瓜菜類植物花粉超低溫保存研究進(jìn)展

劉 林 曹春信 劉新華

摘要：超低溫保存是指在-80℃～-196℃甚至更低溫度下保存生物材料的一種方法?；ǚ郯锓N的所有基因類型，作為植物種質(zhì)的重要形式，是種質(zhì)保存和交換以及雜交育種的重要材料。花粉超低溫保存廣泛應(yīng)川于瓜菜、農(nóng)作物、果樹(shù)、藥用植物及園林植物等各類植物：花粉超低溫保存能大大延長(zhǎng)花粉的保存時(shí)問(wèn)，為種質(zhì)交換提供便利，同時(shí)能解決育種中花期不遇或異地授粉等問(wèn)題，提高育種效率。闡述了花粉超低溫保存的技術(shù)流程，對(duì)花粉保存效果的評(píng)價(jià)方法進(jìn)行了總結(jié)，探討了超低溫保存的遺傳穩(wěn)定性，同時(shí)介紹了超低溫保存機(jī)理的研究進(jìn)展，以期為進(jìn)一步研究瓜菜類植物花粉超低溫保存提供參考。

關(guān)鍵詞：瓜菜類植物；種質(zhì)資源；花粉；超低溫保存

花粉是植物種質(zhì)的重要形式之一，它包含該物種的所有基因類型，是種質(zhì)保存和交換以及雜交育種的重要材料。在育種或制種過(guò)程中常常遇到親本花期不遇或異地授粉，如能提前保存花粉，延長(zhǎng)花粉壽命，無(wú)疑能很好地克服這一困難。

超低溫保存是指在-80℃（干冰溫度）～-196℃（液氮溫度）甚至更低溫度下保存生物材料的一種力‘法超低溫保存一般以液氮為冷源，在如此低的溫度下，植物材料中參與新陳代謝的各種生物酶的活性受到極大抑制，生物體新陳代謝基本停止，處于“假死”狀態(tài)。經(jīng)過(guò)“假死”狀態(tài)的生物材料能保持細(xì)胞正常的活性，并且遺傳物質(zhì)不發(fā)生變異。

1922年Knowlton報(bào)道將金魚(yú)草（Antirrhinummajus）花粉在-180℃貯藏后仍具有一定的萌發(fā)率，這是有關(guān)花粉超低溫保存最早的報(bào)道。20世紀(jì)80年代以來(lái)，關(guān)于花粉超低溫保存的研究日漸興起，日本、美國(guó)、中國(guó)及印度等國(guó)家相繼建立了花粉超低溫保存庫(kù)。國(guó)內(nèi)外已實(shí)現(xiàn)花粉超低溫保存的植物種類涉及農(nóng)作物、果樹(shù)、園林植物、蔬菜、經(jīng)濟(jì)作物、藥用植物以及牧草等幾大類?；ǚ鄢蜏乇４婕夹g(shù)能大大延長(zhǎng)花粉的壽命，如水稻、紫菜苔、辣椒、芍藥、番茄等花粉經(jīng)長(zhǎng)期超低溫保存后依然具有較強(qiáng)的生活力，一些其他植物花粉甚至能保存10a（年）以上。

花粉超低溫保存是種質(zhì)資源保存的重要方式，與其他保存方法相比，其具有操作簡(jiǎn)單、占用空間小、保存成本低、安全穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)在育種實(shí)踐和生產(chǎn)中，花粉超低溫保存能夠很好地克服花期不遇或花時(shí)不遇、異地授粉及父本種植面積大等問(wèn)題。

1 花粉超低溫保存的基本程序

1.1 花粉的采集

花粉采集受到植物花粉產(chǎn)量、散粉特性以及環(huán)境因子的影響。通常情況下，蟲(chóng)媒花花粉粒體積較大、花粉量少，采集較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，風(fēng)媒花花粉粒小，花粉量多，較易采集。不同植物的開(kāi)花習(xí)性不同，但大多數(shù)植物在上午的散粉量最大。環(huán)境因子對(duì)花藥開(kāi)裂和散粉有很大影響，如開(kāi)花前氣溫偏高，則花藥會(huì)提前開(kāi)裂。花粉采集選擇在天氣晴好的上午效果最好，雨天或雨后花藥含水量太高且花粉易吸水脹裂，影響花粉生活力。采集花粉時(shí)可以根據(jù)花序開(kāi)花順序、花冠顏色、花藥位置等信息采摘花藥即將開(kāi)裂的花朵，然后置于具有篩網(wǎng)的容器中通風(fēng)干燥，篩出散落的花粉。

1.2花粉的干燥

花粉含水量是決定花粉超低溫貯藏成功與否的關(guān)鍵因素。不同植物花粉都有其超低溫保存的適宜含水量。張保才等認(rèn)為辣椒花粉超低溫保存適宜含水量為14.O%，此含水量的干燥花粉超低溫貯藏1a后還能保持新鮮花粉一半的生活力，而未經(jīng)干燥處理的辣椒花粉超低溫貯藏30 d后生活力基本喪失：水稻超低溫保存適宜含水量為13.24%，此時(shí)花粉田間授粉結(jié)實(shí)率達(dá)65%，且含水量在5.8%—29.6%的花粉經(jīng)超低溫保存后授粉均能結(jié)實(shí)，花粉含水量過(guò)高或過(guò)低均導(dǎo)致花粉超低溫保存后授粉活性喪失。玉米最適宜超低溫保存的含水量為11.3%～14.7%，未經(jīng)干燥處理的花粉含水量高達(dá)53.3%，直接超低溫保存導(dǎo)致其完全喪失授粉活性。無(wú)論是超低溫貯藏還是低溫貯藏，維持適宜的含水量是保持花粉正?；钚缘那疤?。魔芋花粉真空干燥后可在-20℃下長(zhǎng)期保存，保存la后的花粉田間授粉率可達(dá)23.63%。陳宗光等研究發(fā)現(xiàn)西瓜花粉在低溫（4℃）干燥（RH25%）條件下保存，前8d坐果率可達(dá)新鮮花粉的73%。宋紅霞等以胡蘿卜花粉為材料，試驗(yàn)結(jié)果同樣也表明干燥貯藏有利于保持花粉的生活力。從目前的研究結(jié)果來(lái)看，花粉含水量多少是決定超低溫保存成敗的關(guān)鍵因素，含水量過(guò)高，投入液氮時(shí)易在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶，使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到機(jī)械損傷導(dǎo)致細(xì)胞死亡；含水量過(guò)低，也會(huì)影響花粉活性。花粉干燥常用的方法有室內(nèi)陰干法、干燥劑干燥法、白熾燈照射法等，均能獲得較好的效果。

1.3預(yù)凍處理

大量研究表明預(yù)凍處理和化凍處理對(duì)超低溫保存后的花粉活性影響較大，液氮對(duì)植物細(xì)胞和組織的傷害主要發(fā)生在冰凍和化凍這兩個(gè)過(guò)程中，趙樹(shù)仁等研究結(jié)果表明-25℃預(yù)凍處理30min能顯著提高番茄花粉超低溫保存后的萌發(fā)率。時(shí)婷婷等認(rèn)為百合花粉超低溫保存以-20℃預(yù)凍處理30min效果最好。湯青林等認(rèn)為預(yù)凍處理可提高甘藍(lán)花粉保存效果，且-20℃預(yù)凍處理效果最佳，萌發(fā)率達(dá)38.17%。王玉萍以馬鈴薯花粉為材料，發(fā)現(xiàn)0、-20℃預(yù)凍處理的花粉其相對(duì)活力與不經(jīng)預(yù)凍處理的對(duì)照組間差異不顯著，而經(jīng)0℃（12h）→-10℃（12h）→-20℃（12h）程序降溫處理的花粉活力高于對(duì)照。也有報(bào)道稱預(yù)凍處理對(duì)花粉超低溫保存效果沒(méi)有顯著影響。尚曉倩等f(wàn)吲研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)凍處理后的花粉超低溫保存效果反而較直接投入液氮的保存效果差。造成預(yù)凍處理效果差異大的主要原因與花粉含水量不同和植物材料種類差異有關(guān)。劉燕等認(rèn)為，決定是否進(jìn)行預(yù)凍處理由花粉含水量決定，當(dāng)花藥含水量較高時(shí)，經(jīng)預(yù)凍處理的花粉保存效果好于直接投入液氮的，這可能因?yàn)轭A(yù)凍處理后細(xì)胞內(nèi)的水分向細(xì)胞間隙移動(dòng)，細(xì)胞質(zhì)的可溶性物質(zhì)濃度升高，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)冰點(diǎn)降低，而當(dāng)材料含水量較低時(shí)，直接投入液氮保存效果較好，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)的水來(lái)不及結(jié)冰，直接達(dá)到玻璃化狀態(tài)。

1.4化凍處理

化凍也是花粉超低溫保存的重要環(huán)節(jié)。在化凍過(guò)程中要避免細(xì)胞內(nèi)的次生結(jié)冰，同時(shí)要防止化凍吸水對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生的滲透沖擊。冰晶在-3—-50℃的溫度范圍內(nèi)最容易形成和生長(zhǎng)，這個(gè)溫度區(qū)間稱之為超低溫傷害的“危險(xiǎn)溫度區(qū)”，材料溫度處于這一溫度區(qū)間時(shí)細(xì)胞內(nèi)的自由水可能發(fā)生同核結(jié)晶，但這些微小冰晶并不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生傷害，此時(shí)如果解凍速度太慢，使材料長(zhǎng)時(shí)間處于這一溫度區(qū)間，更多的自由水就會(huì)以同核結(jié)晶形成的微小冰晶為結(jié)晶核而發(fā)生重結(jié)晶，直接導(dǎo)致冰晶變大引起傷害。比較番茄花粉在23℃水浴、37℃水浴、0℃水沖洗和自來(lái)水沖洗4種不同解凍方法對(duì)超低溫保存的花粉活力的影響，發(fā)現(xiàn)自來(lái)水沖洗效果較為理想。劉燕等采用室溫、自來(lái)水沖洗和溫水浴3種化凍方式對(duì)梅花花粉進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)自來(lái)水沖洗和溫水浴化凍效果較好。以百合花粉為材料，采用不同的化凍方法對(duì)花粉萌發(fā)率進(jìn)行研究，結(jié)果表明40℃水浴化凍后花粉的萌發(fā)率極顯著高于室溫化凍和4℃冰箱緩慢化凍。王玉萍研究表明，不同化凍方法對(duì)馬鈴薯花粉超低溫保存有明顯影響，-20℃（12h）→4℃（12h）→25℃（12h）梯度解凍花粉活力最高，35～40℃水浴解凍次之。

2 花粉生活力檢測(cè)

花粉生活力檢驗(yàn)方法主要有染色法、離體萌發(fā)法及田問(wèn)授粉法等?；ǚ廴旧ㄖ饕新然交牡蛉旧ǎ═TC法）、聯(lián)苯胺染色法等。氯化三苯基四氮唑是一種氧化還原染料，它的氧化態(tài)是無(wú)色的，活細(xì)胞的脫氫酶可以將TTC還原為紅色的三苯甲潛（TTF）。聯(lián)苯胺染色法是根據(jù)花粉中過(guò)氧化物酶的活性來(lái)判斷花粉的活性，具有生活力的花粉含有活躍的過(guò)氧化物酶，該酶與所用試劑發(fā)生氧化反應(yīng)而產(chǎn)生顏色，根據(jù)顏色可知花粉有無(wú)活性？花粉離體萌發(fā)法是測(cè)定花粉活力的常用方法，由于其檢測(cè)效果較為準(zhǔn)確，廣泛用于各種植物花粉活性檢測(cè)。測(cè)定時(shí)配制一定濃度的培養(yǎng)基（基本成分為蔗糖和硼酸），在人工控制條件下培養(yǎng)一段時(shí)間，然后在顯微鏡下觀察花粉的萌發(fā)，根據(jù)花粉發(fā)芽率的高低衡量花粉生活力大小?；ǚ郯l(fā)芽的標(biāo)準(zhǔn)以花粉管伸長(zhǎng)超過(guò)花粉直徑為準(zhǔn)?；ǚ垭x體萌發(fā)法準(zhǔn)確度高，但操作相對(duì)復(fù)雜，且花粉萌發(fā)易受培養(yǎng)基配方的影響而導(dǎo)致結(jié)果與實(shí)際不完全相符。田間授粉法是衡量花粉生活力最直接最具實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的方法，但其比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，還易受到外界環(huán)境如病蟲(chóng)害、機(jī)械損傷的影響。

3 超低溫保存遺傳穩(wěn)定性

理論上，花粉在超低溫保存過(guò)程中其細(xì)胞新陳代謝與生長(zhǎng)發(fā)育近乎完全停止，處于“假死”狀態(tài)，因而花粉遺傳性狀不會(huì)發(fā)生改變。大多數(shù)研究表明，超低溫保存不會(huì)產(chǎn)生表型特征的變化。Mou-kadiri等以水稻超低溫保存后的愈傷組織為材料，發(fā)現(xiàn)超低溫保存后的再生后代植株的表型性狀沒(méi)有發(fā)生變異、石思信等以超低溫保存1—2a的玉米花粉為材料，發(fā)現(xiàn)后代植株田間農(nóng)藝性狀、染色體數(shù)日和結(jié)構(gòu)以及過(guò)氧化物酶同工酶和醇溶蛋圖譜都沒(méi)有異常。通過(guò)各種分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)超低溫保存12個(gè)月的袋鼠花（Anigozanthos flavidus）的莖尖基因組DNA進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其遺傳穩(wěn)定性良好，基因組沒(méi)有發(fā)生遺傳變異。Crisp等對(duì)花椰菜花粉超低溫保存農(nóng)藝性狀的研究巾發(fā)現(xiàn)，花粉冷凍前后結(jié)實(shí)率沒(méi)有差異，其后代性狀沒(méi)有表現(xiàn)出基因型的改變。陳芳等利用AFLP技術(shù)分析小麥超低溫保存前后基因組DNA序列的變化，發(fā)現(xiàn)樣品處理前后帶型一致，未檢測(cè)到明顯帶型差異進(jìn)一步利用MSAP技術(shù)分析了樣品超低溫保存前后基因組甲基化水平，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)超低溫保存后樣品發(fā)生了甲基化變異，且以脫甲基化為主何艷霞等研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥超低溫保存對(duì)材料甲基化狀態(tài)有影響，有新產(chǎn)生的甲基化也有脫甲基化，且脫甲基化是主要趨勢(shì)?；蚪M甲基化水平對(duì)于維持基因組的穩(wěn)定性和基因表達(dá)具有重要作用，其水平過(guò)高或過(guò)低，都會(huì)導(dǎo)致植物生長(zhǎng)發(fā)育異常，且這種特征仃時(shí)可以連續(xù)遺傳很多代。

4超低溫保存機(jī)理研究

4.1 膜系統(tǒng)與超低溫保存

細(xì)胞膜既維持細(xì)胞穩(wěn)定代謝的胞內(nèi)環(huán)境，義洲控物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞?！澳ぶ嘧兝浜Α奔僬f(shuō)認(rèn)為，在低溫脅迫下，植物生物膜首先從液品相變?yōu)槟z相，膜收縮產(chǎn)生孑L道或龜裂，質(zhì)膜的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，導(dǎo)致質(zhì)膜透性不同程度增大，膜內(nèi)離子和溶質(zhì)大量向外滲，細(xì)胞內(nèi)外離子平衡遭到破壞，研究認(rèn)為，V-ATPase是各種膜結(jié)合酶中對(duì)低溫最敏感的，在10℃以下，其亞基解聚或酶分子處于松散狀態(tài)，活性降低甚至完全失活。以超低溫保存后的芍藥花粉為材料，發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞膜透性在超低溫保存后均顯著增加，且隨保存時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞膜透性持續(xù)L升。

4.2細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)與超低溫保存

植物在低溫脅迫下，細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)如可溶性糖、氨基酸、蛋白質(zhì)等發(fā)生急劇變化，通過(guò)可溶物質(zhì)積累來(lái)響應(yīng)低溫脅迫?？扇苄蕴亲鳛闈B透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以增加細(xì)胞滲透壓，提高細(xì)胞的保水能力，還可以降低細(xì)胞質(zhì)冰點(diǎn)，防止細(xì)胞質(zhì)凝膠凝固。劉燕在對(duì)玻璃化超低溫保存擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，糖的轉(zhuǎn)變量對(duì)幼苗耐液氮凍存起到了一定的作川

通常情況下，植物體內(nèi)的游離氨基酸維持在一個(gè)較低的水平，而在低溫脅迫下，游離氨基酸大量積累。游離氨基酸既能增加細(xì)胞液的濃度，又能提高原生質(zhì)的保水能力及膠體的穩(wěn)定性。在游離氨基酸中，脯氨酸與植物抗寒性密切相關(guān)。脯氨酸的疏水吡咯烷環(huán)能與蛋白質(zhì)分子的疏水區(qū)結(jié)合，而親水基團(tuán)分布于表面，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)的可溶性。

可溶性蛋白與植物抗冷性密切相關(guān)。多數(shù)研究者認(rèn)為，較高的可溶性蛋白含量有利于提高植物的抗冷性。可溶性蛋白具有較強(qiáng)的親水性能，能夠增強(qiáng)細(xì)胞的持水能力。尚曉倩在對(duì)芍藥花粉可溶性蛋白含量進(jìn)行測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，超低溫保存后其可溶性蛋白含量顯著上升。

4.3 植物抗氧化酶系統(tǒng)與超低溫保存

活性氧（ROS）是一類具有較高化學(xué)反應(yīng)活性的氧衍生物，包括超氧物陰離子白由基（O2ˉ）、羥自由基（·OH）、過(guò)氧化氫（H2O2）等。ROS能引起植物體內(nèi)大分子物質(zhì)如脂類、蛋白質(zhì)及DNA的損傷。植物抗氧化酶系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶（SOD）、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPX）及過(guò)氧化氫酶（CAT）等。低溫脅迫能激發(fā)植物抗氧化酶系統(tǒng)，從而提高植物的耐冷性。

4.4抗凍蛋白與超低溫保存

抗凍蛋白（antifreeze proteins，AFPs）是低溫生物為適應(yīng)極端寒冷而產(chǎn)生的一種多肽或糖肽，它能直接和冰晶形成相互作用的蛋白質(zhì)。最初它是從極區(qū)海魚(yú)中發(fā)現(xiàn)的，至今在細(xì)菌、真菌、昆蟲(chóng)和植物中均有發(fā)現(xiàn)。AFPs以非依數(shù)性形式降低水溶液的冰點(diǎn)，但對(duì)熔點(diǎn)影響甚微，將這種水溶液的熔點(diǎn)和冰點(diǎn)之間出現(xiàn)的差值稱為熱滯活性（thermal hystere-sis activitV，THA）。 AFPs在植物中既能抑制冰的重晶化，又能減緩冰晶的生長(zhǎng)速度或降低結(jié)冰水的百分比。1992年，Griffith等首次報(bào)道獲得植物內(nèi)生AFP，他們?cè)谀軌蛉淌芗?xì)胞外結(jié)冰的冬黑麥中發(fā)現(xiàn)了內(nèi)源AFP，并從冬黑麥葉片的質(zhì)外體中提取并純化了該蛋白。1994年，我國(guó)學(xué)者費(fèi)云標(biāo)等從沙冬青葉片中分離到了AFP。1998年，第1個(gè)AFPs基因從胡蘿卜中分離到，標(biāo)志著首個(gè)AFP基因克隆成功。此后，冬黑麥具有幾丁質(zhì)酶活性的抗凍基因CHT9和CHT46、歐白英AFPs基因sthp-64等相繼被克隆。

5 問(wèn)題與展望

目前，花粉超低溫保存技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于各種農(nóng)作物、瓜菜、園藝作物和中草藥等植物。從研究對(duì)象來(lái)看，主要集中在農(nóng)作物和果樹(shù)上，對(duì)花卉和觀賞植物研究較少。目前花粉超低溫保存主要集中在對(duì)適宜含水量、預(yù)凍處理和化凍處理方式等的研究上，尚未建立標(biāo)準(zhǔn)化的超低溫保存操作流程，而且對(duì)超低溫保存遺傳穩(wěn)定性和凍存機(jī)理研究較少。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展，各學(xué)科相互滲透，推進(jìn)了花粉超低溫保存研究的不斷深入。盡管植物花粉進(jìn)行超低溫保存的條件不同，甚至同種植物不同品種間也具有較大差異，這使超低溫保存在大規(guī)模實(shí)際應(yīng)用中存在困難，但花粉超低溫保存具有巨大的應(yīng)用價(jià)值，尤其是在保護(hù)珍稀瀕危植物種質(zhì)資源，解決育種中花期不遇、異地授粉以及減少父本種植面積上將發(fā)揮重要作用。