茶樹P5CS基因克隆及其在滲透和高鹽脅迫下的表達(dá)分析

王麗珊　林清凡　陳蘭平　池福鈴　郭春芳　張積森

摘 要 △1-吡咯琳-5-羧酸合成酶是植物脯氨酸合成過程中的關(guān)鍵酶。應(yīng)用同源克隆方法獲得茶樹P5CS，序列長為1 316 bp，編碼323個氨基酸；其編碼蛋白分子量為34.7 ku，pI為7.62；N端有1個氨基酸激酶超家族[Amino Acid Kinases（AAK） superfamily]功能區(qū)，C端有1個醛脫氫酶超家族[Aldehyde Dehydrogenas（ALDH）superfamily]功能區(qū)，預(yù)測為親水性跨膜蛋白；對18個物種的P5CS進(jìn)行聚類分析，結(jié)果生物學(xué)分類及進(jìn)化關(guān)系吻合。并與美味獼猴桃高度同源，相似度達(dá)89%。應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR分析表明，該基因轉(zhuǎn)錄本在水分脅迫24 h內(nèi)升至對照組水平的2.6倍，而高鹽脅迫48 h后才升至9.9倍的最高值；水分脅迫應(yīng)答速度快，但相對表達(dá)量較高鹽脅迫低。由此推測該基因被誘導(dǎo)參與了滲透脅迫應(yīng)答響應(yīng)，并且對滲透脅迫中的旱害脫水更為敏感。

關(guān)鍵詞 茶樹；P5CS；實(shí)時熒光定量PCR；水分脅迫；高鹽脅迫

中圖分類號 S571.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Cloning and Expression Analysis of P5CS Gene

under Drought and Salinity Stress

in Camellia sinensis

WANG Lishan1，2，3， LIN Qingfan1，2，3， CHEN Lanping1，2，3， CHI Fuling1，2，3

GUO Chunfang4 *， ZHANG Jisen1，2，3

1 College of Life Sciences， Fujian Normal University， Fuzhou， Fujian 350108， China

2 Key Lab for Sugarcane Genetic Improvement， Ministry of Agriculture， Fuzhou， Fujian 350108， China

3 Genomics and Biotechnology Research Center， Fujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou， Fujian 350002， China

4 Fujian Institute of Education， Fuzhou， Fujian 350025， China

Abstract △1-pyrroline-5-carboxylate synthetase（P5CS）is considered to be the key enzyme for proline biosynthesis in plant. In the study，a 1 316 bp-length cDNA fragment of P5CS was cloned from Camellia sinensis cv. Tieguanyin through homology-based cloning strategy. The cDNA encodes a polypeptide with 323 amino acids containing an amino acid kinases domain in N terminal and an aldehyde dehydrogenase motif in C-terminus. Based on the conserved domain search analysis in NCBI，the deducted polypeptide was predicted to be a hydrophilic transmembrane protein. The BLAST results showed that the fragment shared 89% similarity with Actinidia deliciosa（ADU92286）. Phylogenetic analysis of P5CS from different species showed an evolutional consistency between the gene and higher plant. Moreover，the expression patterns of CsP5CS under the drought and salt stress were detected by real-time quantitative PCR. The CsP5CS gene expression level of the plant with 24 h PEG stress and 48 h high-salt stress was 2.6 and 9.9 times，respectively，as the control. The significant up-regulation expression under both PEG and salt stress treatments suggested that CsP5CS involved in the response to osmotic stress and might function to dehydration resistance by relegating the accumulation of proline. Meanwhile，CsP5CS is more sensitive to drought stress than salinity stress in the response to osmotic stress.

Key words Camellia sinensis； P5CS； Real-time quantitative PCR； Drought stress； Salinity stress

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.01.012

土壤水分是茶樹生理與生態(tài)需水的主要來源，旱害給茶樹生長、茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)帶來較大影響。脯氨酸是植物面對水分和高鹽脅迫積累的最為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以增強(qiáng)自身對滲透脅迫的抵抗能力[1-3]。一般認(rèn)為脯氨酸的生物合成途徑有2種，即谷氨酸途徑和鳥氨酸途徑[4-5]。其中谷氨酸途徑中的關(guān)鍵酶是△1-吡咯琳-5-羧酸合成酶（△1-pyrroline-5-carboxylate synthetase，P5CS：EC2.7.2.11/1.2.2.41）[6-13]。近年有關(guān)茶樹抗旱性與葉片組織中脯氨酸含量變化的動態(tài)關(guān)系其研究結(jié)果不盡相同。王守生[14]、吳伯千[15]、Handique等[16]認(rèn)為脯氨酸的積累與茶樹滲透調(diào)節(jié)呈正相關(guān)；伍炳華[17]、李華均[18]、李金昌[19]認(rèn)為脯氨酸的積累與茶樹滲透調(diào)節(jié)無明確關(guān)系；潘根生等[20-21]認(rèn)為茶樹的脯氨酸積累與茶樹滲透調(diào)節(jié)無明確關(guān)系，但與茶樹的品種有關(guān)。

目前，對茶樹抗旱的分子機(jī)制研究尚處于初期階段。為了探討茶樹水分、高鹽脅迫下脯氨酸代謝關(guān)鍵基因P5CS的分子調(diào)控機(jī)制，本研究選用茶樹鐵觀音為研究材料，運(yùn)用同源克隆技術(shù)克隆茶樹鐵觀音中谷氨酸途徑中的關(guān)鍵酶基因P5CS；利用生物信息學(xué)方法對基因的功能進(jìn)行預(yù)測分析；采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對水分脅迫和高鹽脅迫下該基因的表達(dá)特征進(jìn)行分析，以期為提高茶樹抗旱基因工程奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供試材料為福建安溪1年生的鐵觀音（Camellia sinensis cv. Tie-guanyin）茶樹扦插苗。

1.1.2 試劑 Prime ScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit、Taq DNA聚合酶、pMD19-T Vector Kit、SYBR染料、Dnase I購自TaKaRa公司，E.coli DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存，引物合成及測序由上海生工生物工程公司完成，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 選擇生長情況、大小基本一致的1年生的鐵觀音（Camellia sinensis cv. Tie-guanyin）茶樹扦插苗，移栽至1/2劑量的Hoagland營養(yǎng)液修復(fù)培養(yǎng)，置于玻璃溫室自然光照，每天定時通氣，3 d后用分別用25%聚乙二醇（PEG-6000）溶液和200 mmol/L NaCl溶液，模擬水分脅迫和高鹽脅迫進(jìn)行培養(yǎng)，對照為1/2劑量的Hoagland營養(yǎng)液水培，重復(fù)5次，分別為對照0（K0）、24（K1）、48（K2）、72 h（K3）；25% PEG 處理0（P0）、24（P1）、48（P2）、72 h（P3）；200 mmol/L NaCl處理0（N0）、24（N1）、48（N2）、72 h（N3）；取每組的茶樹幼苗芽下第2、3葉片，液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫ū?）。

1.2.2 茶樹鐵觀音葉片組織總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成 采集經(jīng)過水分、高鹽脅迫處理的茶樹鐵觀音幼苗芽下第2、3葉片組織為實(shí)驗(yàn)材料提取總RNA，提取方法參照宛曉春[22]改良CTAB法，運(yùn)用購自TaKaRa公司的Dnase I 對茶樹基因組DNA消化處理。取適量茶樹葉片組織總RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析質(zhì)量。以消化處理后的茶樹葉片組織總RNA為模板，參照TaKaRa公司的Prime ScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit操作說明，以oligo（dT）和Random 6 mers為逆轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA第一鏈。

1.2.3 茶樹鐵觀音P5CS的克隆與測序 利用同源克隆的方法，在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中檢索近緣植物的△1-吡咯琳-5-羧酸合成酶基因序列，主要參照葡萄（Vitis vinifera）（XM_002282319.2）、美味獼猴桃（Actinidia deliciosa）（ADU92286）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）（NM_115419.4）、歐洲大葉楊（Populus trichocarpa）（XM_002315166.1）、大豆（Glycine max）（NM_00125122-4.1）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）（XM_003568279.1）、番茄（Solanum lycopersicum）（NM_001246978.1）、蓖麻（Ricinus communis）（XM_002524184.1）的P5CS序列，選擇高度保守的區(qū)段，設(shè)計(jì)如下2對同源引物（PS1-F、PS1-R、PS2-F、PS2-R）分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增（表2）。反應(yīng)體系為25 μL：10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs 0.5 μL，上下游引物各1.0 μL，模板1.0 μL，ExTaq酶0.5 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min預(yù)變性；94 ℃ 30 s變性，57 ℃ 30 s退火，72 ℃ 1 min延伸，進(jìn)行35個循環(huán)；72 ℃ 10 min?；厥諗U(kuò)增產(chǎn)物，利用pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α，挑取陽性克隆，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.2.4 茶樹鐵觀音P5CS核苷酸序列，氨基酸序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 運(yùn)用BioEdit軟件將得到的序列進(jìn)行電子拼接，同源比對驗(yàn)證；運(yùn)用ORF Finder在線軟件（http：//www.n-cbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）預(yù)測序列的開放閱讀框；運(yùn)用ExPASy在線工具對編碼蛋白的等電點(diǎn)、分子量等理化性質(zhì)進(jìn)行分析；運(yùn)用NCBI數(shù)據(jù)庫的CDD程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/c dd/wrpsb.c-gi）分析編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；運(yùn)用TMHMM在線軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)；運(yùn)用HNN在線軟件（http：//npsapbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_hnn.html）分析編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)；利用SignalP在線軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析編碼蛋白的信號肽；通過MEGA 5.0軟件對克隆獲得的茶樹鐵觀音P5CS與其他近緣物種P5CS進(jìn)行同源性比對并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)育分析。

1.2.5 實(shí)時熒光定量PCR分析 根據(jù)所克隆的茶樹鐵觀音P5CS，運(yùn)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)時熒光定量PCR引物（RP-F、 RP-R），所選用內(nèi)參基因?yàn)棣?Actin（A-F、A-R）（表2）。將水分、高鹽脅迫處理下的茶樹鐵觀音葉片組織的cDNA，參照Bio-Rad SsoAdvanced SYBR Green Supermix Kit操作說明，在Bio-Rad CFX Manager 3.0上對目的基因進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測。反應(yīng)體系為20 μL：SsoAdvanced SYBR Green Supermix 10 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，65 ℃ 1 min，循環(huán)40次。運(yùn)用2-△△CT法[23]分析計(jì)算茶樹鐵觀音P5CS的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹鐵觀音葉片組織總RNA提取和cDNA第一鏈的合成

電泳結(jié)果顯示28 S rRNA和18 S rRNA條帶清晰明亮，兩者的比例大約為2 ∶ 1，并且5 S條帶清晰可見，說明RNA較完整，質(zhì)量良好。將茶樹鐵觀音葉片組織總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，經(jīng)檢測，質(zhì)量達(dá)到后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。

2.2 茶樹鐵觀音P5CS片段的克隆

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中茶樹鐵觀音近緣植物的P5CS序列，設(shè)計(jì)2對引物，經(jīng)多輪PCR擴(kuò)增得到兩條片段，電泳結(jié)果顯示約為800 bp和1 000 bp的片段，擴(kuò)增特異性良好，與預(yù)計(jì)的目的片段長度相似（圖1）。測序后通過Blast分析比對，證實(shí)為P5CS片段序列。

2.3 茶樹鐵觀音CsP5CS片段的生物信息學(xué)分析

2.3.1 CsP5CS核苷酸序列分析 將測序后的片段進(jìn)行拼接，獲得P5CS基因片段長為1 316 bp，預(yù)測其編碼一個長為323個氨基酸的多肽片段。該基因編碼的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為34.7 ku，pI為7.62。將所克隆的茶樹鐵觀音P5CS命名為CsP5CS。將茶樹鐵觀音CsP5CS的核苷酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對，發(fā)現(xiàn)其與以下物種的P5CS有較高的同源性：美味獼猴桃（O04015.1）、蠟燭果（Aegiceras corniculatum，AAW50846.1）、歐洲大葉楊（XP_002315202.1）、麻瘋樹（Jatropha curcas，GU358610.1）、湖北海棠（Malus hupehensis，JF742986.1）、 胡楊（Populuse uphratica，EF412967.1）、蓖麻（XM_

002524184.1）、葡萄（NM_001281205.1），同源性分別為89%、84%、83%、83%、83%、83%、83%、83%。測序結(jié)果和核苷酸序列的同源性比對驗(yàn)證了該基因的準(zhǔn)確性。

2.3.2 CsP5CS氨基酸序列分析 根據(jù)網(wǎng)站預(yù)測參數(shù)，其不穩(wěn)定系數(shù)為38.25，不穩(wěn)定系數(shù)大于40時為不穩(wěn)定蛋白，由此預(yù)測該蛋白是一個不穩(wěn)定蛋白。CsP5CS的GRAVY值為0.11，結(jié)合ProtScale親/疏水性分析結(jié)果，預(yù)測該蛋白為親水性蛋白。蛋白質(zhì)疏水性分析對于研究其跨膜特征和二級結(jié)構(gòu)有著重要的指導(dǎo)意義，通常認(rèn)為，氨基酸分值越低親水性越強(qiáng)，分值越高疏水性越強(qiáng)。CsP5CS氨基酸序列的第170位氨基酸分值最高，為2.822，疏水性最強(qiáng)；第202位氨基酸分值最低，為-2.167，親水性最強(qiáng)。就整體分析而言，親水性氨基酸均勻分布在整個多肽鏈中，沒有明顯的疏水性區(qū)域，因此，推測CsP5CS是一個親水性蛋白（圖2）。利用TMHMM在線軟件，預(yù)測CsP5CS氨基酸序列跨膜區(qū)段結(jié)果顯示，1～6位氨基酸在膜內(nèi)，7～29位氨基酸為跨膜螺旋，30～323位氨基酸在膜外。因此，推測該基因編碼的蛋白為跨膜蛋白（圖3）。利用HNN在線軟件，預(yù)測CsP5CS蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示，CsP5CS的肽鏈有129個氨基酸參與α-螺旋結(jié)構(gòu)，占39.94%；有71個氨基酸參與延伸鏈結(jié)構(gòu)，占21.98%；有123個氨基酸參與無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，占38.08%；整體分析，α-螺旋和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)占大多數(shù)（圖4）。利用SignalP在線軟件，預(yù)測CsP5CS的信號肽結(jié)果顯示，原始剪切位點(diǎn)分值（C值）、信號肽分值（S值）和綜合剪切位點(diǎn)分值（Y值）均比較低，無氨基酸殘基位點(diǎn)，因此，可能不存在信號肽，是一個非分泌蛋白（圖5）。利用NCBI數(shù)據(jù)庫對CsP5CS蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果顯示該基因編碼蛋白在N端有1個氨基酸激酶超家族[Amino Acid Kinases（AAK）superfamily]功能區(qū)，在C端有1個醛脫氫酶超家族[Aldehyde Dehydrogenase（ALDH）superfamily]功能區(qū)。該超家族成員在生物體內(nèi)執(zhí)行著多種功能，其表達(dá)與膨壓和滲透脅迫相關(guān)（圖6）。

2.3.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 將本研究獲得CsP5CS的氨基酸序列與其他17個物種的P5CS氨基酸序列構(gòu)建鄰接（Neighbor joining）系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖7）。圖中可分為3組，CsP5CS與中華獼猴桃、美味獼猴桃、蠟燭果、擬南芥、葡萄等雙子葉植物聚為一類，雙子葉植物中親緣關(guān)系最近及遠(yuǎn)依次為美味獼猴桃（A. deliciosa）、中華獼猴桃（A. chinensis）、蠟燭果（A. corniculatum）、煙草（N. tabacum）、多裂水茄（Solanumtorvum）、馬鈴薯（S. tuberosum）、蕃茄（S. lycopersicum）、葡萄（V. vinifera）、黃瓜（C. sativus）、擬南芥（A. thaliana）、玉米（Z. mays）、水稻（O. sativa）、二穗短柄草（B. distachyon）等單子葉植物聚為一類。動物界的親緣關(guān)系由近及遠(yuǎn)為秀麗隱桿線蟲（C. elegans）、熱帶爪蟾（X. tropicalis）、人類（H. sapiens）、小鼠（M. musculus）。由P5CS的無根進(jìn)化樹可以看出，植物中單子葉植物與雙子葉植物的P5CS能聚為一簇，這與單雙子葉植物進(jìn)化過程一致。動物的P5CS也可以聚成一簇。結(jié)果與形態(tài)學(xué)上分類的進(jìn)化關(guān)系基本一致，基本上可反映該基因的進(jìn)化規(guī)律和物種進(jìn)化的協(xié)同關(guān)系。其中，CsP5CS與雙子葉植物中的中華獼猴桃和美味獼猴桃親緣關(guān)系最近，可推測由同一祖先經(jīng)不同的途徑進(jìn)化而來。

2.4 水分、高鹽脅迫處理下CsP5CS在葉片組織中的表達(dá)分析

實(shí)時熒光定量PCR中融解曲線（圖8）分析表明，CsP5CS與內(nèi)參基因（β-Actin）的融解曲線均為銳利的單峰型，且Tm值在80～85 ℃之間，表明擴(kuò)增產(chǎn)物特異性好，無非特異擴(kuò)增，且無引物二聚體。擴(kuò)增曲線分析表明，CsP5CS與內(nèi)參基因（β-Actin）的擴(kuò)增曲線均呈S形，有明顯的指數(shù)擴(kuò)增區(qū)，符合數(shù)據(jù)要求。

運(yùn)用2-△△CT法計(jì)算CsP5CS的相對表達(dá)量（圖9）。結(jié)果顯示，茶樹鐵觀音幼苗在水分脅迫（25% PEG）處理下，葉片組織中CsP5CS表達(dá)水平呈“先上升后下降”的趨勢。水分脅迫處理0～24 h之間，CsP5CS表達(dá)量呈上升趨勢；水分脅迫處理24 h，CsP5CS相對表達(dá)量最高，為對照組的2.6倍；水分脅迫處理24～72 h，CsP5CS表達(dá)量呈下降趨勢；水分脅迫處理48 h，CsP5CS表達(dá)量比對照組高，為對照組的1.9倍；水分脅迫處理72 h，CsP5CS表達(dá)量比對照組低，為對照組的0.6倍。茶樹鐵觀音幼苗在高鹽脅迫（200 mmol/L NaCl）處理下，葉片組織中CsP5CS表達(dá)水平呈“持續(xù)上升”趨勢。高鹽脅迫處理0～72 h之間，CsP5CS表達(dá)量都呈上升趨勢；高鹽脅迫處理72 h，CsP5CS表達(dá)量最高，為對照組的9.9倍；高鹽脅迫處理0～24 h時，CsP5CS表達(dá)量差異不顯著，高鹽脅迫處理24 h，CsP5CS表達(dá)量比對照組高，為對照組的1.1倍；高鹽脅迫處理24～72 h之間，CsP5CS表達(dá)量差異顯著，明顯高于對照組，高鹽脅迫處理48 h，CsP5CS表達(dá)量比對照組高，為對照組的2.8倍。以上數(shù)據(jù)可以推測CsP5CS基因是茶樹鐵觀音響應(yīng)滲透脅迫應(yīng)答基因之一，茶樹鐵觀音CsP5CS基因?qū)?種脅迫的應(yīng)答速度不同，干旱脅迫處理下的應(yīng)答速度較高鹽脅迫下的應(yīng)答速度快，且干旱脅迫處理下CsP5CS基因相對表達(dá)量較高鹽脅迫處理下低。

2.5 水分、高鹽脅迫處理下茶樹鐵觀音幼苗表型變化

水分脅迫處理下，茶樹葉片于24 h開始萎蔫，隨著時間延長葉片萎蔫程度逐漸加重，葉片和葉柄的夾角隨時間的延長逐漸變小。水分脅迫處理72 h，葉片萎蔫程度最嚴(yán)重，葉片卷曲程度大，葉片顏色由綠色變褐色，已接近枯萎，葉片和葉柄的夾角為3個處理組中最小。高鹽脅迫處理下，茶樹葉片于48 h開始萎蔫，隨著時間延長葉片萎蔫程度略微加重，葉片和葉柄的夾角隨時間的延長略微變小。高鹽脅迫處理72 h，葉片萎蔫程度較輕，葉片卷曲程度小，顏色仍為綠色，與對照組相比，葉片和葉柄的夾角略微變小。

3 討論與結(jié)論

脯氨酸是植物面對干旱和高鹽脅迫，積累的最為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[1-3]。P5CS作為脯氨酸生物合成中的限速酶，在脯氨酸的合成過程中起著至關(guān)重要的作用[6-12]。本研究中，首次以茶樹鐵觀音作為實(shí)驗(yàn)村料，利用同源克隆的方法，克隆得到茶樹鐵觀音P5CS，并命名為CsP5CS。通過生物信息學(xué)分析，該基因推導(dǎo)的氨基酸序列與已知的其它物種該基因的氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)同源性均在83%以上，說明該基因在生物進(jìn)化上具有高度保守性。該基因推導(dǎo)的蛋白預(yù)測為親水性跨膜蛋白。蛋白質(zhì)N端有1個氨基酸激酶超家族功能區(qū)，在C端有1個醛脫氫酶超家族功能區(qū)。該超家族成員在生物體內(nèi)執(zhí)行著多種功能，其表達(dá)主要與膨壓和滲透脅迫相關(guān)。依據(jù)CsP5CS氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，單子葉植物與雙子葉植物各聚為一大類，CsP5CS與美味獼猴桃、中華獼猴桃、蠟燭果、煙草、多裂水茄、馬鈴薯、蕃茄、黃瓜聚為一小類，與中華獼猴桃和美味獼猴桃親緣關(guān)系最近，推測由同一祖先經(jīng)不同的途徑進(jìn)化而來。分子系統(tǒng)樹的分析結(jié)果與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)的分類結(jié)果基本吻合，基本上可反映這一組物種的親緣關(guān)系規(guī)律。以上結(jié)果表明，CsP5CS為△1-吡咯琳-5-羧酸合成酶基因，在茶樹鐵觀音脯氨酸生物合成的谷氨酸途徑中起到重要作用。

通過實(shí)時熒光定量PCR，對干旱、高鹽脅迫處理下的茶樹鐵觀音的CsP5CS表達(dá)情況分析表明：（1）CsP5CS在脅迫誘導(dǎo)下都呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)。與報(bào)道的大豆[24]、菜豆[25]、羅布麻[26]、甘蔗[27]中P5CS表達(dá)特性相同，進(jìn)一步說明茶樹鐵觀音體內(nèi)存在著滲透脅迫后脯氨酸積累的適應(yīng)機(jī)制，脯氨酸代謝受CsP5CS基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的調(diào)控。這為進(jìn)一步研究茶樹鐵觀音體內(nèi)該基因在滲透脅迫下的生理功能及作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。（2）在干旱脅迫處理期間，葉片組織中CsP5CS基因在0～24 h之內(nèi)出現(xiàn)較明顯的上調(diào)表達(dá)，24 h達(dá)最高峰，相對表達(dá)量為對照組的2.6倍，24 h后出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，直到72 h降為最低。說明在干旱脅迫處理下，茶樹鐵觀音通過CsP5CS基因的上調(diào)表達(dá)適應(yīng)干旱，當(dāng)處理時間超過72 h，可能已超過植物耐受范圍。在高鹽脅迫處理期間，葉片組織中CsP5CS基因于24～48 h才出現(xiàn)較明顯的上調(diào)表達(dá)，72 h達(dá)最高峰，相對表達(dá)量為對照組的9.9倍。Igarashi等[27]研究顯示，水稻OsP5CS基因在干旱脅迫、高鹽脅迫、ABA處理下都出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)。干旱脅迫處理期間，水稻OsP5CS基因于0～5 h內(nèi)出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，10 h達(dá)最大，之后出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)。高鹽脅迫處理期間，水稻OsP5CS基因于0～24 h內(nèi)出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，24 h達(dá)最大。Yoshiba等[28]研究顯示，擬南芥AtP5CS基因在干旱、高鹽脅迫處理下也出現(xiàn)類似的表達(dá)特性。與本研究的結(jié)果一致，可以推測CsP5CS基因是茶樹鐵觀音響應(yīng)滲透脅迫應(yīng)答基因之一，茶樹鐵觀音CsP5CS基因?qū)煞N脅迫的應(yīng)答速度不同，干旱脅迫處理下的應(yīng)答速度較高鹽脅迫下的應(yīng)答速度快，且干旱脅迫處理下CsP5CS基因相對表達(dá)量較高鹽脅迫處理下低。茶樹鐵觀音對干旱脅迫比高鹽脅迫敏感，對高鹽脅迫處理下的適應(yīng)能力較干旱脅迫處理下的適應(yīng)能力強(qiáng)。該結(jié)果可能與茶樹的品種或者特有的生理特性有關(guān)，對提高茶樹抗逆性具有重大意義。

本研究利用同源克隆首次從茶樹鐵觀音中克隆得到了CsP5CS，為茶樹鐵觀音脯氨酸合成酶系基因的系統(tǒng)研究以及通過分子生物學(xué)技術(shù)提高茶樹鐵觀音的抗逆性提供了線索。實(shí)時熒光定量PCR分析，CsP5CS在干旱、高鹽脅迫條件均上調(diào)表達(dá)，干旱脅迫下應(yīng)答速度快，高鹽脅迫下相對表達(dá)量高。這些結(jié)果可能與茶樹品種或者特有的生理特性有關(guān)，具有進(jìn)一步的研究價(jià)值。后期將結(jié)合RNA-seq相關(guān)數(shù)據(jù)，在全轉(zhuǎn)錄本水平對茶樹鐵觀音在不同脅迫下的表達(dá)特性進(jìn)行探討。

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