甜瓜白粉病離體葉片接種方法研究

鄧麗君　廖新福　王惠林　戶金鴿　楊軍　楊咪

摘要：為了明確新疆吐魯番地區(qū)甜瓜白粉病生理小種，試驗(yàn)采用離體葉片和活體植株2種接種方法，對(duì)國(guó)際通用的甜瓜白粉病生理小種鑒定的13份鑒別寄主，即MR-l、WMR 29、Iran H、Vedrantais、Edisto 47、Topmark、Nan-tais Oblong、PMR6、PMR5、PMR45、P1124111、P1124112、P1414723進(jìn)行抗病性鑒定。結(jié)果表明，2種鑒定方法在發(fā)病率和病情指數(shù)上有些差異，但鑒定結(jié)果基本一致，初步確定新疆吐魯番地區(qū)的甜瓜白粉病由Podosphaera xanthii的小種l所致。因此，離體葉片接種方法可用于甜瓜白粉病生理小種的鑒別和抗源鑒定。

關(guān)鍵詞：甜瓜；白粉?。浑x體葉片；抗性鑒定；種質(zhì)資源

甜瓜（Cucumis melo L）是葫蘆科黃瓜屬一年生蔓性草本植物。因其栽培周期短、效益高，是致富首選經(jīng)濟(jì)作物之一。甜瓜白粉病是甜瓜生產(chǎn)上最常見、最重要的氣傳病害，從苗期到成株期均可發(fā)生，但進(jìn)入中后期最為嚴(yán)重，主要危害葉片，嚴(yán)重時(shí)亦可危害葉柄和莖蔓。還可導(dǎo)致植株冠層減少，單株坐果率降低，發(fā)病嚴(yán)重年份可使甜瓜減產(chǎn)50%以上，且甜瓜的成熟度和含糖量也會(huì)受到很大的影響。

甜瓜白粉病是由子囊菌亞門白粉菌科白粉菌屬的真菌侵染所致，甜瓜白粉病菌主要為單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii）和二孢白粉菌（Golorino-myces cichoracearum）。國(guó)內(nèi)有關(guān)甜瓜白粉病病原菌鑒定結(jié)果均表明我國(guó)甜瓜白粉病是P.xanthii所致，王娟等嘲初步確定北京地區(qū)瓜類蔬菜白粉病由P.xanthii所致，張學(xué)軍等報(bào)道新疆甜瓜白粉病由P.xanthii所致。甜瓜白粉菌的小種多，分化快，至今已發(fā)現(xiàn)P.xanthii存在11個(gè)生理小種，即：0、1、2U.S、2France、3、4、5、N1、N2、N3、N4 E4-61。Kuzuva等將N1和N2定名為小種6和小種7；G cichoracearum的生理小種有2個(gè)，即小種0和小種1。

防治甜瓜白粉病常用的方法是化學(xué)防治法，但化學(xué)防治不僅成本高、效率低，還會(huì)引起病原菌的抗藥性以及環(huán)境污染等問題。多年的防治實(shí)踐表明，利用抗源培育抗病品種則是防治甜瓜白粉病最經(jīng)濟(jì)、最有效的措施。培育抗病品種的關(guān)鍵步驟之一是生理小種的明確和抗病性的鑒定。由于白粉菌是一種專性寄生菌，只能在活體寄主上存活，目前甜瓜白粉病生理小種的鑒定多采用國(guó)際通用的13份鑒別寄主在其苗期使用分生孢子懸浮液噴霧接種法。而苗期噴霧接種受溫度和濕度等外界環(huán)境因素的影響較大，常造成鑒定結(jié)果不穩(wěn)定，不能完全反映抗病育種材料的抗性程度。多項(xiàng)研究表明，利用植株離體葉片進(jìn)行室內(nèi)抗性接種鑒定，具有快速、準(zhǔn)確、篩選量大以及不受季節(jié)限制等優(yōu)越性。而甜瓜白粉病利用離體葉片接種方法鮮有報(bào)道。本研究主要探索甜瓜白粉病離體葉片的接種方法，以期為甜瓜白粉病生理小種的鑒別和抗源材料的鑒定提供理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1材料

當(dāng)?shù)匾赘邪追鄄√鸸掀贩N‘巴登的葉片。鄯善當(dāng)?shù)販厥也杉陌追劬?guó)際通用的甜瓜白粉病生理小種鑒定的一整套13份鑒別寄主，即MR-1、WMR 29、Iran H、Vedrantais、Edisto 47、Top-mark、Nantais Oblong、PMR6、PMR5、PMR45、P1124111、P1124112、P1414723。所有供試材料均由新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所提供。離體接種試驗(yàn)的材料播種于光照培養(yǎng)箱，活體植株接種試驗(yàn)的材料播種于隔離溫室。

1.2方法

1.2.1病原茵和分生孢子懸浮液制備待感病品種長(zhǎng)到3片真葉時(shí)，從鄯善溫室采集白粉病發(fā)病合適的甜瓜葉片，放入冰盒，帶回實(shí)驗(yàn)室處理。取下感病品種的葉片，留有0.5 cm長(zhǎng)的葉柄，用剪刀斜切，自來(lái)水沖洗2次，然后用75%（φ）的乙醇浸泡10s，再用蒸餾水晃洗2次，置于7%（ω）次氯酸鈉浸泡消毒10min，然后用無(wú)菌水沖洗2次。在超凈工作臺(tái)將葉片置于鋪有滅過(guò)菌的濾紙的培養(yǎng)皿里，待水吸干后，將葉柄插入裝有培養(yǎng)基的三角瓶中。參考李映霞配制培養(yǎng)基（5‰瓊脂，50mg·Lω^-1苯丙咪唑）。接種前用4℃無(wú)菌水將甜瓜葉片上的孢子配制成1×10⁵個(gè)·mL^-1的孢子懸浮液。用移液槍取20μL菌液均勻的接種于葉片正面。放入光照培養(yǎng)箱，在白天25℃，晚上20℃、濕度70%、12h光暗交替的條件下培養(yǎng)。接種7d后，觀察發(fā)病情況。待發(fā)病充分后，取出病葉，將少量4℃滅過(guò)菌的蒸餾水沖洗成孢子懸浮液，在顯微鏡下調(diào)整分生孢子懸浮液的濃度約為1×10⁵個(gè)·mL^-1備用。

1.2.2不同寄主的離體葉片鑒定取13份國(guó)際通用的白粉病生理小種鑒別寄主展開的幼葉（第3-第4片葉），在超凈工作臺(tái)內(nèi)，滅菌打孔器將葉片打成1.5cm葉碟，將消毒過(guò)的葉碟放人高溫滅菌后的平板培養(yǎng)基中。每個(gè)品種處理10片幼葉，3次重復(fù)，用移液槍取10μL配置好的菌液接種于葉片正面中心。用封口膜封住培養(yǎng)皿邊口后，放人培養(yǎng)箱培養(yǎng)，在白天25℃，晚上20℃、濕度70%、12h光暗交替的條件下培養(yǎng)。接種7d后開始觀察記錄，在15-20d充分發(fā)病后調(diào)查發(fā)病率和病情指數(shù)。離體葉盤法病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參考劉愛媛的方法，略有修改（表1，表2）。根據(jù)調(diào)查結(jié)果按公式計(jì)算出病情指數(shù)（DI）：

1.2.3不同寄主的活體植株接種鑒定將13份白粉病鑒別寄主播種于隔離溫室，各5株，3次重復(fù)。長(zhǎng)到5片真葉時(shí)，采用孢子懸浮液噴霧接種法，選在傍晚時(shí)間接種。接種時(shí)用軟刷將新鮮分生孢子刷人無(wú)菌蒸餾水中，加入一滴Tween-20（使之質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%）攪拌均勻，孢子懸浮液的濃度為1×10⁵個(gè)·mL^-1，用噴霧器把孢子懸浮液均勻噴霧接種到13個(gè)鑒別寄主植物葉片表面，注意葉片不能滴水，接種時(shí)間嚴(yán)格控制在1h以內(nèi)，黑暗保濕24h，溫度控制在白天不超過(guò)30℃，夜間20℃，相對(duì)濕度控制在60%。70%。7d后開始觀察記錄，15～20d充分發(fā)病后調(diào)查發(fā)病情況，進(jìn)行抗感鑒定。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)按照《中國(guó)蔬菜病蟲預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)》的方法”（表3，表4）。

病情指數(shù)計(jì)算公式同上。

2.結(jié)果與分析

2.1病原菌純化和無(wú)性階段形態(tài)鑒定

三角瓶中的完整葉片生長(zhǎng)良好，葉片基本綠色，接種20d后，白色病斑開始連接成片，沒有雜菌，表明甜瓜白粉病菌的分生孢子能夠在感病品種的離體葉面正常萌發(fā)并進(jìn)一步侵染（圖版-1、2）。用滅過(guò)菌的接種針挑取少量的粉末在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)大量的橢圓形的分生孢子，有發(fā)達(dá)的纖維體，進(jìn)一步證實(shí)了白粉菌沒有受到污染，且孢子活性較強(qiáng)，適合接種。表明所接種的白粉菌為P.xan-thii。

2.2鑒別寄主離體葉片接種結(jié)果

13份寄主離體葉片接種后，部分寄主的葉片先后出現(xiàn)了不同程度的感染，各品種間的發(fā)病率和發(fā)病指數(shù)各異。根據(jù)鑒別寄主鑒定情況（圖版-3-15）和鑒定結(jié)果（表5）可知，其中Iran H、Vedrantais、Topmark、Nantais Oblong表現(xiàn)為感病，且發(fā)病率高；P1124111、P1124112和P1414723雖有發(fā)病，但發(fā)病率低，表現(xiàn)為抗?。籔1124111和P1124112病情指數(shù)接近感?。黄溆嗥贩N沒有出現(xiàn)感病現(xiàn)象，均表現(xiàn)為抗病。表5對(duì)照甜瓜白粉病生理小種的鑒別寄主及其抗感反應(yīng)可知，此次采集的白粉病菌為P.xanthii的小種1。

2.3鑒別寄主活體植株接種結(jié)果

從表6可以看出，活體植株接種的抗病性鑒定結(jié)果與離體接種結(jié)果基本一致。但發(fā)病率、發(fā)病速度和發(fā)病程度均高于離體葉片。Iran H、Vedrantais和Topmark發(fā)病最為嚴(yán)重，表現(xiàn)為高感。NantaisOblong表現(xiàn)為中感。其中P1124111、P1124112、P1414723接種后葉片有發(fā)病情況，但發(fā)病速度和發(fā)病程度均明顯低于其他感病品種，P1414723最后發(fā)病。這與離體接種情況表現(xiàn)一致。其他品種沒有出現(xiàn)感病情況，均表現(xiàn)為抗病。對(duì)照甜瓜白粉病生理小種的鑒別寄主及其抗感反應(yīng)表可知，此次采集的白粉病菌主要是P.xanthii的小種1。

3.討論與結(jié)論

近年來(lái)隨著甜瓜種植面積的增加和設(shè)施栽培的發(fā)展，白粉病已成為甜瓜主要病害，并呈現(xiàn)生理小種多、分化快的特點(diǎn)。廣泛搜集甜瓜種質(zhì)資源、篩選抗源、培育和推廣抗病品種是防御白粉病的一條最安全、經(jīng)濟(jì)、有效的途徑，而準(zhǔn)確預(yù)測(cè)甜瓜白粉病菌的種類及其分化和抗病性的鑒定，是開展甜瓜白粉病防治、引進(jìn)抗源材料和選育抗病品種的基礎(chǔ)。

目前比較常用的人工接種方法是苗期噴霧接種法，但苗期噴霧接種法對(duì)發(fā)病條件要求嚴(yán)格，當(dāng)栽培季節(jié)或環(huán)境不適宜時(shí)植株不發(fā)病或發(fā)病不整齊，對(duì)抗性鑒定的準(zhǔn)確性有一定的影響。此外，苗期接種周期較長(zhǎng)，所需成本較高，無(wú)法鑒定數(shù)量較多的個(gè)體植株。鄭耘研究表明，葉碟保存法具有保存菌種純度高，不易受污染，無(wú)需隔離設(shè)備，不受試驗(yàn)條件限制等優(yōu)點(diǎn)。張海旺等”圳研究表明水稻葉片劃傷接種是一種準(zhǔn)確、穩(wěn)定和方便的稻瘟菌接種方法，可用于大規(guī)模定性測(cè)定水稻抗源及其后代的抗瘟基因型和稻瘟菌的致病型。王倩等研究表明利用激素處理的離體葉片進(jìn)行早疫病抗性鑒定的方法受到外界環(huán)境條件影響相對(duì)較小，且需要的時(shí)間少，操作簡(jiǎn)單，可用于大量新培育馬鈴薯品種的抗病性初步鑒定。張永兵等研究甜瓜蔓枯病離體接種法具有檢測(cè)周期短、成本低、可在有限空間鑒定大量材料的優(yōu)點(diǎn)。離體接種法在水稻、小麥旺”、辣椒和草莓等作物的病原菌生理小種鑒別、抗源鑒定、抗性遺傳規(guī)律分析和抗病品種篩選等研究中被廣泛應(yīng)用。

白粉病菌屬于活體寄生型真菌，因此在普通培養(yǎng)基上無(wú)法生存。目前比較常用的人工接種鑒定方法是苗期噴霧接種法，而離體葉片接種法鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)離體葉片和活體接種2種方法比較表明，活體接種的發(fā)病率及發(fā)病指數(shù)均略高于離體葉片接種，但兩種方法的鑒定結(jié)果一致，新疆吐魯番地區(qū)鄯善縣溫室內(nèi)采集的白粉菌為P.xanthii的小種1。說(shuō)明用離體葉片接種鑒定甜瓜品種的抗病性是可靠的。離體葉片接種法鑒定抗病性，具有活體整株鑒定法無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)，并已在甜瓜蔓枯病及碗豆白粉病等病害研究中得到證實(shí)。本研究在甜瓜白粉病鑒定中也得出相似的結(jié)論。據(jù)此并結(jié)合以往的研究成果可以證明，用離體葉片接種以鑒定甜瓜白粉病的抗性，其方法可行，結(jié)果可靠。