蛋白核小球藻無菌培養(yǎng)體系的建立

周琨　盧其能　岳明

摘要 [目的] 為了建立蛋白核小球藻無菌培養(yǎng)體系。[方法] 選取卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素、氨芐青霉素、潮霉素和頭孢霉素6種常用抗生素，比較蛋白核小球藻的除菌和純化效果。同時(shí)，對比蛋白核小球藻對不同濃度的卡那霉素和潮霉素的耐受性以及單獨(dú)使用卡那霉素和潮霉素的多次除菌效果。[結(jié)果] 卡那霉素和潮霉素對涂布帶菌藻液的抑菌和除菌效果明顯，其他4種抗生素的抑菌效果較差；小球藻對不同抗生素的耐受性不同，蛋白核小球藻對潮霉素敏感，50 mg/L就可以明顯抑制其的生長，而對卡那霉素的敏感性要低得多，在200 mg/L時(shí)其生長受到顯著抑制。[結(jié)論] 考慮到高濃度卡那霉素對蛋白核小球藻生長的抑制作用，最終確定用50 mg/L卡那霉素連續(xù)3次除菌處理的方式建立蛋白核小球藻的無菌培養(yǎng)體系；同時(shí)，測得純化培養(yǎng)的蛋白核小球藻藻液在685 nm處具有最大吸收峰，在此波長下小球藻的細(xì)胞濃度與吸光值呈線性相關(guān)，可用A685來估測蛋白核小球藻濃度。

關(guān)鍵詞 蛋白核小球藻；除菌；體系

中圖分類號(hào) S-3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）19-014-04

小球藻（Chlorella）是一種單細(xì)胞綠藻，屬真核藻類。我國常見的種類有蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）、橢圓小球藻（Chlorella ellipoidea）和普通小球藻（Chlorella vulgaris）等[1]。小球藻分布廣，光合效率高，易于培養(yǎng)，可快速繁殖和生長[2-3]，且細(xì)胞內(nèi)含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素和蝦青素等多種營養(yǎng)物質(zhì)，具有重要的營養(yǎng)和保健價(jià)值[4-6]。

微生物研究中一個(gè)重要的環(huán)節(jié)就是建立無菌培養(yǎng)體系。藻類也是如此。雜菌會(huì)給試驗(yàn)數(shù)據(jù)帶來誤差，甚至還會(huì)有假陽性結(jié)果[7]。蛋白核小球藻的細(xì)胞壁上極易吸附細(xì)菌，不易除去[8]。除菌與否能明顯影響小球藻的生長特點(diǎn)。從生長曲線來看，未除菌小球藻與除菌后小球藻的生長速度大致相同，在曲線達(dá)到穩(wěn)定期后它們的最大細(xì)胞密度相差不多。但是，未除菌小球藻在培養(yǎng)數(shù)天后少量細(xì)胞有下沉現(xiàn)象，還會(huì)黏附于培養(yǎng)設(shè)備的底部和側(cè)壁，不易被搖起，顏色會(huì)從綠色向黃色變化。而經(jīng)過除菌處理的小球藻經(jīng)過長時(shí)間的培養(yǎng)也很少有細(xì)胞下沉，搖動(dòng)時(shí)下沉的細(xì)胞易浮起，顏色一直呈現(xiàn)鮮綠，老化明顯延遲。這可能是因?yàn)槲皆谛∏蛟寮?xì)胞表面的細(xì)菌會(huì)分泌能促使藻細(xì)胞老化的物質(zhì)[9]。另外，在以特定波長的吸光度表示藻濃度時(shí)，細(xì)菌的存在還會(huì)給測定結(jié)果帶來正誤差。

研究表明，真核藻類細(xì)胞對多種常用抗生素不敏感，鏈霉素甚至可以促進(jìn)很多真核藻類細(xì)胞的生長[10-11]。通過選擇適當(dāng)?shù)目股?，利用小球藻與其雜菌對抗生素敏感性的差異，在不對小球藻的生長造成影響的情況下，殺死或抑制雜菌[12-13]。

為了獲得無菌的小球藻體系，選擇氨芐青霉素、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、頭孢霉素和潮霉素6種實(shí)驗(yàn)室常用抗生素，對比它們的除菌效果，再結(jié)合蛋白核小球藻對抗生素的敏感性，選擇適于蛋白核小球藻除菌的抗生素及其濃度。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藻種

蛋白核小球藻購于中科院水生生物研究所，編號(hào)為FACHB-9。

1.2 培養(yǎng)基及配制方法

1.2.1

液體培養(yǎng)基。BG-11培養(yǎng)基是藻類的通用培養(yǎng)基。1 L BG-11培養(yǎng)基中含硝酸鈉1.5 g、三水合磷酸氫二鉀3 mg、碳酸鈉20 mg、檸檬酸6 mg、檸檬酸鐵銨6 mg、乙二胺四乙酸1 mg、硼酸2.86 mg、四水合氯化錳1.81 mg、七水合硫酸鋅0.222 mg、

二水合鉬酸鈉0.29 mg、硫酸銅0.79 mg、六水合硝酸鈷0.049 2 mg、二水合氯化鈣36 mg、七水合硫酸鎂75 mg。各成分預(yù)先配制成儲(chǔ)備溶液，濃度為培養(yǎng)基中濃度的1 000倍，4 ℃儲(chǔ)存。儲(chǔ)備時(shí)，各取儲(chǔ)備液1 ml，定容至1 L，并調(diào)節(jié)pH至7，在121 ℃下滅菌25 min，冷卻，即得到BG-11培養(yǎng)基。

1.2.2 固體培養(yǎng)基。各取1 ml儲(chǔ)備溶液，并定容至1 L，稱取13 g瓊脂粉于培養(yǎng)基中，在充分混勻的狀態(tài)下調(diào)節(jié)pH至7，在121 ℃下滅菌25 min，趁熱分裝到12.5 cm培養(yǎng)皿中，并冷卻。

1.3 6種抗生素的除菌效果試驗(yàn)

將滅菌后的BG-11和濃度1.3%瓊脂培養(yǎng)基分裝到12.5 cm培養(yǎng)皿中，分別向其中加入6種抗生素，每種抗生素的濃度分別為50、100、200、400 mg/L，充分混勻后冷卻。

將蛋白核小球藻藻液均勻涂布在培養(yǎng)基表面后密封，放入光照培養(yǎng)箱中，在25 ℃、4 320 lx光照強(qiáng)度下培養(yǎng)10 d，記錄各培養(yǎng)皿中菌落數(shù)量。

1.4 蛋白核小球藻對潮霉素和卡那霉素的耐受性試驗(yàn)

將滅菌后的BG-11培養(yǎng)基分裝到250 ml三角瓶中，分別加入潮霉素和卡那霉素。每個(gè)抗生素組都包括50、100、200、400 mg/L 4種濃度。將蛋白核小球藻藻液按5%比例接種到培養(yǎng)基中，密封好后放入光照培養(yǎng)箱中，在25 ℃、4 320 lx光照強(qiáng)度下培養(yǎng)10 d后觀察。

1.5 潮霉素和卡那霉素多次除菌試驗(yàn)

將滅菌后的BG-11和濃度1.3%瓊脂培養(yǎng)基分裝到12.5 cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中的抗生素分別為50 mg/L潮霉素、50 mg/L卡那霉素和100 mg/L卡那霉素，充分混勻后冷卻。

將蛋白核小球藻藻液均勻涂布在培養(yǎng)基表面后密封，放入光照培養(yǎng)箱中，在25 ℃、4 320 lx光照強(qiáng)度下培養(yǎng)10 d，記錄各培養(yǎng)皿中菌落的數(shù)量。然后，將細(xì)菌接種到相同濃度抗生素的培養(yǎng)基中，如果沒有菌落則無需接種。將接種后的培養(yǎng)基以同樣的調(diào)節(jié)培養(yǎng)10 d，記錄各培養(yǎng)皿中菌落的數(shù)量。對于仍然有菌落出現(xiàn)的培養(yǎng)基，再重復(fù)上述操作。

1.6 藻液紫外-可見光譜的檢測

將除菌后的蛋白核小球藻藻液按5%比例接種到100 ml BG-11培養(yǎng)基中。在光照培養(yǎng)箱中以25 ℃、4 320 lx光照強(qiáng)度培養(yǎng)7 d，每天手搖3次。

移取3 ml藻液于1 cm比色杯中，以3 ml BG-11培養(yǎng)基為對照，掃描400～800 nm波長范圍內(nèi)藻液的紫外-可見光譜。

1.7 蛋白核小球藻繁殖時(shí)藻液pH的變化

將除菌后的蛋白核小球藻藻液接種到500 ml BG-11培養(yǎng)基中（按5%接種），在光照培養(yǎng)箱中以25 ℃、4 320 lx培養(yǎng)20 d，每天手搖3次。在培養(yǎng)期間，每天取5 ml藻液至試管中，測定藻液pH。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種抗生素對蛋白核小球藻的除菌效果

為了獲得純化的蛋白核小球藻體系，必須選擇合適的抗生素進(jìn)行殺菌或抑菌。為此，選擇卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素、氨芐青霉素、潮霉素和頭孢霉素6種實(shí)驗(yàn)室常用抗生素，分別考察不同濃度對蛋白核小球藻的除菌效果。

蛋白核小球藻在含有50～400 mg/L抗生素的固體培養(yǎng)基表面生長10 d后，共出現(xiàn)3種菌落，分別為橘紅色的細(xì)菌菌落、表面粗糙的白色菌落和透明的水泡狀菌落。含頭孢霉素的固體培養(yǎng)基較多出現(xiàn)橘紅色菌落，含鏈霉素和慶大霉素的培養(yǎng)基表面也有橘紅色菌落生長，但個(gè)數(shù)少于含頭孢霉素的培養(yǎng)基。表面粗糙的白色菌落多出現(xiàn)在含頭孢霉素和鏈霉素的固體培養(yǎng)基表面，而在卡那霉素培養(yǎng)基表面略少一些。透明的水泡狀菌落較多地出現(xiàn)在鏈霉素培養(yǎng)基表面。

由表1可知，在6種抗生素中，鏈霉素、慶大霉素和氨芐青霉素對蛋白核小球藻藻液的除菌效果較差，濃度在400 mg/L時(shí)仍有菌落，在50 mg/L時(shí)菌落數(shù)量多于20個(gè)，不適宜用來單獨(dú)除菌。頭孢霉素與氨芐青霉素的抗菌譜相似，故數(shù)據(jù)接近，且頭孢霉素對蛋白核小球藻的除菌效果略好于氨芐青霉素。潮霉素和卡那霉素的除菌效果較明顯，卡那霉素在400 mg/L時(shí)培養(yǎng)基表面沒有菌落，潮霉素在200、400 mg/L時(shí)培養(yǎng)基表明沒有菌落，卡那霉素和潮霉素在低濃度時(shí)菌落數(shù)量也低于其他4種抗生素。因此，可以初步確定潮霉素或卡那霉素單獨(dú)使用作為蛋白核小球藻除菌的抗生素。

2.2 蛋白核小球藻對潮霉素和卡那霉素的耐受性

盡管潮霉素和卡那霉素都能夠達(dá)到除菌目的，但還必須考慮到蛋白核對它們的耐受情況。為此，分別考察了濃度為50、100、200、400 mg/L的潮霉素和卡那霉素對液體培養(yǎng)情況下小球藻的影響。

由圖1可知，蛋白核小球藻在含有50～400 mg/L抗生素的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d后，藻液顏色隨卡那霉素濃度的增加而明顯變淺，當(dāng)卡那霉素濃度為200和400 mg/L時(shí)藻液已經(jīng)基本無色，與最右邊空白對照組相比差別不大。當(dāng)卡那霉素濃度為50和100 mg/L時(shí)，藻液呈現(xiàn)一種介于黃色和綠色之間的顏色，表明在此濃度下卡那霉素對蛋白核小球藻也有一定的影響。

由圖2可知，當(dāng)潮霉素濃度為50 mg/L時(shí)藻液已經(jīng)接近無色，而當(dāng)高于50 mg/L時(shí)溶液顏色與空白組沒有明顯差異，說明蛋白核小球藻對潮霉素較敏感，50 mg/L潮霉素已經(jīng)可以明顯抑制蛋白核小球藻的生長。無論是50 mg/L潮霉素還是100或200 mg/L卡那霉素都不能使BG-11+1.3%瓊脂培養(yǎng)基表面不出現(xiàn)菌落，因此還必須研究卡那霉素或潮霉素的多次除菌效果。

2.3 卡那霉素和潮霉素多次除菌效果

由表1可知，50 mg/L潮霉素、100和200 mg/L卡那霉素已對小球藻的生長產(chǎn)生抑制作用，而在這些濃度水平下，一次除菌處理不能使固體培養(yǎng)基表面不出現(xiàn)菌落。因此，設(shè)計(jì)了卡那霉素和潮霉素多次除菌試驗(yàn)。由表2可知，50 mg/L潮霉素和50、100 mg/L卡那霉素經(jīng)過3次除菌處理后固體表面培養(yǎng)基均無菌落出現(xiàn)?？紤]到高濃度卡那霉素對蛋白核小球藻生長的抑制作用，最終確定用50 mg/L卡那霉素連續(xù)3次除菌處理的方式建立蛋白核小球藻的無菌培養(yǎng)體系。

經(jīng)過上述除菌方法處理的蛋白核小球藻，再經(jīng)5次傳代培養(yǎng)（按10%接種，各代培養(yǎng)10 d），培養(yǎng)方式為BG-11培養(yǎng)基、25 ℃、日平均光照強(qiáng)度4 320 lx、每日手搖3次，徹底消除殘留抗生素影響，然后將藻液涂布在LB+濃度1.3%瓊脂固體培養(yǎng)基表面，在搖床中培養(yǎng)5 d（37 ℃，無光照），發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基表面無菌落出現(xiàn)，說明蛋白核小球藻培養(yǎng)液內(nèi)無細(xì)菌存在。通過以上試驗(yàn)，成功地建立了小球藻的無菌培養(yǎng)體系。

2.4 蛋白核小球藻藻液的紫外-可見光譜

藻液濃度通常有兩種表示方法：一是計(jì)數(shù)，二是以合適波長下A值作為濃度的參考。與計(jì)數(shù)相比，A值更加簡便迅速，因此需要檢測蛋白核小球藻藻液的紫外-可見光譜以確定最佳檢測波長。

由圖3可知，在波長掃描范圍400～800 nm，從紫外區(qū)到500 nm范圍內(nèi)呈現(xiàn)一個(gè)寬而高的吸收帶，在600～800 nm區(qū)間內(nèi)有一個(gè)明顯的波谷，出現(xiàn)在640 nm附近，最高峰出現(xiàn)在685 nm，在650 nm處還有一個(gè)較明顯的肩峰。

呂旭陽等[14]研究表明，在450～700 nm波長下，小球藻細(xì)胞濃度與藻液吸光度之間均表現(xiàn)為極顯著的線性相關(guān)，可以通過測定藻液吸光度，然后通過對應(yīng)的直線回歸方程換算出培養(yǎng)液的藻細(xì)胞濃度。因此，確定A685表示藻細(xì)胞濃度。

2.5 蛋白核小球藻繁殖時(shí)藻液pH的變化

培養(yǎng)基pH能影響小球藻的生長。研究表明，小球藻在pH為10左右的堿性環(huán)境下生長最快，在中性環(huán)境下雖然也能生長，但接種后有很長的遲緩期。 小球藻的生長也會(huì)影響到藻液pH的變化，表現(xiàn)為：

小球藻生長會(huì)利用培養(yǎng)基中的NO-3，NO-3被吸收進(jìn)細(xì)胞的同時(shí)伴隨有H+的共轉(zhuǎn)運(yùn)，使得藻液pH上升。這個(gè)上升過程是有限度的，H+濃度的降低會(huì)抑制吸收，同時(shí)培養(yǎng)基中的消耗也會(huì)抑制這個(gè)過程，達(dá)到平衡時(shí)pH保持穩(wěn)定。由圖4可知，藻液的pH隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而增大，在起始BG-11培養(yǎng)基的pH不同的情況下藻液最終的pH都穩(wěn)定在11。

王逸云[7]研究發(fā)現(xiàn)，以f/2培養(yǎng)基培養(yǎng)一種海水小球藻（Chlorella sp. MACC/C95），藻液最終的pH穩(wěn)定在10左右。兩者的差異除了藻種的不同，還可能因?yàn)榕囵B(yǎng)基配方中緩沖體系的差異以及NaNO3含量不同，BG-11培養(yǎng)基中NaNO3含量為1.5 g/L，而1 L f/2培養(yǎng)基中只含有NaNO3 74.8 mg。這意味著在BG-11培養(yǎng)基中，藻細(xì)胞可以吸收更多的H+，最終pH也略高一些。

3 結(jié)論

使用卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素、氨芐青霉素、潮霉素和頭孢霉素6種抗生素用于蛋白核小球藻的除菌和純化效果比較。研究表明，卡那霉素和潮霉素對涂布帶菌藻液的抑菌和除菌效果明顯，其他4種抗生素的抑菌效果較差；小球藻對不同抗生素的耐受性不同，蛋白核小球藻對潮霉素敏感，50 mg/L就可以明顯抑制其生長；而對卡那霉素的敏感性要低得多，在200 mg/L時(shí)其生長才顯著受到抑制；考慮到高濃度卡那霉素對蛋白核小球藻生長的抑制作用，最終確定用50 mg/L卡那霉素連續(xù)3次除菌處理的方式建立蛋白核小球藻的無菌培養(yǎng)體系；同時(shí)，測得純化培養(yǎng)的蛋白核小球藻在685 nm處具有最大吸收峰，在此波長下小球藻的細(xì)胞濃度與吸光值呈線性相關(guān)，可用A685來估測蛋白核小球藻濃度。

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