人源Tau蛋白截短片段轉基因果蠅模型的建立

耿俊華

摘要：人Tau蛋白是一種主要的細胞骨架蛋白，由Tau蛋白組成的神經纖維纏結是阿爾茨海默病的兩大病理特征之一，C末端缺失的Tau已經證實是神經纖維纏結的組份之一，體內體外實驗已經證實，Tau蛋白可以是多種蛋白酶的水解底物。但是，Tau蛋白水解產生的截短片段在阿爾茨海默病中的作用目前還不清楚。為了能夠在在體水平研究Tau蛋白截短片段的毒性機制，將Tau蛋白截短成不同的截短片段：Taul-44、Tau45-441、Tau45-230、Tau231-441 利用顯微注射的方法構建Tau基因截短片段的轉基因果蠅，并利用果蠅中的UAS/GAL4系統(tǒng)驅動截短的Tau蛋白片段在果蠅的眼睛中異位表達，該實驗結果發(fā)現(xiàn)在果蠅眼睛中過表達Tau蛋白截短片段并沒有對果蠅眼睛的發(fā)育造成明顯的毒性，從而推斷Tau蛋白水解是機體的一種自我保護機制。關鍵詞：阿爾茨海默??；Tau蛋白：轉基因果蠅中圖分類號：Q291

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847（2015）02-0095-05Establishment of Transgenic Drosophila Overexpressing the Truncated Fragments of Human TauGENG Jun-hua（The Key Laboratory of Cell Proliferation and Regulation Biology， Ministry of Education， Beijing Normal University，Beijing 100875， China）Abstract：Human Tau is a microtubule-associated protein， which comprises intracellular neurofinrillary tan— gles（NFTs）， one of pathological features in Alzheimers disease （AD）. It has been reported that C-terminally truncated Tau is a constituent of NFTs. It also has been demonstrated that Tau can be hydrolyzed by different proteases in vivo and in vitro. But the roles of Tau fragments in AD are still unknown. To study the neurotoxicity of tau in vivo， different truncated fragments of tau gene including Tau 1-44，Tau45-441， Tau45-230 and Tau23 1-441 were constructed. These plasmids were microinjected to Drosophila to generate transgenic model of human truncated tau. Driven by UAS/GAL4 system， these different fragments of tau were eclopically expressed in Drosophila eyes， the results show that tau fragments dont have significant toxic to the development of Drosophila eyes， which suggests the hydrolysis of Tau protein as a self-protective mechanism of the organism.Key words： Alzheimers disease； Tau protein； transgenic Drosophila.（Life Science Research， 2015， 19（2）： 095?099）

阿爾茨海默?。ˋlzheimeis disease，AD）是一種神經退行性疾病，其主要病理的特征有：神經細胞內的神經元纖維纏結（NFTs）；神經細胞外的淀粉樣斑塊，又稱老年斑（SP）；大量神經細胞的凋亡、喪失等[1]。NFTs的豐要組成成份即是Tau蛋白[2]，Tau蛋白參與到阿爾茨海默病的作用機制日前還不清楚。

在阿爾茨海默氏癥病人的腦脊液中存在Tau蛋白的截短片段[3、4]。體外實驗也證明Tau蛋白的水解產物參與到細胞的凋亡過程中。Park等用Aβ處理AD小鼠的原代培養(yǎng)神經元，可以激活神經元細胞中的Calpain，水解Tau產生17kD的Tau蛋白片段，并誘導原代培養(yǎng)神經元細胞的凋亡[5]。Amadoro等將Tau蛋白截短成大小不同的截短片段，并把這些片段轉染到小腦顆粒細胞中，用MTT的方法證實了Tau蛋白的一些截短片段對細胞具有毒性作用，并認為這種毒性作用是通過NMDA受體來介導的[6]。

為了能夠在在體水平闡述Tau蛋白截短片段的毒性機制，我們選用果蠅作為模式生物，依據(jù)Tau蛋白潛在的Calpain水解位點將Tau蛋白截短成不同的截短片段[6、7]：Tau1-44、Tau45-441、Tau45-230和Tau231-441，構建Tau基因截短的轉基因果蠅，利用UAS/Gal4系統(tǒng)特異性地將Tau蛋白的截短片段表達在果蠅眼睛中，觀察Tau蛋白截短片段對果蠅眼睛發(fā)育的影響。1材料與方法1.1實驗材料

W1118果蠅和pGMR-CAL4A果蠅；大腸桿菌DH15α；各種限制性內切酶、T4 DNA連接酶、DNA聚合酶等購自大連TaKaRa公司；蛋白胨、酵母提取物和瓊脂粉等?；噭┵徸员本翕郎锕荆荒z回收試劑盒購自杭州Axygen公司；質粒中抽提試劑盒購自德國Qiagen公司；PVDF膜（美國Millipore公司）、Western顯色試劑（美國Millipore公司）、c-Myc單抗（美國Sigma公司）、Tau蛋白單抗5A6 （DSHB）和Tau蛋白的多抗H150（美國Santa Cruz公司）；引物合成和質粒測序由上海英駿生物技術有限公司完成。1.2實驗方法1.2.1質粒的構建

用PCR的方法從T40質粒上分段擴增目的基因。PCR所用引物見表1，引物5'端加上了酶切位點和保護堿基，以便用于進行基因克隆（其中pUAST-taul-44的質粒由周洵提供）。

按產品說明書配制PCR反應液（組分詳見產品說明書），并且按產品說明書方法設置PCR反應參數(shù)，如下：

1. 95℃，4 min

2. 95℃，0.5 min

3. 58℃，0.5 min

重復30個循環(huán)、

4. 72℃，1 min/kb

5. 72℃，10 min

6. 24℃，Hold

PCR反應結束后，用PCR同收試劑盒對PCR產物進行回收，并對PCR產物進行雙酶切回收，使用T4 DNA連接酶將擴增片段克隆至載體pUAST中，再用熱激法將連接后的重組質粒轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，過夜培養(yǎng)，挑取菌落，提取質粒酶切鑒定并送公司測序。1.2.2顯微注射

配制顯微注射液（20 μL）：4×Injection Buffer5 μL；Helper DNA（△2-3），終濃度0.2 g/L；P因子載體，終濃度0.6 g/L；加ddH2O至20μL，顯微注射緩沖液（5 mmol/LKCl，0.1 mmol/LNaH2PO4，pH6.8）。于顯微注射前2d將100～200只W1118果蠅置于蘋果培養(yǎng)基上開始適應，每天換2次培養(yǎng)基，直至注射前30 min換上一塊新鮮的蘋果培養(yǎng)基平板，收集這段時間W1118果蠅產的卵，用50%的漂水去除卵殼，洗凈，將卵呈線性排列，并且注意所有卵頭尾方向一致硅膠干燥8 min，在倒置顯微鏡下將灌好顯微注射液的注射針插入處理后的果蠅卵尾端極細胞處（將來要發(fā)育成果蠅生殖腺的部位）。將注射后的果蠅卵放在瓊脂培養(yǎng)基卜，放置于溫度為25℃濕度為60%～70%的環(huán)境中24～36h，等待幼蟲孵化。1.2.3轉基因果蠅篩選、平衡及定位

將在24～36h之間挑幼蟲，轉移至果蠅玉米培養(yǎng)基，平均每40只幼蟲放一個瓶子，置于25℃培養(yǎng)，這段時間幼蟲逐漸結繭并羽化。及時挑出羽化的果蠅成蟲雄蠅和雌蠅分別與W1118 品系的處女蠅和雄蠅按1：3的比例間交，置于25℃培養(yǎng)，約12d后可觀察其子代，挑取紅眼轉基因果蠅。由于mini-white標記基因的表達可使W1118果蠅眼色從白變橘紅，因此可以通過觀察子代的眼色有沒有變化，即可得知目的基因有沒有整合入果蠅基因組且處于可表達的區(qū)域。得到的轉基因果蠅品系必須經平衡、定位，便于品系的穩(wěn)定保存及進一步研究。平衡、定位的具體操作步驟如圖1所示。1.2.4 果蠅基因組DNA提取及轉基因果蠅的PCR鑒定

每個轉基因果蠅品系各取1只果蠅成蟲置于-20℃處死，然后加200 μL溶液A，將果蠅成蟲充分勻漿：65℃水浴30 min；加400μL溶液B，蓋好管蓋顛倒混勻數(shù)次（勿劇烈震蕩），冰浴10 min；離心（12000g，15 min），收集約500μL上清至一新管；加300μL異丙醇，顛倒混勻，室溫放置2 min；離心（12000g，15min），棄上清；加70%乙醇1mL洗沉淀一次，棄上清，風干白色沉淀；加20μLddH2O溶解后用作PCR反應模板。

溶液A：100 mmol/LTris-HCl（pH 7.5），100mmol/L， EDTA（pH 8.0），100 mmol/L NaCl，0.5%（W/V）SDS；溶液B：1.437 5mol/L KOAc，2.275 mol/L Li-C1PCR反應體系及反應條件見1.2.1，待PCR反應終止，電泳檢測。1.2.5果蠅雜交及果蠅眼睛總蛋白的提取將轉基因果蠅品系與pGMR-GAL4品系交配，使Tau基因特異性地在果蠅的眼睛中表達。取果蠅頭部約50個放入EP管中置冰上；加入100μL，RlPA buffer，在冰上將果蠅頭部研磨至粉碎；離心（13000√min，4℃，15 min）后取上清60μL至一新管；在上述上清液中加入2μL 4×loading buffer，沸水浴8 min；離心，加樣或4℃保存樣品。Western-blot檢測Tau蛋白的截短片段在果蠅眼部的表達情況，確定Tau蛋白的截短片段在果蠅眼部有表達后，再用掃描電子顯微鏡觀察果蠅眼睛表型的變化情況。1.2.6掃描電鏡觀察果蠅眼睛表型取果蠅頭部約20個立即放入4%戊二醛中4℃固定過夜，用PBST洗滌3次后，將樣品分別置于30%、50%、70%、95%、100%乙醇中順序脫水，每個步驟15 min，隨后將樣品干燥、鍍金，用場發(fā)射掃描電鏡（Hitachi SU70）觀察果蠅眼睛表型。2實驗結果2.1轉基因果蠅質粒的構建本實驗利用PCR的方法從T40質粒上分別擴增Tau基因的截短片段。為了能夠方便Tau蛋白的檢測，在質粒構建的過程中首先將編碼人Tau蛋白截短片段的基因克隆到pCMV-Myc的載體中，再用PCR擴增的方法將myc標記連接到Tau蛋白截短片段的N端，將PCR的產物連接入pUAST載體中，凝膠電泳鑒定轉基因果蠅質粒構建成功（圖2）。pUAST-myc-tau45-230重組質粒的酶切鑒定電泳圖1：DL15000；2：質粒pUAST酶切結果，作為陰性對照；3-6：泳道為質粒pUAST-myc-tau45-230酶切結果；7：DL2000（B） pUAST-myc-tau231-441重組質粒的酶切鑒定電泳圖1：DL15000；2：質粒pUAST酶切結果，作為陰性對照；3-6：質粒pUAST-myc-tau231-441酶切結果；7：DL2000。（C）pUAST-myc-tau45-441。重組質粒的酶切鑒定電泳圖1：DL15000；2：為質粒pUAST酶切結果，作為陰性對照；3-6：為質粒pUAST-myc-tau45-441酶切結果；7：DL2000。2.2人tau基因截短片段過表達轉基因果蠅的建立

用顯微注射的方法將帶有目的片段的pUAST質粒注射到果蠅胚胎中。P因子的特征序列是載體pUAST的核心結構，它位于目的基因的上下游，轉基因過程是在重組酶A2-3的幫助下完成，A2-3重組酶可以特異性地作用于P因子，將位于其內部的外源基因整合人果蠅基因組中，以達到構建轉基因果蠅的目的。

將重組的含有Tau基因pUAST載體與Helper質粒（可表達重組酶A2-3）配制成顯微注射液注射到果蠅胚胎中，并在其下一代中篩選轉基因果蠅建系。當轉基因果蠅平衡建系后，提取轉基因果蠅基因組DNA作模板，PCR鑒定轉基因果蠅的建立是否成功（圖3）。2.3pGMR-GAL4驅動Tau基因截短片段的過表達

在果蠅眼部表達目的基因，如果目的蛋白對細胞有毒性，這種毒性作用會被放大到果蠅的整個復眼，果蠅的眼睛會變得粗糙，小眼的排列也變得雜亂無章[8]。這就是為什么在果蠅的過表達研究中，越來越多的人傾向于用pGMR-GAL4特異地驅動目的基因在果蠅眼睛中表達，以此來研究目的蛋白的毒性。本實驗用pGMR-GALA驅動Tau基因截短片段在果蠅眼部特異性的表達，直觀地觀察Tau蛋白截短片段對果蠅發(fā)育過程的影響（圖4）。本實驗觀察到GFP在果蠅眼睛中過表達對果蠅眼睛的發(fā)育沒有毒性作用（圖4B），Tau蛋白在果蠅眼睛中過表達對果蠅眼睛發(fā)育的毒性作用是Tau蛋白本身的特性，同時說明果蠅的眼睛為我們研究Tau蛋白的毒性提供一個很好的系統(tǒng)。掃描電鏡的結果顯示在果蠅眼睛中過表達Tau蛋白截短片段對果蠅眼睛的發(fā)育造成的毒性沒有全長Tau蛋白的毒性明顯。

隨后，我們提取果蠅頭部總蛋白，檢測Tau蛋白在眼睛中的表達情況。Western blotting結果見圖5，每種轉基因果蠅都選擇4株來驗證目的蛋白的表達情況。但是，我們在蛋白水平沒有檢測到Taul-44的表達。3討論

正向遺傳學是將基因突變或缺失，使其功能喪失或減弱，觀察基因突變對模式動物表型的影響，進而研究基因功能[9]。利用模式生物進行基因功能研究是一個非常有效的方法，果蠅作為模式動物在研究神經退行性疾病中關鍵蛋白的作用機制中也得到廣泛的運用[10-12]。在果蠅、線蟲和酵母中有約2/3的基因發(fā)生突變，卻不能產生明顯的表型改變[13]。這時，基因的異位表達可以幫助我們研究該基因的功能，如一些同源基因在果蠅中異位表達后可以造成明顯的表型變化[14]。果蠅的UAS/GAL4系統(tǒng)由于其可以控制靶基因在一定的時空條件下高量表達，從而能夠很好地確定特定的靶基因在特定的時空條件下對果蠅發(fā)育的影響[15]，因此果蠅已經成為一個理想的研究基因功能的工具。

在本實驗中，我們成功構建4株Tau蛋白截短片段的轉基因果蠅，利用pGMR-GAL4驅動Tau蛋白截短片段在果蠅的眼睛中特異性表達，隨后觀察Tau蛋白對果蠅眼睛發(fā)育的毒性。實驗結果顯示Tau蛋白截短片段對果蠅眼睛發(fā)育的毒性作用比全長Tau蛋白的毒性作用小。Amadoro等曾報道Taul-44介導了Tau蛋白對CGCs細胞的毒性[16]，而本實驗中Taul-44對果蠅眼睛的發(fā)育沒有毒性作用，我們認為Taul-44在不同的系統(tǒng)中表現(xiàn)出不同的蛋白性質，又或者Tau1-44對細胞的毒性作用有限，不能在果蠅的眼睛中表現(xiàn)出來，截短的Tau蛋白毒性在體內可能被掩蓋起來了。Tau蛋白結構的完整性可能是Tau蛋白的毒性作用發(fā)揮的前提條件，而截短的Tau蛋白片段在果蠅體內并不能引起毒性作用。我們檢測了Tau蛋白截短片段在果蠅的眼睛中的表達，發(fā)現(xiàn)除了Tau1-44，其他3個截短的Tau蛋白片段在果蠅眼睛中均有表達。之所以在蛋白水平沒有檢測到Taul-44，可能是因為Taul-44表達后不穩(wěn)定，在細胞內容易被降解[6]。

在阿爾茨海默病中，Tau蛋白翻譯后的修飾方式有很多種，除了Tau蛋白的水解，還有Tau蛋白的磷酸化[2、16]、糖基化[17-19]、泛素化[20、21]以及硝基化[22、23]等。Tau蛋白這些翻譯后的修飾方式任何一種發(fā)生異常都可能會導致Tau蛋白獲得某種毒性。本實驗通過對過表達Tau蛋白截短片段的果蠅的分析，僅從一方面討論了Tau蛋白在阿爾茨海默病中的作用，后續(xù)的實驗可以進—步研究Tau蛋白各種翻譯后修飾之間的關系，以及它們對Tau蛋白毒性的影響。參考文獻（References）：[1]MOHANDAS E， RAJMOHAN V， RAGHUNATH B. Neurohiology of Alzheimers disease[J]. Indian Journal of Psychiatry，2009，51（1）： 55-61.[2]AVILA J. Tau phosphorylation and aggregation in Alzheimer's disease pathology [J]. FEBS Letters， 2006，580（12）： 2922-2927.[3]GARCIA-SIERRA F， WISCHIK C M， HARRINGTON C R， el al. Accumulation of C-terminally truncated tau protein associated with vulnerability of the perforant pathway in early stages of neurofibrillary pathology in Alzheimer's disease[J]. Journal of Chemical Neuroanatomy， 2001，22（1-2）： 65-77.[4]MCMILLAN P J， KRAEMER B C， ROBINSON L， el al. Truncation of tau at E391 promotes earLy pathologic changes in transgenic mice[J]. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology， 2011，70（11）： 1006-1019.[5]PARK S Y， FERREIRA A. The generation of a 17 kDa neurotoxic fragment： an alternative mechanism by which tau mediates beta-amyloid-induced neurodegenerationf[J]. The Journal of Neuroscience， 2005，25（22）： 5365-5375.[6]AMADORO G， CIOTTI M T， COSTANZI M， et at. NMDA receptor mediates tau-induced neurotoxicity by calpain and ERK/MAPK activation[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2006， 103（8）： 2892-2897.[7]JOHNSON G V， JOPE R S， BINDER L I. Proteolysis of tau by calpain[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 1989，163（3）： 1505-1511.'[8]COOK T， ZELHOF A， MISHRA M， et al. 800 facets of retinal degeneration[J]. Progress in Molecular Biology and Translational Science，2011，100：331-368.[9]JAISWAL M， SANDOVAL H， ZHANG K， et al. Probing mechanisms that underlie human neurodegenerative diseases in Drosophild[J]. Annual Review of Genetics，2012.46： 371-396.[10]溫艾，劉力.以果蠅模型研究人類神經退行性疾病[J].生物化學與生物物理進展（WEN Ai， LIU Li. Drosophila as a model to study human neurodegenerative diseases[J]. Progress in Biochemistry and Biophysics），2003，30（3）：357-362.[11]PRUSSING K， VOIGT A， SCHULZ J B. Drosophila melanogaster as a model organism for Alzheimer's disease[J]. Molecular Neurodegeneration，2013，8（1）：35.[12]WHTMANN C W， WSZOLEK M F， SHULMAN J M， et al. Tauopathy in Drosophila： Neurodegeneration Without Neurofihrillary Tangles[J].Science，2001，293（5530）： 711-714.[13]徐人宏.任婧，徐榮.等.SNKIA轉基因果蠅的構建[J].復旦學報（自然料學版）（XU Tian-hong， REN Qian， XU Rong， et al. Construction of SNFIA Gene Transgenic Flies[J]. Journal of Fudan University （Natural Science）），2003，42（1）：98-102.[14]SKIM1YA M， GEHRING W J. The Drosophila homeobox gene optix is capable of inducing ectopic eyes by an eyeless-independent mechanism[J]. Development，2000，127（9）： 1879-1886.[15]DHELPS C B， BRAND A H. Ectopic gene expression in Drosophila using GAL4 system[J]. Methods， 1998，14（4）： 367- 379.[16]ALONSO A D， GRUNDKE-IQBAL I，BARRA H S， et al. Abnormal phosphorylation of tau and the mechanism of Alzheimer neurofibrillary degeneration： sequestration of niicrotubule-as-sotiated proteins 1 and 2 and the disassembly of microtubules by the almoimaltau[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1997，94（1）：298-303.[17]SMET-NOCCA C， BRONCEL M， WIERUSZESKI J M，et al. Identification of 0-GlcNAc sites within peptides of the Tau protein and their impact on phosphorylation[J]. Molecular BioSys-tems， 2011，7（5）： 1420-1429.[18]LIU F， ZAIDI T， IQBAL K， et al. Aberrant glycosylation modulates phosphorylation of tau by protein kinase A and dephos-phorylation of tau by protein phosphatase 2A and 5[J]. Neuro-science， 2002，115（3）： 829-837.[19]LIU Y， LIU F， IQBAL K， et. al. Decreased glucose transporters correlate to abnormal hyperphosphorylation of tau in Alzheimer disease[J].FEBS Letters，2008，582（2）： 359-364.[20]DAVID D C， LAYFIELD R， SERPELL L， et al. Proteasomal degradation of tau protein[J]. Journal of neurochemistry， 2002，83（1）：176-185.[21]DE VRIJ F M， SLUIJS J A， GREGORI L， et al. Mutant uhiquitin expressed in Alzheimer s disease causes neuronal death[J].Federation of American Societies for Experimental Biology，2001，15（14）：2680-2688.[22] REYNOLDS M R， BERRY R W， BINDER L I. Site-specific nitration and oxidative dityrosine bridging of the tau protein by peroxynitrite： implications for Alzheimers disease[J]. Biochemistry，2005，44（5）：1690-1700.[23]REYNOLDS M R， REYES J F， FU Y， et al. Tau nitration occurs at tyrosine 29 in the fibrillar lesions of Alzheimers disease and other tauopathies[J]. The Journal of Neuroscience， 2006，26（42）： 10636-10645.