毛細(xì)管微萃取結(jié)合熒光光譜法快速測(cè)定全血中異丙酚含量的研究

李莉　王慶振

摘要 [目的]建立在毛細(xì)管微反應(yīng)器中快速萃取結(jié)合熒光光譜法測(cè)定全血中異丙酚含量的新方法。[方法]優(yōu)化的條件為：5 ml環(huán)己烷為萃取劑，1 ml甲醇為沉淀劑，萃取3 min。[結(jié)果]在優(yōu)化條件下異丙酚的平均萃取率大于99%，方法的線性范圍為0.05～10.00 μg/ml。日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2%。[結(jié)論]毛細(xì)管微反應(yīng)器萃取血樣中異丙酚的方法方便、可行。

關(guān)鍵詞 異丙酚；全血；毛細(xì)管微反應(yīng)器；萃取

中圖分類號(hào) S-03 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）19-023-02

異丙酚是一新型全身靜脈麻醉藥，因其起效迅速、作用短暫、復(fù)常良好且不良反應(yīng)少，麻醉過程平穩(wěn)、易于控制，其清除率高且有較高的脂溶性，連續(xù)長時(shí)間使用后并不出現(xiàn)藥物體內(nèi)明顯的蓄積[1-3]。這是一種較好的靶控輸注系統(tǒng)藥物。異丙酚在體內(nèi)代謝速度快，個(gè)體差異大，需要快速對(duì)異丙酚血藥濃度進(jìn)行監(jiān)測(cè)。異丙酚血液樣品的前處理方法主要有沉淀法、液-液萃取法及固相萃取法[4]，但操作繁瑣，不利于樣品的快速分析。建立快速異丙酚的前處理方法，對(duì)臨床用藥的安全、有效具有重要意義[5]。該研究利用在毛細(xì)管微反應(yīng)器中的螺旋運(yùn)動(dòng)[6-7]，在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)樣品的高效分配，分離后靜置，直接取樣分析，但目前涉及毛細(xì)管微反應(yīng)器中萃取方法尚未見報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 溶液配制 分別精密稱取3.12 g磷酸二氫鈉、7.16 g磷酸氫二鈉，用蒸餾水定容到 100 ml容量瓶，濃度均為0.2 mol/L。然后，量取0.2 mol/L磷酸二氫鈉51 ml和0.2 mol/L磷酸氫二鈉49 ml，混合，用pH計(jì)調(diào)節(jié)，配成pH 6.8緩沖液。

準(zhǔn)確稱取10 mg異丙酚，用甲醇溶解，并且定容至10 ml，配制成1 000 μg/ml 異丙酚儲(chǔ)備液。標(biāo)準(zhǔn)溶液由一定體積的儲(chǔ)備液稀釋制得。

1.2 樣品測(cè)定 試驗(yàn)裝置見圖1。首先從3號(hào)通道吸取 1 ml甲醇，注入集液瓶，其次從2號(hào)通道吸取 1.0 ml SD大鼠新鮮全血，然后從5號(hào)通道吸取1 ml磷酸鹽緩沖液，最后從4號(hào)通道吸取5 ml環(huán)己烷，在毛細(xì)管中混合，充分混合后從1號(hào)排出，靜置3 min，用微量進(jìn)樣器吸取上層有機(jī)層進(jìn)行熒光分析（狹縫 3 nm/5 nm，OR=3；激發(fā)波長λex=262 nm，發(fā)射波長λem=285 nm）。加標(biāo)樣品除在樣品中加入實(shí)量異丙酚外，其他步驟同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取條件優(yōu)化

2.1.1 萃取劑種類與用量。分別以環(huán)己烷、環(huán)己烷∶正丁醇（95∶5）各5 ml為萃取劑，以1 ml 甲醇為沉淀劑，研究它們對(duì)2.5 μg/ml異丙酚血樣萃取效果的影響。由表1可知，萃取劑對(duì)異丙酚血樣均有一定程度的萃取能力，相應(yīng)的萃取率分別為 100.8%、106.6%，RSD分別為9.8%、25.2%。環(huán)己烷∶正丁醇萃取率較高，但是RSD較高。因此，選擇環(huán)己烷作為萃取劑。然而，在保證環(huán)己烷對(duì)目標(biāo)物具有較好萃取率且降低環(huán)境毒性的條件下，其用量應(yīng)盡可能少。因此，考察環(huán)己烷用量 （3.5、4.0、5.0和6.0 ml）對(duì)異丙酚萃取的影響。結(jié)果表明，當(dāng)環(huán)己烷用量小于5.0 ml時(shí)，異丙酚的萃取率隨著環(huán)己烷用量的增加而大幅度增加；當(dāng)環(huán)己烷用量大于5.0 ml時(shí)，異丙酚的萃取率增加幅度較小。因此，環(huán)己烷的最佳用量為5.0 ml。

2.1.2 萃取時(shí)間。由表2可知，最佳萃取時(shí)間為3 min，平均萃取率為98.5%，RSD為16.8%。

2.1.3 毛細(xì)管的長度與直徑。由表3可知，最佳萃取長度為1.0 m，平均萃取率為100.2%，RSD為9.32%。與此同時(shí)，考察了毛細(xì)管直徑（0.762、1.000、0.508 mm）對(duì)異丙酚萃取率的影響。由表4可知，最佳萃取直徑為0.762 mm，平均萃取率為102.0%，RSD為4.07%。

2.1.4 蛋白沉淀劑的種類及用量。在保證蛋白質(zhì)具有較好沉淀效果且降低對(duì)環(huán)境污染的情況下，用量應(yīng)盡可能少。因此，考察甲醇用量（1.0 、2.0 、3.0 ml）對(duì)異丙酚萃取率的影響。結(jié)果表明，1.0 ml甲醇具有較好的萃取率。

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制異丙酚標(biāo)準(zhǔn)品的甲醇溶液（2.5 μl/ml），得到光譜圖。由圖2可知，異丙酚最大發(fā)射波長位于285 nm。將異丙酚標(biāo)準(zhǔn)液與新鮮加肝素的SD大鼠全血混合，配制成濃度分別為0.05、0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、10.00 μg/ml的樣品溶液，并按照“1.1”中的步驟測(cè)定其熒光強(qiáng)度。以異丙酚濃度為橫坐標(biāo)，以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，得回歸方程Y=13.576X+10.112，r=0.995 8，線性范圍為0.05～10.0 μg/ ml（表5）。

2.2.2 精密度試驗(yàn)。制備2.5 μg/ml異丙酚全血樣品，日內(nèi)測(cè)定3次，RSD為1.43%。由此可知，該方法精密度良好。

2.2.3 回收率。向1.0 ml新鮮加肝素空白全血中加入50 μl 60 μg/ml異丙酚注射乳劑甲醇溶液，使本底樣品濃度為3.00 μg；分別加入0.5、2.5、5.0 μg異丙酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并且按照“1.2”中的步驟測(cè)定其熒光強(qiáng)度。由表6可知，該方法的回收率良好。

2.3 與傳統(tǒng)液-液萃取方法的比較 由表7可知，該方法借助簡便的毛細(xì)管微反應(yīng)器對(duì)異丙酚進(jìn)行萃取，操作步驟簡單，萃取時(shí)間短，萃取率較高，為異丙酚生物樣品的在線前處理提供可能。

3 結(jié)論

異丙酚主要分布在全血中，血漿藥物濃度遠(yuǎn)低于全血藥物濃度，因此選用全血作為分析測(cè)試對(duì)象。該研究建立了一種操作簡便、萃取時(shí)間短、樣品萃取率高的全血樣品前處理方法，通過毛細(xì)玻璃管萃取后再加入蛋白沉淀劑，靜置，直接取樣分析。但是，濃度10%三氯乙酸甲醇溶液、濃度6%高氯酸甲醇溶液能夠破壞紅細(xì)胞，使得測(cè)定結(jié)果不能正確反映萃取結(jié)果，所以沉淀劑選用甲醇。

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