不同甜瓜品種再生體系的比較研究

付秋實 譚明明 王燁 王懷松

摘要：以不同基岡型的甜瓜品種為材料，研究了不同激素組合，AgNO3質(zhì)量濃度以及基因型對甜瓜再生的影響。結(jié)果表明，不定芽誘導中最適宜的激素組合為MS+1.0mg-Lˉ6-BA+0.5mg-LˉABA（脫落酸），在此培養(yǎng)基上薄皮甜瓜‘IVF501和‘IVF509的不定芽誘導率分別為88.00%、79.60%，厚皮甜瓜‘IVF525和‘IVF604的不定芽誘導率分別為76.50%、74.75%。不同質(zhì)量濃度的AgNO3對甜瓜不定芽分化的影響有差異，1.0mg·Lˉ1AgNO3有抑制愈傷組織分化的作用，能有效減少玻璃化的發(fā)生，當質(zhì)量濃度為2.0mg-Lˉ1時，雖然明顯地抑制了愈傷組織分化，但同時降低了不定芽分化率。溥皮甜瓜‘IV F'501與厚皮甜瓜‘IVF525具有較高的不定芽誘導率，將誘導的不定芽轉(zhuǎn)入伸長培養(yǎng)基中（MS+6-BA0.05mg-Lˉ1），分化的不定芽能夠伸長長大，在生根培養(yǎng)基中（MS+IAA0.4mg·Lˉ3容易生根。薄皮甜瓜獲得完整再生植株需50—60d，厚皮甜瓜獲得完整再生植株需60—75d。

關(guān)鍵詞：甜瓜；離體再生；脫落酸（ABA）；硝酸銀（AgNO3）

甜瓜（Cucumis melo L.）是世界重要的經(jīng)濟作物。植物組織培養(yǎng)技術(shù)是植物細胞工程和基因工程的關(guān)鍵技術(shù)之一。甜瓜高效再生體系的建立是遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)。在甜瓜組織培養(yǎng)方面，日前已有通過真葉、子葉、下胚軸等多種外植體再牛完整植株的報道。

添加ABA（脫落酸）是多種難以再生植物組織培養(yǎng)的有效措施。前人以子葉作外植體，6-BA為主要誘導激素，輔之以ABA，通過器官直接發(fā)生途徑，建立了不同基因型黃瓜子葉的再牛體系。李泠等報道，ABA在黃瓜再生中起到了重要的作川，與激動素相配合能促進植株分化，并能抑制異常胚狀體形成，促進正常胚狀體的發(fā)生。AgNO3（硝酸銀）是乙烯活性抑制劑，Bleecker&Kende認為，AgNO3是以競爭性作用于乙烯作用部位而促進器官和體細胞胚胎發(fā)生，其作用主要表現(xiàn)為抑制愈傷組織形成，增加外植體產(chǎn)生不定芽的數(shù)量及提高植株再生頻率。周音等研究表明，加入2.0mg-Lˉ1AgNO3還可有效防止生菜玻璃苗的產(chǎn)生。這在其他植物離體培養(yǎng)中也已得到證實。但是關(guān)于ABA以及AgNO3對甜瓜再生影響的研究鮮有報道，并且再生潛力也依基因型不同而明顯不同。我國有豐富的甜瓜種質(zhì)資源，本試驗以不同基因型的甜瓜品種為材料，對影響再生的主要因素進行探討，以期為瓜類作物快速繁殖、種質(zhì)資源保存和創(chuàng)新等提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1材料

供試材料為薄皮甜瓜‘IVF501與‘IVF509，厚皮甜瓜‘IVF525與‘IVF604，均由中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所甜瓜課題組選育。

1.2方法

1.2.1 無菌苗的獲得選取飽滿種子，用無菌水浸泡5—6 h，然后將甜瓜種子去殼，經(jīng)70%乙醇表面消毒30s，無菌水沖洗2～3次，再用2%（w）NaCl0滅菌15min，無菌水沖洗3—5遍次，用無菌濾紙吸干，平放接種于不加生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上，置于溫度為26℃、光強30～40μmol·mˉ2sˉ1、每天光照時間14h的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，3～7d后，子葉開始變綠，胚根伸長，獲得無菌苗?；九囵B(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，蔗糖30g-Lˉ1，瓊脂7g·Lˉ1，pH5.8。

1.2.2 激素質(zhì)量濃度篩選 甜瓜品種選用‘IVF501，激素選用6-BA與ABA。待無菌苗子葉剛剛轉(zhuǎn)綠時，從距離胚軸約2mm處剪下2片子葉，再橫切為兩部分，取近胚軸半片做外植體，葉背向培養(yǎng)基，葉面向上，分別接種于6-BA（1.0、1.5、2.0mg·Lˉ1）與ABA（O、0.5、1.0 mg·Lˉ1）不同質(zhì)量濃度組合的培養(yǎng)基中，共9個處理，每皿接種9—11塊外植體，每個處理20皿，30d后統(tǒng)計愈傷組織誘導率與不定芽誘導率.

愈傷組織誘導率/%=愈傷組織數(shù)量/外植體總數(shù)量×100：

不定芽誘導率/%=誘導出芽的外植體數(shù)量/外植體總數(shù)量×100。

1.2.3不同品種對不定芽誘導率與分化率的影響甜瓜品種選用‘IVF501、‘IVF509、‘IVF525、‘IVF604。根據(jù)1.2.2的試驗結(jié)果，選出不定芽誘導與分化率較高的激素組合，將4個不同品種的子葉外植體接種于此培養(yǎng)基上，共4個處理，每皿接種9—11塊外植體，每個處理20皿，30d后統(tǒng)計愈傷組織誘導率與不定芽誘導率。

1.2.4添加AgNO3對不定芽誘導與分化的影響甜瓜品種選用‘IVF501、‘IVF509、‘IVF525、‘IVF604。在MS+1.0mg.L-16-BA+0.5mg.L-1ABA培養(yǎng)中，添加0、1.0、2.0mg·Lˉ1AgNO3，共12個處理，每皿接種8～10塊外植體，每個處理6皿，30d統(tǒng)計愈傷誘導率與不定芽誘導率。

1.2.5 不定芽伸長 由試驗篩選出再生率較高的1個薄皮甜瓜品種‘IVF501與1個厚皮甜瓜品種‘IVF525。將在誘導培養(yǎng)基上分化出不定芽的外植體切成小塊，轉(zhuǎn)至MS+0.05 mg -Lˉ16-BA的不定芽伸長培養(yǎng)基上，1周后切下單芽，繼代1次，15d觀察有效苗的獲得情況。

1，2.6生根甜瓜材料選用‘IVF501與‘IVF525，激素選用IAA。當芽長伸長至2—3cm時，選取健壯整齊的無根苗，用解剖刀白基部切下，轉(zhuǎn)至MS+0.4mg-Lˉ1LAA的生根培養(yǎng)基中，15d觀察獲得有效生根苗的情況。

2結(jié)果與分析

2.1激素質(zhì)量濃度篩選

由表1可以看出，對于甜瓜品種‘IVF501，不定芽的誘導和分化與6-BA和ABA兩種激素配比密切相關(guān)，較低質(zhì)量濃度的ABA與適宜質(zhì)量濃度的6-BA配比，有較高的芽分化率。6-BA是甜瓜子葉分化的必需生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，當6-BA質(zhì)量濃度為1.0 mg·Lˉ1時，不定芽的誘導率最高，隨著6-BA質(zhì)量濃度的升高，疏松愈傷組織分化加快，當6-BA質(zhì)量的濃度為2.0mg-Lˉ1時，芽成簇生狀，不利于單個芽的繼續(xù)分化。低質(zhì)量濃度ABA對不定芽誘導與分化有促進作用，高質(zhì)量濃度時則有抑制作用，當6-BA質(zhì)量濃度為1.0mg·Lˉ1時，0.5mg·Lˉ1ABA較小添加ABA不定芽誘導率提高12.5%。MS+1.0nlg·L-16-BA+0.5mg·Lˉ1ABA的芽分化率最高為89.OO%、

2.2不同品種對不定芽誘導率與分化的影響

由表2可以看出，在MS+1.0mg·L-16-BA+0.5mg·L-1ABA培養(yǎng)基中，不同甜瓜品種的不定芽誘導與分化率不同，‘IVF501、‘IVF509、‘IVF525、‘IVF604的不定芽誘導率分別為88.OO%、79.60%，、76.50%、74.75%，愈傷組織誘導率分別為43.00%、46.27%、50.50%、54.55%。薄皮甜瓜‘IVF501、‘IVF509的不定芽誘導率明顯高于厚皮甜瓜‘IVF525、‘IVF604，但愈傷組織誘導率低于厚皮甜瓜.薄皮甜瓜‘IVF501與厚皮甜瓜‘IVF525具有較高的不定芽誘導率。

2.3 AgNO3對不定芽誘導與分化的影響

由表3可以看出，在MS+1.0mg·L-16-BA+0.5mg·L-1ABA培養(yǎng)基中，添加1.0mg·L-1AgNO3有抑制愈傷組織分化的作用，減少了玻璃化的發(fā)生 當質(zhì)量濃度為2.0mg·L-1時，雖明顯的抑制了愈傷組織分化，但同時降低了不定芽分化率，并且玻璃化現(xiàn)象嚴重。當AgNO3質(zhì)量濃度為1.0mg·L-1時，‘IVF501、‘IVF509、‘IVF525、‘IVF604的不定芽誘導率分別為76.27%、68.96%、63.46%、22.22%。因此1.0mg·L-1AgNO3對不定芽誘導與分化較適宜。

2.4不定芽伸長與生根

如圖l所示，將外植體上的叢生或單芽切下，接種到MS+0.05mg·L-16-BA培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，叢生芽現(xiàn)在培養(yǎng)基伸長1周，再切下單芽，繼代培養(yǎng)，繼續(xù)伸長，15d左右，不定芽伸長2—3cm待無根苗長到2～3cm時，白基部切下，轉(zhuǎn)接到MS+0.4mg·L-1IAA培養(yǎng)基上，誘導生根。生根效果好。薄皮甜瓜獲得完整再生植株需50—60d，厚皮甜瓜獲得完整再生植株需60～75d。

圖l 不定芽伸長與生根

（A）5VF501不定芽伸長；（B）‘IVF525小定芽伸長；（C）‘VF501在生根培養(yǎng)基中生根；（D）‘IVF525在生根培養(yǎng)基中牛根。

3 討論與結(jié)論

植物離體組織培養(yǎng)中，不定芽再生頻率與植物基因型、外植體類型及生長調(diào)節(jié)劑配比等因素有關(guān)。6-BA是甜瓜再生分化的關(guān)鍵物質(zhì)本試驗rft不定芽誘導最適6-BA質(zhì)量濃度為1.0mg·L-1。在誘導不定芽的增殖生長中，加入較高質(zhì)量濃度的6-BA，雖然對芽的分化有促進作用，但是容易產(chǎn)生叢芽，這與孫天國等的研究結(jié)果一致。因此在繼代過程中適當降低細胞分裂素質(zhì)量濃度對芽的正常生長是有利的。

本試驗中ABA對甜瓜子葉的芽分化有促進作用，6-BA和ABA的不同配比影響甜瓜子葉不定芽的分化，不定芽誘導中最適宜的激素組合為MS+ABA0.5mg·L-1+6-BAl.0mg·L-1，在此培養(yǎng)基上能正常分化的不定芽較多并明顯伸長，不定芽的生長較快（表2，圖1）。添加ABA是多種難以再生卡植物組織培養(yǎng)的有效措施，應(yīng)用到黃瓜組培上也獲得相似的結(jié)果。梅茜和張興國研究表明，在培養(yǎng)基中添加ABA可明顯提高黃瓜的芽再生能力，且以1.0mg· L-1為最適宜，如果不添加ABA，則很難產(chǎn)生不定芽.Sekioka等的研究表明在黃瓜的組織培養(yǎng)中，低質(zhì)量濃度的ABA（O.1mg·L-1）促進胚狀體的正常發(fā)育，而高質(zhì)量濃度的ABA（ 1.0mg·L-1）能顯著減少培養(yǎng)物的愈傷組織，并控制胚狀體處于球形胚或球形胚后期，這與王秀紅等的研究結(jié)果一致。

本試驗中不同濃度的AgNO3對甜瓜不定芽分化的影響有差異，1.0mg·L-1AgNO3有抑制愈傷組織分化的作用，能有效的減少玻璃化的發(fā)生，當質(zhì)量濃度為2.0mg·L-1時，雖明顯地抑制了愈傷組織分化，但同時降低了不定芽分化率，并且玻璃化現(xiàn)象嚴重，這與前人的研究結(jié)果一致。AgNO3對植物形態(tài)發(fā)生具有促進作用，但其作用機理尚不十分清楚?？赡艿脑蚴侵参锝M織和細胞在離體培養(yǎng)時易產(chǎn)生乙烯并逐漸積累，乙烯積累可使培養(yǎng)物生長分化受到影響或毒害。Kevers等研究認為玻璃苗的產(chǎn)生與培養(yǎng)容器中的乙烯變化有明顯關(guān)系，玻璃化組織的外植體將ACC轉(zhuǎn)化為乙烯的能力也比對照高。Ag+是一種較好的乙烯活性抑制劑，培養(yǎng)基中添加AgNO，能有效抑制乙烯形成，減少或消除乙烯對細胞生長的不利影響。有的學者認為AgNO3是競爭性地作用于乙烯作用部位而促進器官發(fā)生，提高細胞的再生能力的。

不同甜瓜品種的不定芽誘導與分化率不同，‘IVF501、‘IVF509、‘IVF525、‘IVF604的不定芽誘導率分別為88.00%、79.60%、76.50%、74.75%（表2）薄皮甜瓜‘IVF501、‘IVF509的誘導率明顯高于厚皮甜瓜‘IVF525、‘IVF604，說明薄皮甜瓜冉生能力強于厚皮甜瓜。因此基因型對這種再生能力的獲得可能有決定性的影響。只有進行大量的試驗才能篩選出具有較好培養(yǎng)效果的基因型二本試驗中將誘導的不定芽轉(zhuǎn)入伸長培養(yǎng)基中（MS+6-BA0.05mg·L-1），分化的不定芽能夠伸長長大，在生根培養(yǎng)基中（MS+IAA0.4mg·L-l）容易生根 薄皮甜瓜獲得完整再生植株需50～60d，厚皮甜瓜獲得完整再生植株需60～75d。