木薯AGPase及其同工酶活性與淀粉積累的關(guān)系

陳會鮮　羅興錄　 曹升　郭雅靜　王戰(zhàn)　羅璇　單忠英

摘 要 采用高淀粉木薯品種輻選01和低淀粉木薯品種華南124作為試驗材料，研究木薯塊根的腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）及其同工酶活性與淀粉積累的關(guān)系。通過對比研究可知：木薯塊根的AGPase對淀粉積累可能有著至關(guān)重要的促進作用，并且木薯塊根的AGPase具有四種同工酶，分別為AGP a、AGP b、AGP c、AGPd，其中AGP a、AGP b、AGP c可能是決定AGPase活性和影響塊根淀粉積累的關(guān)鍵同工酶。

關(guān)鍵詞 木薯；腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶；同工酶；淀粉積累

中文分類號 S533 文獻標識碼 A

The Research of the Relationship Between Starch Accumulation

and the Activity of Cassava's ADP-glucose

Pyrophosphorylase and Its Isozymes

CHEN Huixian1，3， LUO Xinglu1，2 *， CAO Sheng1，3， GUO Yajing1

WANG Zhan1， LUO Xuan1， SHAN Zhongying1

1 Agricultural College， Guangxi University， Nanning， Guangxi 530005， China

2 State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agricultural Biological， Nanning， Guangxi 530004， China

3 Academy of Agricultural Sciences， Yulin， Guangxi 537000， China

Abstract The high starch content cassava variety-Fuxuan01 and the low starch content cassava variety-SC124 were used as experimental material ，to research the research of the relationship between starch accumulation and the activity of cassava's ADP- glucose pyrophosphorylase and its isozymes .Through the comparative study ，it could come to a conclusion： AGPase of cassava's tuberous root might have an important role in promoting starch accumulation. AGPase might have four varieties of isozymes， they were AGP a、AGP b、AGP c、AGP d. among them， AGP a、AGP b、AGPc this three varieties of isozymes might be the key isozymes to determine the activity of AGPase， and might be the key isozymes to affect starch accumulation.

Key words Cassava； ADP-glucose pyrophosphorylase； Isozymes； Starch accumulation

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.01.016

木薯塊根富含淀粉，素有“地下糧倉”的美稱，是世界三大薯類之一。木薯是優(yōu)質(zhì)淀粉作物，又是重要的生物能源作物。廣西是中國生產(chǎn)木薯的主要?。▍^(qū)），種植面積占全國60%，產(chǎn)量占70%。木薯生產(chǎn)是廣西農(nóng)業(yè)特色產(chǎn)業(yè)之一，但是目前廣西木薯生產(chǎn)普遍存在產(chǎn)量低的問題，因此如何提高木薯塊根淀粉產(chǎn)量是木薯栽培和品種選育的主要目標之一。Dong等[1]通過研究認為，淀粉的合成極有可能是生成的一磷酸葡萄糖（G-1-P）透過造粉體的雙成膜進入到造粉體后被AGPase催化生成腺苷二磷酸葡萄糖（ADPG）。Preiss等[2]認為，AGPase是淀粉合成的限速酶。由此可見，AGPase是淀粉合成的關(guān)鍵酶。目前對AGPase及其同工酶的研究主要集中在小麥上，而對木薯的AGPase及其同工酶的研究報道較少，目前只見關(guān)于木薯AGPase酶活性及其同工酶位點檢測的報道。研究木薯塊根AGPase及其同工酶活性對淀粉積累的作用開辟一條木薯高產(chǎn)研究的新途徑，為高淀粉木薯品種的選育和高產(chǎn)高粉栽培的生理調(diào)控提供理論和技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用木薯為高淀粉木薯品種輻選01和低淀粉品種華南124。輻選01是用華南124的種莖經(jīng)過輻射而成的品種，2品種間具有較近的親緣關(guān)系。輻選01除了塊根淀粉含量比華南124高外，其他農(nóng)藝性狀基本與華南124相似。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計 試驗分2個處理，每個品種即為1個處理，每個處理重復(fù)3次，每個試驗小區(qū)面積為99 m2，每個小區(qū)按照隨機區(qū)組排列。試驗材料種植于廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院科研基地，種植規(guī)格為90 cm×80 cm，田間管理采用常規(guī)栽培方法。

本試驗樣品分別于塊根形成期、塊根膨大中期、 塊根膨大后期和塊根成熟期，四個塊根生長的關(guān)鍵時期進行采樣。每個小區(qū)選取3株健壯并能代表相應(yīng)時期生長狀況的木薯植株作為樣株，并采集能體現(xiàn)當株塊根生長情況的塊根作為樣品。用于測定酶活性的樣品，在田間采摘后立即用液氮速凍，然后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱，保存?zhèn)溆?。而用于測定淀粉含量的樣品，則在采集鮮樣后用105 ℃殺青30 min左右，然后75 ℃烘干至恒重，最后粉碎過100目篩。

1.2.2 測定方法

（1）淀粉含量的測定。參照上海植物生理學(xué)會主編的《植物生理學(xué)實驗手冊》中蒽酮比色法[3]測定淀粉含量。

（2）AGPase活性的測定。參照Douglas[4]的方法測定AGPase的活性。

（3）AGPase同工酶的測定。分離AGPase的同工酶參照Davis[5]的方法，AGPase同工酶的活性染色參照Weaver等[6]的方法。電泳結(jié)束后所得的蛋白膠用單反相機拍照，最后用Quantity One Version 4.6.2凝膠分析軟件分析各個條帶的相對光密度（Volume），其大小代表酶活性的大小，單位為INT×mm2。

1.3 數(shù)據(jù)處理 試驗所有數(shù)據(jù)用Excel 2003軟件進行數(shù)據(jù)處理、分析和作圖，用Word2003制表，用SPSS 17.0進行相關(guān)性分析和差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時期木薯塊根淀粉積累量的變化

從塊根形成期到塊根成熟期，華南124和輻選01的淀粉積累量均呈現(xiàn)著逐漸增加的趨勢，直到塊根成熟期達到最大值，其最大值分別為75.55%和86.79%。比較2個木薯品種的淀粉積累量，發(fā)現(xiàn)在這4個生長期內(nèi)輻選01的淀粉積累量較華南124的有所提高，分別提高了3.70%、13.90%、16.66%、14.88%，其中在塊根膨大中期、塊根膨大后期和塊根成熟期差異達到極顯著水平（圖1）。這說明輻選01合成淀粉的能力較強于華南124的。

2.2 不同時期木薯塊根淀粉積累速率的變化

華南124和輻選01的淀粉積累速率變化都呈一個“慢-快-慢”的過程，其中在塊根膨大后期達到最大值，淀粉積累速率分別為每天6.22%和7.22%。在前3個生育期里，輻選01的淀粉積累速率都大于華南124的，分別提高了4.38%、25.80%、15.95%，其中在塊根膨大中期差異達到顯著水平（圖2）。這也進一步說明輻選01積累淀粉的能力強于華南124的。

2.3 不同時期木薯塊根AGPase的活性變化

華南124和輻選01品種塊根AGPase活性的變化都呈現(xiàn)“倒U型”變化，在塊根膨大后期達到最大值，其活性分別為1.99 μmol/（g FW·min）和2.36 μmol/（g FW·min）。比較2個木薯品種的AGPase活性，發(fā)現(xiàn)在塊根形成期、塊根膨大后期、塊根成熟期這3個時期里輻選01的AGPase活性較華南124的有所提高，分別提高了13.33%、18.59%、80.00%，其中在塊根膨大后期差異達到極顯著水平，在塊根成熟期差異達到顯著水平（圖3）。

2.4 不同時期木薯塊根AGPase的同工酶活性變化

由圖4可知，木薯塊根的AGPase至少有4種類型的同工酶，暫時命名AGPa、AGPb、AGPc、AGPd。這4種類型的同工酶都存在于這2種木薯品種的每個時期，但它們的活性大小在品種間和各個時期里存在較大差異。

2.4.1 不同時期木薯塊根AGPa的活性變化 輻選01的AGPa活性在4個生育期里的變化呈先增大后減小的變化趨勢，在塊根膨大后期達到最大值，其活性為35 372.58 INT×mm2。在塊根形成期以后，華南124的AGPa活性變化也呈先增大后減小的變化趨勢，且在塊根膨大后期也達到最大值，其活性為30 793.09 INT×mm2。除了塊根形成期，其他3個時期里輻選01的AGPa活性都比華南124的大，分別提高了22.72%、14.87%、0.35%，其中在塊根膨大中期和塊根膨大后期差異達到極顯著水平（圖5）。

2.4.2 不同時期木薯塊根AGPb的活性變化 2個木薯品種塊根的AGPb活性變化規(guī)律與AGPa的活性變化規(guī)律大致相同。在后3個時期里，華南124和輻選01的AGPb活性也都在塊根膨大后期達到最大值，其活性大小分別為50 949.22 INT×mm2和67 793.72 INT×mm2，并且輻選01的AGPb活性都比華南124的有所提高，分別提高了26.37%、33.06%、2.46%，其中在塊根膨大中期和塊根膨大后期差異達到極顯著水平（圖6）。

2.4.3 不同時期木薯塊根AGPc的活性變化 2個木薯品種的AGPc活性變化規(guī)律也與AGPa的活性變化規(guī)律大致相同。在塊根膨大中期、塊根膨大后期和塊根成熟期這3個時期里，華南124和輻選01的AGPb活性也都在塊根膨大后期達到最大值，其活性大小分別為52 600.84 INT×mm2和62 558.53 INT×mm2，并且輻選01的AGPc活性都比華南124的高，分別提高了90.59%、18.93%、24.30%，且差異都達到極顯著水平（圖7）。

2.4.4 不同時期木薯塊根AGPd的活性變化 2個木薯品種的塊根AGPd活性變化大致呈U型的變化趨勢，且在塊根形成期都達到最大，其活性大小分別為15 592.83 INT×mm2和9 373.87 INT×mm2。華南124的AGPd活性在塊根膨大后期達到最小，活性大小為848.92 INT×mm2。輻選01的AGPd活性在塊根膨大中期達到最小，活性大小為221.03 INT×mm2。除了塊根膨大后期以外的3個時期內(nèi)，華南124的AGPd活性都大于輻選01的，且差異達到極顯著水平。由此可見，AGPd的變化趨勢與其他3種同工酶的變化趨勢截然不同（圖8）。

2.5 不同木薯品種塊根AGPase活性與淀粉積累的相關(guān)性分析

無論是華南124還是輻選01，AGPase的活性與淀粉積累量都呈不顯著正相關(guān)，與淀粉積累速率呈極顯著正相關(guān)。這說明木薯塊根的AGPase可能對淀粉的積累有著重要的促進作用（表1）。

2.6 不同木薯品種塊根AGPase活性與其同工酶活性的相關(guān)性分析

在AGPa、AGPb、AGPc這3種同工酶的活性與AGPase活性所呈的相關(guān)性分析中，輻選01都呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)，而華南124卻呈不顯著負相關(guān)或是不顯著正相關(guān)。雖然2種木薯品種呈現(xiàn)出的結(jié)果有所差異，但是通過比較顯著性和相關(guān)系數(shù)大小發(fā)現(xiàn)，AGPa、AGPb、AGPc的活性可能與AGPase活性呈正相關(guān)，其中在高淀粉木薯品種輻選01中表現(xiàn)得更為明顯。無論是華南124還是輻選01，AGPd的活性都與AGPase的活性呈顯著負相關(guān)（表2）。這說明AGPa、AGPb、AGPc可能是決定AGPase活性的3種關(guān)鍵同工酶。

2.7 不同木薯品種塊根AGPase的同工酶活性與淀粉積累的相關(guān)性分析

木薯塊根AGPa、AGPb、AGPc的活性與淀粉積累總量的相關(guān)性在2個品種中的表現(xiàn)不同，在華南124中表現(xiàn)為不同顯著性程度的負相關(guān)，而在輻選01中表現(xiàn)為顯著或極顯著正相關(guān)。2個木薯品種的AGPa、AGPb、AGPc的活性與淀粉積累速率呈正相關(guān)，且輻選01相關(guān)性達極顯著水平。無論是華南124還是輻選01，AGPd的活性與淀粉積累速率呈負相關(guān)，與淀粉積累總量呈極顯著負相關(guān)。說明AGPa、AGPb、AGPc這3種同工酶可能對提高淀粉積累速率有積極的促進作用。

3 討論

AGPase催化G-1-P和ATP反應(yīng)形成的ADPG直接作為淀粉合成的前體物質(zhì)，因此AGPase是木薯淀粉積累的關(guān)鍵酶。張軍杰等[7]研究玉米發(fā)現(xiàn)，AGPase的活性與直鏈淀粉含量、支鏈淀粉含量和總淀粉積累速率均呈極顯著正相關(guān)。池敏青[8]研究木薯的淀粉積累特性時發(fā)現(xiàn)，AGPase活性與木薯塊根淀粉積累速率呈正相關(guān)關(guān)系，但不顯著。姜東等人[9]通過研究高產(chǎn)小麥強勢和弱勢子粒淀粉合成相關(guān)酶活性的變化，結(jié)果表明AGPase的活性與淀粉積累速率成正相關(guān)關(guān)系。本試驗的研究結(jié)果表明，AGPase的活性可能對淀粉積累有重要的促進作用。這與前人的研究結(jié)果相似。

岳向文等[10]通過研究發(fā)現(xiàn)，小麥的AGPase有5種同工酶，且每種同工酶對小麥淀粉積累的作用不同，其中AGPa、AGPb、AGPc同工酶出現(xiàn)的頻率較大。趙法茂等[11]研究出AGPase有6種同工酶，且各種同工酶對AGPase活性的影響是同步的。岳向文等[10]通過研究小麥的AGPase同工酶，發(fā)現(xiàn)AGPa、AGPb、AGPc、AGPd是決定小麥淀粉積累量的關(guān)鍵酶。本研究發(fā)現(xiàn)木薯的AGPase具有4種同工酶類型，其中AGPa、AGPb、AGPc可能是決定木薯塊根AGPase活性的關(guān)鍵酶。這與前人的的研究有相同之處，也有不同之處。相同之處在于都驗證了各種AGPase的同工酶普遍存在各種植物中，且對AGPase的活性積累影響是同步；不同之處在于AGPase的同工酶的類型不同，這可能是因植物的種類不一樣決定的。閔義等[12]研究幾種木薯的AGPase的同工酶，發(fā)現(xiàn)Agr7含有的AGPe是決定木薯塊根淀粉積累量的關(guān)鍵酶，該結(jié)論與前人的研究有很大差別，可能是試驗材料不同所致；他還發(fā)現(xiàn)華南124的塊根AGPase具有4種同工酶，本試驗也得出華南124的塊根AGPase至少有4種同工酶，兩者結(jié)果相同。

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