構(gòu)樹黃酮誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的初步觀察

陳紹紅等

摘要[目的]研究構(gòu)樹黃酮對腫瘤細(xì)胞的抑制效果。[方法]將處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞接種于含有0、25、50、100、200、300 μg/ml構(gòu)樹黃酮的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)24、48和72 h，采用MTT法測定構(gòu)樹黃酮對HepG2細(xì)胞增殖的影響、用碘化丙啶（PI）染色法觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，并計算HepG2細(xì)胞凋亡率。[結(jié)果]構(gòu)樹黃酮能顯著抑制HepG2細(xì)胞增殖，并呈現(xiàn)劑量和時間依賴性；構(gòu)樹黃酮能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，其最低有效濃度為25 μg/ml；且HepG2細(xì)胞凋亡率呈隨著構(gòu)樹黃酮濃度增加及作用時間延長而升高。[結(jié)論]構(gòu)樹黃酮能抑制HepG2細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。

關(guān)鍵詞構(gòu)樹；黃酮化合物；HepG2細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

中圖分類號S567文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2015）29-032-03

構(gòu)樹是?？啤?gòu)樹屬的一種落葉喬木，在我國大部分省區(qū)均有分布，其根、莖、葉和果實均可入藥，具有消腫利尿、清熱利濕、補(bǔ)腎明目等功效?，F(xiàn)代藥物化學(xué)的研究表明，構(gòu)樹富含黃酮類、萜類、木脂素類等多種化合物，具有廣泛而復(fù)雜的生物學(xué)活性，如廣譜抗細(xì)菌與抗真菌活性、抗氧化活性、抗炎與抗腫瘤活性等。研究證實構(gòu)樹提取物能抑制酪氨酸酶活性，減少皮膚色素沉著；構(gòu)樹中的多酚化合物能抑制黃嘌呤氧化酶活性，減少尿酸形成，有望用于痛風(fēng)癥的治療。該研究通過MTT法和PI染色法觀察了構(gòu)樹黃酮提取物對HepG2細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的影響，為進(jìn)一步探討構(gòu)樹黃酮的抗腫瘤活性提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試材。構(gòu)樹皮取自廣東海洋大學(xué)校園1～2年生構(gòu)樹，清洗去除表面塵土、晾曬，粉碎過60目篩，置干燥器中備用；HepG2肝癌細(xì)胞株由廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院戚亞偉老師惠贈。

1.1.2主要試劑。蘆?。˙R，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；Hepes、碘化丙啶、MTT（Sigma公司）；AntibioticAntimycotic、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶（Gibco公司）；胎牛血清（Hyclone公司）；DMSO（光譜級，Caledon公司）；Triton100（大連寶生物公司）。

1.2方法

1.2.1構(gòu)樹黃酮化合物的提取 。參照朱開梅等的方法，取40 g構(gòu)樹皮粉末，按1∶40加入60%乙醇，于60 ℃的水浴浸提1.5 h，濾液于60 ℃下真空濃縮至體積約350 ml，加入乙醇使其終濃度達(dá)70%，室溫靜置24 h，12 000 rpm離心15 min，取上清液真空濃縮、冷凍干燥去除乙醇、備用。

1.2.2構(gòu)樹樹皮黃酮化合物的鑒定。參照馬遠(yuǎn)濤等的方法，對構(gòu)樹黃酮化合物進(jìn)行定性和定量鑒定。

1.2.3構(gòu)樹黃酮對HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用。用DMEM培養(yǎng)液將處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞稀釋至106個/ml，接入培養(yǎng)板，各培養(yǎng)孔中分別加入終濃度為0、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00、300.00 μg/ml的構(gòu)樹黃酮，每個濃度設(shè)3個重復(fù)，在37 ℃和5% CO2條件下分別培養(yǎng)24和48 h。參照張海霞等的方法，采用MTT法測定各孔在560 nm的吸光度（OD560），計算細(xì)胞增殖抑制率。

1.2.4HepG2細(xì)胞爬片的制作。在細(xì)胞培養(yǎng)板各培養(yǎng)孔中放置蓋玻片，用DMEM培養(yǎng)液將處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞稀釋至106個/ml，接入培養(yǎng)板，分別加入構(gòu)樹黃酮使其終濃度分別為0、25、50、100 μg/ml，每孔設(shè)3個重復(fù)。在37 ℃和5% CO2條件下分別培養(yǎng)24和48 h。

1.2.5HepG2細(xì)胞凋亡的檢測。培養(yǎng)結(jié)束后，從細(xì)胞培養(yǎng)板取出蓋玻片，PBS緩沖液（pH 7.2）洗滌，4 ℃，4%多聚甲醛固定20 min，用濃度為25 μg/ml的碘化丙啶染色液染色15 min，晾干，制成封片，在激發(fā)波長為535 nm、發(fā)射波長為617 nm的熒光顯微鏡下觀察HepG2細(xì)胞核的形態(tài)，隨機(jī)統(tǒng)計5個視野中凋亡細(xì)胞數(shù)量和總細(xì)胞數(shù)量，計算細(xì)胞凋亡率。

1.2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計。采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)值采用平均值加標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）形式表示，采用LSD檢驗，比較不同劑量的構(gòu)樹黃酮對HepG2細(xì)胞凋亡的影響。

2結(jié)果與分析

2.1構(gòu)樹黃酮的分離與鑒定構(gòu)樹黃酮可溶于乙醇溶液，采用終濃度為70%的乙醇溶液可除去其中的蛋白質(zhì)、果膠等雜質(zhì)；構(gòu)樹黃酮的60%乙醇溶液能與NaOH、濃氨水反應(yīng)，生成可溶性黃色化合物；與亞硝酸鈉和硝酸鋁在堿性條件下生成可溶性紅色化合物；與1% 三氯化鋁乙醇溶液反應(yīng)，可在濾紙上形成黃色斑點。

2.2構(gòu)樹黃酮對HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用由表1可見，隨著培養(yǎng)液中構(gòu)樹黃酮濃度的增加，HepG2細(xì)胞增殖均受到不同程度的抑制，用構(gòu)樹黃酮處理48和72 h后，25、50、100 μg/ml構(gòu)樹黃酮處理的各組細(xì)胞增殖均顯著低于對照組（P<0.05或P<0.01）；且細(xì)胞增殖抑制率隨著藥物作用時間的延長而顯著升高。用終濃度200 μg/ml構(gòu)樹黃酮處理48 h的細(xì)胞出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變（CPE），表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、變圓、壞死；而用終濃度300 μg/ml構(gòu)樹黃酮處理24 h時，HepG2細(xì)胞即出現(xiàn)CPE。由此可見，構(gòu)樹黃酮對HepG2細(xì)胞的作用呈現(xiàn)劑量和時間依賴性。

2.3構(gòu)樹黃酮誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察根據(jù)“2.2”的試驗結(jié)果，觀察了0、25、50、100 μg/ml構(gòu)樹黃酮處理48和72 h后HepG2細(xì)胞凋亡情況，以進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。從圖1可以看出，培養(yǎng)48 h的對照組細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞核為周邊整齊的圓形（圖1a1），用構(gòu)樹黃酮處理48 h后，部分細(xì)胞輪廓不清，細(xì)胞核中出現(xiàn)數(shù)量不等凋亡小體（圖1a2），50和100 μg/ml處理組中部分細(xì)胞聚集成團(tuán)，細(xì)胞核崩解形成橘紅色碎片（圖1a3、a4）。培養(yǎng)72 h的部分對照組細(xì)胞中，有些細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)凋亡小體，周邊有少量橘紅色碎片（圖1b1）；用25和50 μg/ml構(gòu)樹黃酮處理72 h的HepG2細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)數(shù)量不等的凋亡小體，50 μg/ml處理組中細(xì)胞聚集成團(tuán)（圖1b2、b3）；而在100 μg/ml構(gòu)樹黃酮處理組中，大部分細(xì)胞崩解，結(jié)構(gòu)不清，無完整細(xì)胞核（圖1b4）。

2.4構(gòu)樹黃酮劑量和作用時間對HepG2細(xì)胞凋亡率的影響由表2可見，用構(gòu)樹黃酮處理的HepG2細(xì)胞凋亡率均顯著高于對照組（P<0.01），且細(xì)胞凋亡率隨著藥物劑量的增加而升高，其誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的最低有效濃度為25 μg/ml。同時，隨著構(gòu)樹黃酮作用時間的延長，HepG2細(xì)胞凋亡率明顯升高，用50和100 μg/ml處理72 h，HepG2細(xì)胞凋亡率分別達(dá)64.0%和89.3%。

3討論

該研究證實，當(dāng)終濃度為25～100 μg/ml時，構(gòu)樹黃酮提取物能抑制HepG2細(xì)胞增殖，并呈現(xiàn)劑量和時間依賴性，當(dāng)

構(gòu)樹黃酮終濃度達(dá)200 μg/ml時，HepG2細(xì)胞出現(xiàn)明顯病

變，表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、變圓乃至壞死；用PI染色法觀察細(xì)胞形態(tài)可見，用25 μg/ml構(gòu)樹黃酮處理48 h，HepG2細(xì)胞內(nèi)即出現(xiàn)凋亡小體，隨著構(gòu)樹黃酮劑量增加和作用時間延長，凋亡小體增加；用100 μg/ml構(gòu)樹黃酮處理72 h后，大部分HepG2細(xì)胞核崩解。細(xì)胞凋亡率測定結(jié)果與此相符。

目前有關(guān)構(gòu)樹提取物抗腫瘤的研究尚不多見。Lee等研究發(fā)現(xiàn)構(gòu)樹乙酸乙酯提取物中的某些化學(xué)成分能不同程度地顯著抑制芳香酶（aromatase）活性，減少雌激素合成，對乳腺癌具有一定抑制作用；Yang等[12]也證實構(gòu)樹正丁醇提取物能抑制體外培養(yǎng)的卵巢顆粒樣細(xì)胞（KGN）雌激素合成。龐素秋等分析發(fā)現(xiàn)從構(gòu)樹種子中分離得到5種生物堿對宮頸鱗癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞增殖等具有不同程度的抑制作用，且具有明顯的劑量依賴性。Wang等觀察了構(gòu)樹二氯甲烷提取物對人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞增殖的抑制作用，證實構(gòu)樹提取物能顯著抑制HT29細(xì)胞增殖，并通過上調(diào)p53、caspase3和Bax基因表達(dá)誘導(dǎo)HT29細(xì)胞凋亡。朱開梅等研究表明3、6、9 mg/ml構(gòu)樹黃酮能顯著抑制HepG2細(xì)胞增殖，并通過下調(diào)Bcl2、上調(diào)Bax基因表達(dá)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。

盡管上述研究已初步證實構(gòu)樹提取物的抗癌效果，顯示出良好的應(yīng)用前景，但其確切的作用機(jī)制尚不清楚。因此，有必要通過體內(nèi)試驗深入探討構(gòu)樹提取物的抗氧化活性、免疫調(diào)節(jié)活性與抗癌活性之間的相互聯(lián)系，闡明其作用機(jī)制，為利用構(gòu)樹資源開發(fā)天然抗癌藥物奠定基礎(chǔ)。

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