3個(gè)甘蔗與斑茅遠(yuǎn)緣雜交后代BC1的染色體遺傳分析

黃永吉　符成　林煒樂(lè)　劉少謀　高嘉慧　鄧祖湖　黃忠興　林彥銓　陳如凱

摘 要 對(duì)3個(gè)甘蔗與斑茅遠(yuǎn)緣雜交后代BC1進(jìn)行真實(shí)性鑒定及染色體核型分析，以探討甘蔗與斑茅BC1的染色體傳遞方式。利用2對(duì)鑒定斑茅真實(shí)雜交后代的特異引物對(duì)3個(gè)甘蔗與斑茅BC1進(jìn)行鑒定，采用根尖分生區(qū)細(xì)胞去壁低滲涂片法制片，顯微拍照計(jì)數(shù)染色體數(shù)目，并進(jìn)行染色體核型分析。3個(gè)BC1材料均為斑茅的真實(shí)雜交后代，崖城01-69體細(xì)胞染色體核型公式為2n=121=120 m+1 sm，其染色體按2n+n方式傳遞；崖城01-116的體細(xì)胞染色體核型公式為2n=122=118 m+4 sm，其染色體傳遞方式為2n+n；崖城01-134的體細(xì)胞染色體核型公式為2n=121=120 m+1 sm，其染色體傳遞為2n+n。推斷甘蔗與斑茅BC1的染色體以2n+n的方式傳遞。

關(guān)鍵詞 甘蔗；斑茅；核型分析；染色體傳遞方式

中圖分類號(hào) S334.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Genetic Analysis of Chromosome in 3 BC1 Clones from

the Distant Crossing Between Saccharum spp.

and Erianthus arundinaceus

HUANG Yongji1， FU Cheng2 *， LIN Weile1， LIU Shaomou2， GAO Jiahui1

DENG Zuhu1 **， HUANG Zhongxing2， LIN Yanquan1， CHEN Rukai1

1 Key Lab of Sugarcane Biology and Genetic Breeding， Ministry of Agriculture， Fuzhou， Fujian 350002， China

2 Guangzhou Research Institute for Sugarcane Industry， Guangzhou， Guangdong 510316， China

Abstract To explore the chromosome transmission， the karyotypes of 3 BC1 clones from the distant crossing between Saccharum spp. and Erianthus arundinaceus were analyzed. 3 BC1 clones were identified using 2 pairs of specific primers of true E. arundinaceus progenies. Chromosomes were prepared according to cell wall degradation hypotonic smear method， the chromosomes number of 3 BC1 clones was calculated and the karyotypes of 3 BC1 clones were analyzed. 3 BC1 clones were true progenies of E. arundinaceus. The somatic chromosome karyotypic type of YC01-69 was 2n=121=120 m+1 sm， following 2n+n transmission； The somatic chromosome karyotypic type of YC01-116 was 2n=122=118 m+4 sm， following 2n+n transmission； The somatic chromosome karyotypic type of YC01-134 was 2n=121=120 m+1 sm， following 2n+n transmission. The 2n+n transmission of BC1 clones from Saccharum spp. and E. arundinaceus can be resumed.

Key words Sugarcane； Erianthus arundinaceus； Karyotype analysis； Chromosome transmission

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.01.010

甘蔗是中國(guó)乃至世界最重要的糖料作物和具有較好發(fā)展前景的糖能兼用的可再生生物能源作物[1]，全球蔗糖產(chǎn)量約占食糖總產(chǎn)量的75%[2]?，F(xiàn)代甘蔗栽培品種（Saccharum spp. L.）主要來(lái)源于幾個(gè)熱帶種也被稱為高貴種（Saccharum officinarum）和不多的野生種割手密（Saccharum spontaneum）的雜交后代，導(dǎo)致其遺傳基礎(chǔ)相對(duì)狹窄[3-4]，制約了甘蔗產(chǎn)量的進(jìn)一步提高。

蔗茅屬、芒屬、硬穗茅屬和河八王屬等甘蔗近緣屬野生種是拓寬甘蔗遺傳基礎(chǔ)的重要種質(zhì)資源[5]，世界各國(guó)甘蔗育種者陸續(xù)在這些種質(zhì)資源的收集、保存和利用等方面開(kāi)展了大量的工作。其中，斑茅（Erianthus arundinaceus）屬于蔗茅屬植物[6]，因其具有高生物量、生勢(shì)旺盛、分蘗力強(qiáng)、宿根性好和耐澇、耐瘠、抗旱、抗病蟲(chóng)能力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)[7-12]，備受甘蔗育種者親睞。期望通過(guò)屬間遠(yuǎn)緣雜交進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新，將甘蔗近緣屬野生種的優(yōu)良基因滲透到甘蔗中，豐富其遺傳背景，創(chuàng)制出抗逆、高產(chǎn)、高糖的超親良種[13-14]。長(zhǎng)期以來(lái)，由于甘蔗與斑茅F1高度不育和雜交后代遺傳機(jī)理不明，導(dǎo)致斑茅的雜交利用進(jìn)展緩慢。經(jīng)過(guò)甘蔗育種者的不懈努力，斑茅種質(zhì)研究與利用取得重要進(jìn)展，已突破BC1，成功獲得甘蔗與斑茅更高世代的真實(shí)雜交后代[7，9，12，15-17]，其中有些材料的性狀表現(xiàn)優(yōu)良，具有良好的利用價(jià)值。然而，由于甘蔗是高度復(fù)雜的異源多倍體或非整倍體植物[18]，其染色體較小且數(shù)目眾多（100～130條）[19]，染色體制片十分困難。此外，染色體中期相比率低，導(dǎo)致甘蔗細(xì)胞遺傳學(xué)研究進(jìn)展滯后于其他作物。

開(kāi)展對(duì)甘蔗與斑茅雜交后代的細(xì)胞遺傳學(xué)研究，對(duì)斑茅等近緣屬野生種種質(zhì)資源利用研究具有重要的指導(dǎo)意義。本文對(duì)3個(gè)甘蔗與斑茅BC1崖城01-69、崖城01-116和崖城01-134進(jìn)行染色體核型分析，旨在對(duì)甘蔗與斑茅BC1的染色體遺傳特點(diǎn)進(jìn)行研究，將有助于提高斑茅在甘蔗遺傳改良育種上的利用效率，并提供一定的細(xì)胞遺傳學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究材料為Badila、海南斑茅92-77、海南斑茅92-105、崖城96-40、崖城96-66、CP84-1198、崖城01-69、崖城01-116、崖城01-134（圖1），斑茅及其后代無(wú)性系來(lái)自廣州甘蔗糖業(yè)研究所海南甘蔗育種場(chǎng)，保育在福建農(nóng)林大學(xué)甘蔗綜合研究所資源圃。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取和雜交后代真實(shí)性分子鑒定

參考SM Aljanabi等[20]的CTAB法提取供試材料葉片的總基因組DNA。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的2對(duì)鑒定斑茅真實(shí)雜交后代的特異引物（EF1和ER1；EF2和ER2）[21]對(duì)供試材料進(jìn)行雜交后代真實(shí)性分子鑒定，用美國(guó)ABI 梯度PCR儀（VeritiTM 96）進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)總體積為25 μL，包括2.5 ng基因組DNA，1×Ex Taq PCR Buffer，dNTPs Mixture各2.5 mmol/L，正向和反向引物各0.4 μmol/L，1.25 U TaKaRa Ex Taq。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min；93 ℃變性50 s，52 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。

1.2.2 染色體制片 參考黃東益[22]和鄧祖湖等[23]的方法，28 ℃保濕培養(yǎng)根尖至1.5 cm，切取1 cm左右的根尖于對(duì)二氯苯飽和水溶液處理2 h，再用無(wú)水乙醇和冰醋酸（3 ∶ 1）溶液固定24 h，固定后的根尖0.075 mol/L KCl中低滲1 h，3.5%纖維素酶和1.75%果膠酶混合液在37 ℃酶解8～12 h。酶解后根尖置于蒸餾水中低滲30～60 min，無(wú)水乙醇和冰醋酸（3 ∶ 1）溶液固定30 min。將根尖分生區(qū)切下，均勻涂抹于載玻片上，空氣干燥后用pH6.8的Giemsa染液染色。用Carl Zeiss Scope.A1顯微鏡觀察，MRC5相機(jī)拍照。

1.2.3 染色體核型分析 每個(gè)材料選取30個(gè)染色體分散較好的中期細(xì)胞進(jìn)行染色體數(shù)目的統(tǒng)計(jì)，選取典型的中期細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量，制成染色體參數(shù)表，繪制核型模式圖，選擇具有代表性的分裂相排成核型。核型分析參照李懋學(xué)等[24]的標(biāo)準(zhǔn)，染色體的相對(duì)長(zhǎng)度、臂比類型按Levan等[25]命名系統(tǒng)確定，核型類型參考Stebbins[26]的標(biāo)準(zhǔn)分類，染色體類型采用Kuo等[27]的方法進(jìn)行劃分。用Image-Pro Plus 6.0（Media Cybernetics， Inc.）測(cè)量染色體長(zhǎng)度，用Microsoft Excel 2013軟件分析作圖，核型分析方法參考李懋學(xué)等[24]的方法，但考慮到甘蔗為異源多倍體，染色體不進(jìn)行配對(duì)，本文染色體核型分析按其長(zhǎng)度從長(zhǎng)到短排列，單條染色體核型分析不配對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗與斑茅雜交后代BC1雜交后代真實(shí)性鑒定

利用2對(duì)鑒定斑茅真實(shí)雜交后代特異引物（EF1和ER1；EF2和ER2）對(duì)Badila、海南斑茅92-77、海南斑茅92-105、崖城96-40、崖城96-66、CP84-1198、崖城01-69、崖城01-116、崖城01-134進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，海南斑茅92-77、海南斑茅92-105、崖城96-40、崖城96-66、崖城01-69、崖城01-116、崖城01-134都擴(kuò)增出斑茅特異條帶，而B(niǎo)adila和CP84-1198沒(méi)有擴(kuò)增出特異條帶（圖2），說(shuō)明崖城01-69、崖城01-116、崖城01-134為甘蔗與斑茅的真實(shí)雜交后代。

2.2 3個(gè)甘蔗與斑茅BC1核型分析結(jié)果

2.2.1 崖城01-69核型分析結(jié)果 崖城01-69的核型參數(shù)見(jiàn)表1，其體細(xì)胞染色體數(shù)為2n=121，相對(duì)長(zhǎng)度介于0.28～1.51，最長(zhǎng)染色體/最短染色體為5.42，臂比范圍介于1.01～1.90，平均臂比為1.19，染色體屬1C型。121條染色體中有120條為中部著絲粒染色體，1條為近中部著絲粒染色體，核型公式為2n=121=120 m+1 sm，染色體形態(tài)和核型模式見(jiàn)圖3、4。

2.2.2 崖城01-116核型分析結(jié)果 崖城01-116的核型參數(shù)見(jiàn)表1，其體細(xì)胞染色體數(shù)為2n=122，相對(duì)長(zhǎng)度介于0.49～1.62，最長(zhǎng)染色體/最短染色體為3.32，臂比范圍介于1.01～1.96，平均臂比為1.21，染色體屬1B型。122條染色體中有118條為中部著絲粒染色體，4條為近中部著絲粒染色體，核型公式為2n=122=118 m+4 sm。染色體形態(tài)和核型模式圖見(jiàn)圖5、6。

2.2.3 崖城01-134核型分析結(jié)果 崖城01-134的核型參數(shù)見(jiàn)表1，其體細(xì)胞染色體數(shù)為2n=121，相對(duì)長(zhǎng)度介于0.38～1.32，最長(zhǎng)染色體/最短染色體為3.49，臂比范圍介于1.01～1.71，平均臂比為1.17，染色體屬1B型。121條染色體中有120條為中部著絲粒染色體，1條為近中部著絲粒染色體，核型公式為2n=121=120 m+1 sm，染色體形態(tài)和核型模式圖見(jiàn)圖7、8。

3 討論與結(jié)論

甘蔗是中國(guó)最重要的糖料作物，中國(guó)作為一個(gè)重要的食糖生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，食糖產(chǎn)業(yè)的重要戰(zhàn)略性不言而喻。然而，全球甘蔗商業(yè)栽培品種的改良是通過(guò)利用十分有限的種質(zhì)資源完成的。因此，利用野生種種質(zhì)資源擴(kuò)大甘蔗遺傳基礎(chǔ)，并進(jìn)行雜交育種提高甘蔗產(chǎn)量顯得尤為重要。斑茅等近緣屬野生種是甘蔗遺傳育種重要的種質(zhì)資源，其具有極其豐富和寶貴的潛在基因資源，通過(guò)甘蔗與斑茅屬間雜交培育具有適應(yīng)性廣、抗逆強(qiáng)、高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的新良種，對(duì)甘蔗育種具有重要意義。

縱觀甘蔗品種改良育種史，每次甘蔗遺傳改良育種瓶頸得以突破都有新的種質(zhì)資源滲入[28]。Jeswiet的“高貴化”育種和Ven Katraman的“三元雜種”創(chuàng)造了半個(gè)世紀(jì)甘蔗糖業(yè)的輝煌成就。其中，Jeswiet首創(chuàng)高貴種與野生種割手密的高貴化雜交育種，經(jīng)過(guò)2次2n+n的染色體遺傳方式，這種遺傳方式加速了高貴化進(jìn)程，不僅累積了高貴種的優(yōu)良血統(tǒng)，同時(shí)又削弱了野生種的不良血統(tǒng)[29]。甘蔗育種者認(rèn)為割手密的BC2、BC3即可培育出具備高貴種的高產(chǎn)高糖特性與野生種的強(qiáng)活力、強(qiáng)抗性的良種，高貴化次數(shù)過(guò)多，反而可能會(huì)使抗性和活力降低。因此，開(kāi)展甘蔗野生種種質(zhì)資源的遺傳背景和遺傳方式研究是實(shí)現(xiàn)甘蔗遺傳育種新突破的關(guān)鍵。

甘蔗染色體傳遞方式十分復(fù)雜，有n+n、2n+n、n+2n和2n+2n等傳遞方式，并且n常常不是一倍體的原來(lái)數(shù)目，常有增減，Bremer將這種配子數(shù)目常有增減的現(xiàn)象稱為“不平衡遺傳”[30]。甘蔗性細(xì)胞減數(shù)分裂出現(xiàn)異常時(shí)，配子增減幾條染色體甚至是染色體加倍，仍然能夠結(jié)合成受精卵，并正常地發(fā)育生長(zhǎng)成完整植株和完成整個(gè)生育期的特性，筆者將這種具備雌雄配子非正常結(jié)合成受精卵的相容現(xiàn)象稱之為“容錯(cuò)現(xiàn)象”。甘蔗染色體減數(shù)分裂很不規(guī)則，其可能會(huì)出現(xiàn)染色體提早進(jìn)入中期，推遲進(jìn)入后期，在末期和四分體即形成核仁，小孢子染色體數(shù)無(wú)規(guī)則，形成非整倍體后代等[31]。甘蔗染色體配對(duì)雖大多以二價(jià)體為主，但也存在單價(jià)體和多價(jià)體，多價(jià)體配對(duì)反映出同源聯(lián)會(huì)不完全[19]。

甘蔗與斑茅有性雜交的F1染色體遺傳方式為n+n，高貴種的染色體未加倍，BC1染色體遺傳方式是2n+n，含斑茅血緣的F1的染色體被完整保留下來(lái)，而較為“高貴”的父本CP84-1198的染色體減半，這種染色體遺傳方式使高貴化進(jìn)程減慢，可能需要在更高世代中才能獲得含有斑茅血緣的良種。由于甘蔗屬熱帶種和斑茅遠(yuǎn)緣雜交獲得的F1高度不育，難以達(dá)到轉(zhuǎn)移有利基因的目的，一些甘蔗育種者將割手密作為橋梁親本，先利用割手密與斑茅雜交，獲得的F1聚合了雙親優(yōu)點(diǎn)以及較好的花粉育性，可進(jìn)一步利用這些具備雙親優(yōu)異基因的F1再與其他甘蔗栽培品種雜交，創(chuàng)制出新的突破性優(yōu)良種質(zhì)[32-33]，或許這是克服F1高度不育而帶來(lái)的諸多不利的途徑之一。

本研究從3個(gè)甘蔗與斑茅BC1的斑茅后代真實(shí)性鑒定和核型分析結(jié)果可以看出：經(jīng)2對(duì)斑茅真實(shí)雜交后代特異引物鑒定，崖城01-69、崖城01-116和崖城01-134都出現(xiàn)了斑茅的特異條帶，說(shuō)明這3個(gè)材料均為甘蔗與斑茅的真實(shí)雜交后代。3個(gè)甘蔗與斑茅BC1無(wú)性系崖城01-69、崖城01-116和崖城01-134的染色體均由中部著絲點(diǎn)和近中部著絲點(diǎn)組成，分別屬1C型、1B型和1B型，這與鄭成木[34]、劉文榮等[35]、黃東益等[36]、鄧祖湖等[23，37]的研究結(jié)果基本一致，他們均認(rèn)為甘蔗染色體多以中部著絲點(diǎn)染色體為主。Stebbins[26]認(rèn)為，高等植物核型進(jìn)化的基本趨勢(shì)是由對(duì)稱向不對(duì)稱發(fā)展的，較原始的植物的核型具對(duì)稱的中部著絲點(diǎn)染色體較多，而較進(jìn)化的植物的核型具中部著絲點(diǎn)染色體較少。因此，3個(gè)甘蔗與斑茅BC1染色體較原始。崖城01-69為121條染色體，崖城01-116為122條染色體，崖城01-134為121條染色體，母本崖城96-40為69條染色體，母本崖城96-66為69條染色體，父本CP84-1198為120條染色體，因此，如果經(jīng)過(guò)正常的減數(shù)分裂，母本崖城96-40的配子有34或者35條染色體，母本崖城96-66的配子有34或者35條染色體，父本CP84-1198的配子有60條染色體。若按n+n傳遞，崖城01-69、崖城01-116和崖城01-134的染色體應(yīng)為2n=94或95；若按n+2n傳遞，崖城01-69、崖城01-116和崖城01-134的染色體應(yīng)為2n=154或155；按2n+n，崖城01-69、崖城01-116和崖城01-134的染色體應(yīng)為2n=129，較為符合。因此，推斷BC1以2n+n的方式進(jìn)行傳遞，與Piperidis等的結(jié)果一致[16]。

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