高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中恩諾沙星、環(huán)丙沙星和諾氟沙星

王洋 李媛媛 王寒冰 李瀅倩 王瀟

摘 要：建立飼料中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）測定方法。試樣用磷酸鹽緩沖溶液提取，經(jīng)固相萃取小柱凈化，氮氣吹干后用溶解待測。采用LC-MS/MS測定，色譜柱為C8反相色譜柱，流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，電噴霧正離子模式電離，多反應(yīng)選擇離子檢測（MRM），外標(biāo)法定量。結(jié)果表明方法可用于飼料中恩諾沙星、環(huán)丙沙星和諾氟沙星的同時測定。。

關(guān)鍵詞：飼料；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；恩諾沙星；環(huán)丙沙星；諾氟沙星；多反應(yīng)監(jiān)測 【中圖分類號】TS214.2 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星屬于喹諾酮類藥物，由于其具有抗菌譜廣、殺菌活性強(qiáng)、毒副作用小及敏感微生物的最小抑菌濃度低等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于各種動物感染性疾病的預(yù)防和治療。但有一部分生產(chǎn)者將其應(yīng)用到飼料產(chǎn)品中，起到抑菌殺菌的作用。如果動物食用這種飼料會造成一定的危害，產(chǎn)生耐藥性或一些毒副作用。因此，建立快速準(zhǔn)確地測定飼料中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星的方法，對于加強(qiáng)飼料產(chǎn)品監(jiān)管具有重要意義。

本文建立的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）快速準(zhǔn)確地測定飼料中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星的方法，可滿足檢測要求，為飼料產(chǎn)品監(jiān)督檢驗提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Agilent 1200LC/-6410B MS液相色譜/串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（安捷倫科技有限公司）；BS224S電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；HYQ-2110液體混勻器（蘇州捷美電子有限公司）；KQ-250DE超聲波發(fā)生器（昆山市超聲儀器有限公司）；Microfuge離心機(jī)（美國BECKMAN公司）。

恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品，純度>98%（美國SIGMA公司）；乙腈、甲酸為色譜純（Burdick&Jackson公司）；無水乙醇（分析純，天津市化學(xué)試劑有限公司）；樣品購自本地超市。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精確稱取恩諾沙星、環(huán)丙沙星和諾氟沙星0.005g于50mL容量瓶中，然后用甲醇溶解并稀釋至刻度，于冰箱4℃以下避光保存。用流動相液將恩諾沙星、環(huán)丙沙星和諾氟沙星儲備液液稀釋成10μg/mL的工作液。

1.2.2 樣品處理

稱取試樣0.5g（精確至0.1mg）于50mL具塞離心管中，準(zhǔn)確加入6mL磷酸鹽緩沖溶液，渦旋混勻，再加入10mL乙腈，于渦旋振蕩器振蕩提取1min，5000r/min離心5min，上清液過濾到雞心瓶中，在殘渣中加入5mL磷酸鹽緩沖溶液，10mL乙腈，重復(fù)以上步驟，合并上清液，于50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，至乙腈全部蒸出。加入5mL磷酸鹽緩沖溶液，混勻。

固相萃取小柱先用5mL甲醇、5mL水和5mL磷酸鹽緩沖溶液活化，保持柱體濕潤。將樣液以1mL/min的流速全部過HLB固相萃取小柱，待液體完全流出后，先后以4mL水，4mL甲醇水溶液淋洗，抽干，用4mL氨水甲醇溶液洗脫于10mL具刻度離心管中，洗脫液于50℃，氮吹至約0.2mL時停止?jié)饪s，用甲醇-甲酸溶液定容至1mL，5000r/min離心5min，過0.2μm濾膜，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。

1.2.4 儀器參數(shù)和測定條件

液相色譜條件：C8反相色譜柱（C82.1mm×50mm id，5μm）；柱溫：30℃；流速：0.5mL/min；進(jìn)樣量：5μL；流動相：乙腈-0.1%甲酸水溶液（15+85）。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI）；正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；噴霧壓力：35psi；干燥氣流速：8mL/min；離子化溫度：340℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取方法的選擇

喹諾酮類藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)中有羧基和哌嗪基，屬于酸堿兩性化合物，在酸性和堿性溶液中有較好的溶解性。因此嘗試用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行提取，此時待測物以負(fù)離子形式存在，過固相萃取小柱后就富集在了小柱上，然后再用酸化甲醇進(jìn)行洗脫[1-4]。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

在一定的流動相條件下，喹諾酮類藥物在小粒徑的C18色譜柱上都有較好的保留，選擇實驗室常用的C8柱（50mm×2.1mm）。應(yīng)用反相色譜條件時，LC-MS/MS分析方法應(yīng)用的有機(jī)相主要為甲醇和乙腈，喹諾酮類藥物在甲醇中的信號要比在乙腈中高，選用乙腈作為有機(jī)相時，待分析組分的色譜行為較好。實驗發(fā)現(xiàn)甲酸的加入會抑制其信號，甲酸體積分?jǐn)?shù)越高抑制信號越嚴(yán)重，但考慮到能夠改善峰形，使待測物與內(nèi)源性物質(zhì)充分分離，所以選擇了0.1%的甲酸作為水相（見圖1）。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

對質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，盡可能的使待測物響應(yīng)信號達(dá)到最高。在優(yōu)化過程中比較恩諾沙星在正、負(fù)兩種離子化方式的響應(yīng)值，發(fā)現(xiàn)正離子化效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于負(fù)離子，正離子響應(yīng)值高，因此選擇了正離子掃描方式。采用Product掃描的方式選擇特征離子，逐步加大誘導(dǎo)碰撞能量，隨著母離子的豐度逐漸減少，子離子的豐度逐漸增加，分別選用豐度最大的兩個子離子作為定量和輔助定性離子，并確定其最佳碰撞能量值，在Product方式中進(jìn)一步調(diào)整碰撞能量，以便獲得最大靈敏度（見表1，圖2-4）。

2.4 線性與檢出限

取陰性樣品，依次加入適量待測物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜設(shè)定條件下分別進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值為縱坐標(biāo)，工作溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對樣品進(jìn)行定量，恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星檢出限為10μg/kg。

2.5 方法的回收率和精密度

根據(jù)GB/T 5009.1-2003，我們選取1種空白飼料樣品，分別加入50μg/kg水平的三種喹諾酮藥物，按照樣品處理方法及相同的色譜條件下，進(jìn)行回收率的測定，每個樣品重復(fù)3次，計算出每個添加水平的回收率（結(jié)果見表2）。

3 結(jié)論

本文建立了飼料中恩諾沙星、環(huán)丙沙星和諾氟沙星的高效液相色譜—串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用測定方法，該法具有樣品處理簡單、測定周期短等優(yōu)點，適用于大量樣品的快速篩選、測定。

參考文獻(xiàn)

[1] 謝東華，俞雪鈞，殷居易，倪梅林.高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測烤鰻中環(huán)丙沙星[J].理化檢驗-化學(xué)分冊，2008（44）5：402-408.

[2] 張翠英，徐金玲，王雪芹，安華民.超高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法檢測鹽酸洛哌丁胺膠囊中混入諾氟沙星的研究[J].中國藥房，2008（19）7：537-539.

[3] 崔相勇，張鳳清，周長民，王巖松，鐘啟智.高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定豆芽中恩諾沙星含量[J].食品科學(xué)，2012（33）20：180-183.

[4] 李小玲，黃向榮，萬譯文，陳湘藝.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定水產(chǎn)品中諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星[J].中國漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，2013（3）4：25-30.