， Xu J， et al. FT-like NFT1 gene may play a role in flower transition induced by heat accumulation in Narcissus tazetta var. chinensis[J]. Plant & Cell Physiology， 2013， 54（2）： 270-281.

[7] Su Z， Ma X， Guo H， et al. Flower development under drought stress： morphological and transcriptomic analyses reveal acute responses and long-term acclimation in Arabidopsis[J]. The Plant Cell， 2013， 25（10）： 3 785-3 807.

[8] 魯 勇， 吳楚彬， 陳厚彬， 等. 不同發(fā)育時期的荔枝花芽冷敏感性比較[J]. 果樹學報， 2013， 30（1）： 115-120.

[9] Li C Y， Weiss D， Goldschmidt E E. Girdling affects carbohydrate-related gene expression in leaves， bark and roots of alternate-bearing citrus trees[J]. Annals of Botany， 2003， 92（1）： 137-143.

[10] Tewari R K， Kumar P， Kim S， et al. Nitric oxide retards xanthine oxidase-mediated superoxide anion generation in Phalaenopsis flower： an implication of NO in the senescence and oxidative stress regulation[J]. Plant Cell Reports， 2009， 28（2）： 267-279.

[11] Lokhande S D， Ogawa K， Tanaka A， et al. Effect of temperature on ascorbate peroxidase activity and flowering of Arabidopsis thaliana ecotypes under different light conditions[J]. Journal of Plant Physiology， 2003， 160（1）： 57-64.

[12] Zhou B， Li N， Zhang Z， et al. Hydrogen peroxide and nitric oxide promote reproductive growth in Litchi chinensis[J]. Biologia Plantarum， 56（2）： 321-329.

[13] He Y， Tang R H， Hao Y， et al. Nitric oxide represses the Arabidopsis floral transition[J]. Science， 2004， 305： 1 968-1 971.

[14] 高俊鳳. 植物生理學實驗技術[M]. 北京： 世界圖書出版公司， 2000： 162-163.

[15] 郝建軍， 康宗利， 于 洋. 植物生理學實驗技術[M]. 北京： 化學工業(yè)出版社， 2006： 159-160.

[16] Vanderauwera S， Zimmermann P， Rombauts S， et al. Genome-wide analysis of hydrogen peroxide-regulated gene expression in Arabidopsis reveals a high light-induced transcriptional cluster involved in anthocyanin biosynthesis[J]. Plant Physiology， 2005， 139（2）： 806-821.

[17] Beligni M V， Lamattina L. Nitric oxide： a non-traditional regulator of plant growth[J]. Trends in Plant Science， 2001， 6（11）： 508-509.

[18] Zhang L， Si J， Zeng F， et al. Molecular cloning and characterization of a ferritin gene upregulated by cold stress in Chorispora bungeana[J]. Biological Trace Element Research， 2009， 128（3）： 269-283.

[19] 吳麗元， 黨西強， 何小解，等. 兒茶素清除超氧陰離子對Ang II誘導的內皮祖細胞NO與eNOS表達及凋亡影響[J]. 中國當代兒科雜志， 2009， 11（6）： 476-480.

[20] Del Rio D， Serafini M， Pellegrini N. Selected methodologies to assess oxidative/antioxidant status in vivo： a critical review[J]. Nutrition， Metabolism， and Cardiovascular Diseases， 2002， 12（6）： 343-351.

[21] Zafra A， Rodríguez-García M I， Alché J D. Cellular localization of ROS and NO in olive reproductive tissues during flower development[J]. BMC Plant Biology， 2010， 10： 36.