南瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性的SRAP分析

盧麗芳　朱海生　溫慶放　林義章

摘 要 本研究應(yīng)用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)所收集的85份南瓜資源進(jìn)行親緣關(guān)系分析，從100對(duì)引物中挑出17對(duì)引物對(duì)其進(jìn)行條帶擴(kuò)增。結(jié)果表明：共獲得條帶200條，差異帶有187條，13條條帶為所有南瓜品種所共有，多態(tài)性比例為93.5%?；赟RAP數(shù)據(jù)通過(guò)Ntsys2.10e軟件計(jì)算出85份南瓜資源的遺傳相似系數(shù)在0.450 0～0.985 0。通過(guò)聚類(lèi)分析將所收集的南瓜資源分為3大類(lèi)：中國(guó)南瓜、印度南瓜、美洲南瓜，親緣關(guān)系較近的是中國(guó)南瓜與美洲南瓜，二者與印度南瓜的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

關(guān)鍵詞 南瓜；SRAP；親緣關(guān)系；聚類(lèi)分析

中圖分類(lèi)號(hào) S642.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Analysis of Genetic Diversity in Squash by SRAP Markers

LU Lifang1，ZHU Haisheng2，3，4*，WEN Qingfang2，3，4*，LIN Yizhang1

1 College of Horticulture，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350002，China

2 Crops Research Institute，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Sciences，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350013，China

3 Vegetable Research Center，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Sciences，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350013，China

4 Fujian Engineering Research Center for Vegetables，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350013，China

Abstract In this study，SRAP was used to analyse the genetic relationship of 85 accessions in squash. Seventeen pairs of primers were screened out of 100 primer pairs which produced 200 DNA bands， with 187 bands of polymorphic and 13 bands for all squash. The ratio of polymorphic bands was 93.5%. Based on the SRAP data，the genetic similarity coefficient of 85 accessions in squash was between 0.450 0 to 0.985 0， which was calculated by Ntsys2. 10e. Through cluster analysis，Squashes were divided into three groups：Cucurbita moschata，C. maxima，C. pepo. The relationship of C. moschata and C. pepo were close，the kinship with the C. maxima was far.

Key words Squash；SRAP；Genetic relationship；Cluster analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.12.006

南瓜屬（Cucurbita L）葫蘆科南瓜屬的一年生草本植物，起源于美洲，在16世紀(jì)中葉明中期傳入中國(guó)[1]。南瓜全球目前栽培種主要有5個(gè)：分別是中國(guó)南瓜，印度南瓜，美洲南瓜，灰籽南瓜和黒籽南瓜，在中國(guó)主要是栽培前3種。南瓜是人類(lèi)最早栽培的古老作物之一，在公元前4050年就開(kāi)始了美洲南瓜的栽培，公元前5000～3000年就有了中國(guó)南瓜和墨西哥南瓜的殘片存在[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)已經(jīng)入庫(kù)保存的南瓜份數(shù)總共有1 813份，其中中國(guó)南瓜1 064份，印度南瓜357份，美洲南瓜389份，黑籽南瓜占3份[3]。由于地區(qū)間相互引種、種子公司自繁自育、農(nóng)民自繁自育，導(dǎo)致市場(chǎng)上南瓜品種的名稱(chēng)眾多，同名異物或同物異名的情況頻繁出現(xiàn)，給南瓜種質(zhì)資源的收集工作和南瓜的育種工作造成困難。因此對(duì)于育種工作者來(lái)說(shuō)，種質(zhì)資源收集完成后，通過(guò)對(duì)收集的資源進(jìn)行系統(tǒng)的評(píng)價(jià)分析，才能夠更加明確需要選擇的育種親本，實(shí)現(xiàn)相應(yīng)的育種目標(biāo)。

SRAP（sequence-related amplified polymorphism）又稱(chēng)為相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性，2001年由美國(guó)加州蔬菜作物系的Li等[4]發(fā)明的，是一種基于PCR反應(yīng)的新型標(biāo)記系統(tǒng)，具有多態(tài)性高、樣品信息量大、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)穩(wěn)定、可靠性高、費(fèi)用低、非等位檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)[5]。其原理是通過(guò)對(duì)富含GC堿基的外顯子和富含AT的內(nèi)含子及啟動(dòng)子的ORF（開(kāi)放式閱讀框）設(shè)計(jì)一對(duì)獨(dú)特的引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增，從而表現(xiàn)出多態(tài)性[6]。為了從分子水平上了解南瓜種質(zhì)資源的遺傳多樣性，人們已經(jīng)用RAPD[7-11]、ISSR[10-11]、AELP[12]對(duì)遺傳多樣性進(jìn)行分析。關(guān)于利用SRAP分子標(biāo)記對(duì)南瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性進(jìn)行研究的報(bào)道較少，劉小俊等[13]利用SRAP對(duì)收集的76份南瓜資源進(jìn)行遺傳多樣性分析。本研究在廣泛收集南瓜種質(zhì)資源、優(yōu)化南瓜SRAP擴(kuò)增體系的基礎(chǔ)上[14]，對(duì)所收集到的85份南瓜種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，建立遺傳聚類(lèi)圖，鑒定品種間的親緣關(guān)系，為南瓜種質(zhì)資源的鑒定、分類(lèi)和南瓜的育種工作提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料共85份，見(jiàn)表1。包括中國(guó)南瓜，印度南瓜和美洲南瓜3個(gè)栽培種。材料來(lái)源于全國(guó)各地。

1.2 方法

1.2.1 供試南瓜DNA的提取 參考盧麗芳等[14]的方法。

1.2.2 PCR反應(yīng)及電泳 反應(yīng)在PCR儀上進(jìn)行，擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 uL，其中包括0.2 mmol/L dNTP，1.5 U Taq酶，80 ng DNA，0.16 umol/L的單條引物，1.5 mmol/L的Mg2+，2 uL 10×Buffer。擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min預(yù)變性；接著進(jìn)入5個(gè)循環(huán)，包括94 ℃ 1 min，35 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min；然后進(jìn)入35個(gè)循環(huán)，包括94 ℃ 1 min，52 ℃ 1min，72 ℃ 1 min；最后72 ℃延伸10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物用1.8%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，電泳緩沖液為1×TBE，采用DL 2 000 DNA Marker作為標(biāo)準(zhǔn)分子量對(duì)照，電泳時(shí)間45 min。電泳完成后，在EB中染色10 min左右，放入到凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察、拍照。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 根據(jù)所獲得的電泳圖進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和處理。電泳圖中的每一條帶代表著模板DNA和引物之間的一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)DNA擴(kuò)增結(jié)果，進(jìn)行人工計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)不同品種之間有重復(fù)性的多態(tài)性擴(kuò)增條帶，有條帶的記為1，沒(méi)有條帶的則記為0，從而形成由0和1組成的原始矩陣。采用Ntsys2.10e軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，獲得相應(yīng)的相似系數(shù)表和樹(shù)狀聚類(lèi)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

通過(guò)選用外觀形狀差異較大的5個(gè)南瓜品種對(duì)100對(duì)引物進(jìn)行篩選，選出13條引物（表2）將其用于南瓜SRAP分析，其中上游引物6條，下游引物7條。組成17對(duì)多態(tài)性高、重復(fù)性好、條帶清晰的SRAP引物，以此對(duì)85份南瓜材料進(jìn)行SRAP遺傳多樣性分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.2 17對(duì)引物的SRAP擴(kuò)增結(jié)果

由表3可知，17對(duì)引物共擴(kuò)增出條帶200條，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出條帶11.76條，其中差異帶有187條，13條條帶為所有南瓜品種所共有，多態(tài)性比例為93.5%。其中ME7EM1組合擴(kuò)增條帶數(shù)最多，達(dá)到17條，多態(tài)性為100%，見(jiàn)圖1。ME6EM9擴(kuò)增條帶數(shù)最少，為8條，差異帶有7條，多態(tài)性為87.5%。17對(duì)引物擴(kuò)增條帶的多態(tài)性，最高為100%，最低為77.78%。結(jié)果表明，南瓜種質(zhì)資源的遺傳多樣性很高，同時(shí)也表明了SRAP分子標(biāo)記能夠很好地檢測(cè)南瓜種質(zhì)資源的遺傳多樣性。

由表4可知，3個(gè)栽培種的種內(nèi)多態(tài)性高低順序?yàn)椋河《饶瞎?中國(guó)南瓜>美洲南瓜，分別為51.5%、 45%、31.5%。而種間兩兩多態(tài)性為：中國(guó)-印度南瓜為78.5%，中國(guó)-美洲南瓜為76%，印度-美洲南瓜為81.5%。

2.3 85份南瓜聚類(lèi)結(jié)果

基于SRAP數(shù)據(jù)通過(guò)Ntsys2.10e軟件計(jì)算出85南瓜資源的遺傳相似系數(shù)。85份南瓜遺傳相似系數(shù)在0.450 0～0.985 0，平均為0.7155。其中材料10與材料83的遺傳相似系數(shù)最?。?.450 0），說(shuō)明材料10與材料83的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。材料52與材料54的遺傳相似系數(shù)最大（為0.985 0），說(shuō)明材料52與材料54的親緣關(guān)系最近。

采用Ntsys2.10e軟件對(duì)85份南瓜資源親緣關(guān)系進(jìn)行SRAP分析。根據(jù)圖2可知，在遺傳相似系數(shù)為0.616 0處，可將南瓜分為3大類(lèi)，分別是中國(guó)南瓜、印度南瓜、美洲南瓜。親緣關(guān)系較近的是中國(guó)南瓜與美洲南瓜，2類(lèi)南瓜與印度南瓜的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

第一類(lèi)：中國(guó)南瓜（41份），包括密本南瓜特別種（1）、原種密本南瓜（2）、夷香密本（4）、密本南瓜（5）、密本南瓜（3）、密本南瓜（6）三明圓南瓜（26）、密本2號(hào)（11）、本地南瓜子（33）、大金鉤南瓜（14）、永定南瓜1號(hào)（28）、永定南瓜2號(hào)（29）、青豐金鉤南瓜（15）、無(wú)蔓一號(hào)（19）、新無(wú)蔓一號(hào)（20）、武夷山南瓜本地種3號(hào)（32）、廬豐安3（34）、密本南瓜（7）、密本南瓜（8）、密本南瓜王（9）、南瓜子（37）、無(wú)蔓一號(hào)（64）、金勾南瓜（49）、五月早南瓜（47）、 金密南瓜（48）、一串鈴一號(hào)南瓜（51）、金鉤南瓜（13）、三明長(zhǎng)南瓜（27）、武夷山南瓜本地種2號(hào)（30）、武夷山南瓜本地種1號(hào)（31）、黑密南瓜（57）、世龍金密南瓜（63）、圓形種（36）、密本南瓜（12）、江西農(nóng)家種（25）、庭院南瓜（16）、星早南瓜（17）、中夏南瓜1號(hào)（60）、中夏南瓜2號(hào)（61）、一串鈴1號(hào)南瓜（花皮）（44）、蜜棗南瓜（998）（45）。

第二類(lèi)：美洲南瓜（17份），有晶珠早南瓜（70）、美國(guó)綠丹（71）、西葫蘆早青一代（74）、新早青一代（75）、湘葫一號(hào)（76）、雪玉（85）、西葫蘆（77）、滿田雅綠（84）、金珠（82）、碧珠（78）、京珠（79）、京香蕉（80）、金榜（81）、京葫一號(hào)（83）、長(zhǎng)型南瓜（35）、晶瑩翠（72）、改良早青一代（73）。

第三類(lèi)：印度南瓜（27份），有日本南瓜（23）、甜面大南瓜（46）、日本紅栗（40）、短蔓紅栗（42）、密本南瓜（10）、巨型南瓜（18）短蔓紅（21）、短蔓紅（22）、進(jìn)口紅栗（41）、日本甜栗（38）、日本甜栗（39）、 日本南瓜（24）、 勝栗（52）、 君川金栗（54）、謝花面南瓜（56）、 黑蜜寶（53）、 黑冠軍（55）、 綠皮南瓜F1（62）、 李白（65）、 早熟京綠栗（66）、 紅板栗（67）、 韓香栗（68）、 迷你貝貝（58）、 臺(tái)友紅南瓜（59）、 短蔓京綠栗（43）、 紅栗南瓜（50）、 京銀栗南瓜（69）。

3 討論與結(jié)論

SRAP分子標(biāo)記在蔬菜[15-17]、花卉[18]、果樹(shù)[19]的親緣關(guān)系鑒定和遺傳多樣性分析上應(yīng)用廣泛，在南瓜上應(yīng)用不多。僅劉小俊等[13]利用SRAP分子對(duì)南瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果表明SRAP分子標(biāo)記將76份南瓜材料分為3大類(lèi)，分別是中國(guó)南瓜、美洲南瓜和印度南瓜。劉小俊等[8]應(yīng)用RAPD分子標(biāo)記對(duì)30份在中國(guó)栽培的南瓜進(jìn)行遺傳多樣性分析，分類(lèi)結(jié)果與其應(yīng)用SRAP標(biāo)記獲得的分類(lèi)結(jié)果一致。李俊麗等[9]對(duì)70份南瓜的遺傳多樣性進(jìn)行RAPD分析，結(jié)果將其分為3類(lèi)，分別是中國(guó)南瓜、印度南瓜、美洲南瓜，認(rèn)為親緣關(guān)系最近的是中國(guó)南瓜和美洲南瓜，但2類(lèi)南瓜與印度南瓜的關(guān)系較遠(yuǎn)。張?zhí)烀鱗12]對(duì)4個(gè)南瓜屬栽培種進(jìn)行AFLP分析，聚類(lèi)結(jié)果能夠?qū)?個(gè)栽培種分開(kāi)，且美洲南瓜與黑籽南瓜關(guān)系較近，兩者與中國(guó)南瓜的親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)，三者與印度南瓜的關(guān)系最遠(yuǎn)。趙福寬等[7]應(yīng)用RAPD分子標(biāo)記對(duì)76份南瓜進(jìn)行親緣關(guān)系分析，分類(lèi)結(jié)果與劉小俊等[13]、李俊麗等[9]的分類(lèi)結(jié)果一致，并認(rèn)為中國(guó)南瓜、印度南瓜、美洲南瓜3個(gè)栽培種的種間差異明顯。此外，肖祖梅[10]應(yīng)用RAPD和ISSR分子標(biāo)記對(duì)觀賞南瓜進(jìn)行遺傳多樣性分析，楊正安等[11]應(yīng)用ISSR和RAPD分子標(biāo)記對(duì)云南黑籽南瓜進(jìn)行親緣關(guān)系分析。除了應(yīng)用分子標(biāo)記對(duì)南瓜的親緣關(guān)系和遺傳多樣性進(jìn)行分析外，形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記和同工酶標(biāo)記在南瓜上也有應(yīng)用，如李俊麗[20]對(duì)70份南瓜資源的45個(gè)植物學(xué)性狀進(jìn)行鑒定，通過(guò)聚類(lèi)，將70份南瓜分為3大類(lèi)群，分別是中國(guó)南瓜、美洲南瓜和印度南瓜，且美洲南瓜與中國(guó)南瓜的親緣關(guān)系最近，印度南瓜與中國(guó)南瓜、美洲南瓜與印度南瓜的關(guān)系稍遠(yuǎn)。巴林[21]對(duì)南瓜F1代雜種的一價(jià)染色體和細(xì)胞二價(jià)染色體進(jìn)行比較，認(rèn)為中國(guó)南瓜和美洲南瓜的親緣關(guān)系最近，與印度南瓜的關(guān)系次之。孫正海等[22]對(duì)中國(guó)南瓜、美洲南瓜、印度南瓜的41個(gè)品種進(jìn)行過(guò)氧化物同工酶分析，聚類(lèi)分析表明中國(guó)南瓜和美洲南瓜親緣關(guān)系近，兩者與印度南瓜的關(guān)系較遠(yuǎn)。

本研究對(duì)100對(duì)SRAP引物進(jìn)行篩選，挑出17對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增條帶200條，其中差異帶187條，多態(tài)性比例為93.5%，表明所收集的南瓜種質(zhì)資源的遺傳基礎(chǔ)范圍較廣。從種間差異來(lái)看，印度-美洲南瓜>中國(guó)-印度南瓜>中國(guó)-美洲南瓜。從種內(nèi)差異來(lái)看，印度南瓜>中國(guó)南瓜>美洲南瓜，這一結(jié)果與孫正海等[22]對(duì)中國(guó)南瓜、美洲南瓜、印度南瓜的41個(gè)品種進(jìn)行過(guò)氧化物同工酶分析獲得的結(jié)果不一致，孫正海等[22]認(rèn)為中國(guó)南瓜種內(nèi)差異最大，印度南瓜種內(nèi)差異最小。通過(guò)聚類(lèi)分析，將收集的85份南瓜分為3大類(lèi)，分別是中國(guó)南瓜、印度南瓜、美洲南瓜，親緣關(guān)系較近的是中國(guó)南瓜和美洲南瓜，它們與印度南瓜的親緣關(guān)系則較遠(yuǎn)。分類(lèi)結(jié)果與劉小俊[8、13]、李俊麗[9]、張?zhí)烀鱗12]、趙福寬等[7]應(yīng)用RAPD、SRAP、AFLP分子標(biāo)記技術(shù)得到的結(jié)果一致，與形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記和同工酶標(biāo)記獲得的結(jié)果也一致。

由于市場(chǎng)上南瓜品種名稱(chēng)眾多，同名異物或異物同名的現(xiàn)象嚴(yán)重，加上地區(qū)間的引種頻繁，對(duì)育種工作造成困難。如本研究中，10號(hào)材料在種質(zhì)資源收集時(shí)，將其歸類(lèi)為中國(guó)南瓜，實(shí)驗(yàn)后，根據(jù)聚類(lèi)樹(shù)狀圖，發(fā)現(xiàn)其屬于印度南瓜，通過(guò)對(duì)其田間植株形態(tài)、果實(shí)外觀特征進(jìn)行觀察鑒定，確定其為印度南瓜。印度南瓜類(lèi)群中，52號(hào)勝栗與54號(hào)君川金栗2個(gè)品種名稱(chēng)不同，但兩者間的遺傳相似系數(shù)達(dá)到0.985 0，認(rèn)為二者是同一個(gè)品種，即同物異名。中國(guó)南瓜類(lèi)群中，1～9號(hào)材料、11號(hào)材料、12號(hào)材料均命名為密本類(lèi)南瓜，但相互間的遺傳相似系數(shù)存在差異，如1號(hào)材料與2號(hào)材料間遺傳相似系數(shù)最大為0.9800。1號(hào)與9號(hào)、12號(hào)，2號(hào)與9號(hào)、12號(hào)，3號(hào)與12號(hào)，4號(hào)與12號(hào)，5號(hào)與12號(hào)，6號(hào)與12號(hào)，9號(hào)與11號(hào)，11號(hào)與12號(hào)，這些材料間的遺傳相似系數(shù)均小于0.900，表明11個(gè)密本類(lèi)南瓜中并非都是密本南瓜，存在同名異物現(xiàn)象。

本研究通過(guò)SRAP分子標(biāo)記，揭示了南瓜種質(zhì)資源的遺傳多樣性，掌握了不同南瓜栽培種間的遺傳多態(tài)性和種內(nèi)多態(tài)性的情況，對(duì)所收集的南瓜進(jìn)行分類(lèi)，建立了遺傳聚類(lèi)圖，鑒定了品種間的親緣關(guān)系，為南瓜親本的選配和品種選育提供了理論依據(jù)

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