西瓜未受精胚珠離體培養(yǎng)若干影響因素的研究

榮文娟　劉君璞　朱迎春　鄧云　李衛(wèi)華　安國(guó)林　李可　孫德璽

摘要：為探討適宜的西瓜未受精胚珠離體培養(yǎng)方法，以‘大果黑美人、‘早春翠玉、‘中科6號(hào)等為試材，研究了供體植株的基因型、4℃預(yù)處理時(shí)間、35℃高溫預(yù)培養(yǎng)時(shí)間及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)未受精胚珠的反應(yīng)率和愈傷誘導(dǎo)率的影響。結(jié)果表明：不同材料（基因型）的胚珠反應(yīng)率和愈傷誘導(dǎo)率都有顯著性差異，愈傷誘導(dǎo)率最高的是‘中科6號(hào)（92.3%），最低的是野生西瓜‘09005（57.2%）；4℃低溫預(yù)處理沒(méi)有顯著提高胚珠反應(yīng)率和愈傷誘導(dǎo)率，對(duì)于胚珠反應(yīng)率和愈傷誘導(dǎo)率的影響因培養(yǎng)基不同而不同；35℃高溫預(yù)培養(yǎng)可以提高胚珠反應(yīng)率和愈傷誘導(dǎo)率，預(yù)培養(yǎng)3d可以得到較高的愈傷誘導(dǎo)率和質(zhì)量較好的愈傷組織；在誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA2mg·L^-1+NAA3mg·L^-1+TDZ0.05mg·L^-1上，愈傷誘導(dǎo)率最高為84.64%；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑TDZ相對(duì)于2，4-D和KT對(duì)西瓜未受精胚珠愈傷誘導(dǎo)的效果較好。

關(guān)鍵詞：西瓜；未受精胚珠；離體培養(yǎng)；愈傷組織；誘導(dǎo)率

西瓜是重要的經(jīng)濟(jì)作物，由于遺傳基礎(chǔ)狹窄，限制了育種工作的進(jìn)展。傳統(tǒng)的育種方法品種創(chuàng)新難度大、費(fèi)時(shí)費(fèi)力。西瓜單倍體培養(yǎng)有利于性狀表達(dá)、快速純合基因型、獲得新的種質(zhì)資源，和傳統(tǒng)的育種方法相結(jié)合加速育種進(jìn)程，拓寬了育種途徑；也可以用于分子標(biāo)記、基因定位、遺傳圖譜構(gòu)建等，有著極其重要的意義。通過(guò)離體誘導(dǎo)雌核發(fā)育和雄核發(fā)育都可以獲得單倍體，在葫蘆科作物中，黃瓜、西葫蘆、南瓜、甜瓜的離體誘導(dǎo)雌核發(fā)育都獲得了再生植株。西瓜通過(guò)花藥離體培養(yǎng)誘導(dǎo)獲得愈傷組織的報(bào)道較多，愈傷組織的誘導(dǎo)率較高，愈傷組織分化出再生植株的分化率低。周林對(duì)西瓜花藥和未受精子房離體培養(yǎng)進(jìn)行了初步研究，也只得到了愈傷組織，沒(méi)有獲得單倍體植株。王建設(shè)等研究西瓜未受精胚珠離體培養(yǎng)得到了3個(gè)有再生能力的胚，其中的一個(gè)胚狀體再生出了單倍體植株。李玲等通過(guò)對(duì)西瓜未授粉子房和胚珠離體培養(yǎng)的研究，獲得了愈傷組織，沒(méi)有獲得完整的單倍體植株?；谇叭宋鞴衔词芫咧殡x體培養(yǎng)獲得單倍體的培養(yǎng)體系還沒(méi)有建立，體系之中的許多影響因素還未明確，本試驗(yàn)挑取西瓜未受精胚珠為外植體，研究培養(yǎng)過(guò)程中的材料的基因型、低溫預(yù)處理時(shí)間、高溫預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、激素對(duì)未受精胚珠離體培養(yǎng)的影響，為建立西瓜未受精胚珠離體培養(yǎng)獲得單倍體的培養(yǎng)體系提供參考。

1.材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

未受精胚珠離體培養(yǎng)以‘大果黑美人、‘早春翠玉、‘中科6號(hào)等7個(gè)雜交種和野生西瓜‘09005為試驗(yàn)材料（表1）。材料在4月份定植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所試驗(yàn)地，每份材料定植80株，栽培管理同大田一般管理。開(kāi)花前1d下午對(duì)雌花進(jìn)行套帽，早上8：00采集未受精的子房用冰盒帶回。

1.2方法

1.2.1胚珠離體培養(yǎng)取未授粉的子房，輕輕去掉子房上面的茸毛，參考西瓜花藥消毒方法在超凈工作臺(tái)上用75%（φ）的乙醇浸泡子房30s，隨后用0.1%的升汞浸泡消毒8min，再用無(wú)菌水沖洗4～5遍。把子房放在無(wú)菌的培養(yǎng)皿上，用解剖刀切成3mm左右的薄片，用無(wú)菌的解剖針挑取胚珠，輕輕放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上（蔗糖濃度為4%，瓊脂濃度為0.6%，pH為5.82-5.86）。接種后的培養(yǎng)條件：25℃左右，光照16h·d^-1，光強(qiáng)3000L左右。每個(gè)處理接種3皿，每皿接種胚珠25個(gè)左右，3次重復(fù)。統(tǒng)計(jì)每皿接種數(shù)、胚珠膨大轉(zhuǎn)綠的胚珠數(shù)和長(zhǎng)出愈傷組織的胚珠數(shù)。

1.2.2低溫預(yù)處理時(shí)間的篩選

以‘中科6號(hào)開(kāi)花當(dāng)天未受精的胚珠為試材，分別4℃預(yù)處理0、1、2、3、4、5、6 d后，接種在1號(hào)和2號(hào)誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，其他培養(yǎng)條件保持一致，統(tǒng)計(jì)胚珠反應(yīng)率和愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.3高溫預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的篩選

以‘中科6號(hào)、‘西農(nóng)8號(hào)和野生西瓜‘09005為試材，選擇4℃預(yù)處理4d的子房，把胚珠接種在1號(hào)誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，進(jìn)行0、l、3、5 d高溫預(yù)培養(yǎng)，其他培養(yǎng)條件保持一致，培養(yǎng)15d查看胚珠生長(zhǎng)狀況。

1.2.4不同激素種類(lèi)的篩選

以‘中科6號(hào)為試材，接種在添加不同激素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，統(tǒng)計(jì)胚珠反應(yīng)率和愈傷誘導(dǎo)率，分析激素對(duì)未受精胚珠離體培養(yǎng)的影響。

1.3數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel和SPSS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行分析。

胚珠反應(yīng)率/%=胚珠膨大轉(zhuǎn)綠的胚珠數(shù)/接種數(shù)×100；

愈傷誘導(dǎo)率/%=長(zhǎng)出愈傷組織的胚珠數(shù)/接種數(shù)×100。

2.結(jié)果和分析

2.1基因型對(duì)西瓜未受精胚珠離體培養(yǎng)的影響

把8個(gè)不同基因型西瓜的未受精胚珠接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，胚珠的表現(xiàn)有顯著性差異（表2）。把未受精胚珠接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，剛挑取的未受精胚珠比較小，飽滿(mǎn)白色（圖版-1）；經(jīng)過(guò)35℃高溫預(yù)培養(yǎng)3d明顯膨大發(fā)黃，部分會(huì)褐化死亡（圖版2）；試驗(yàn)中用到的材料胚珠反應(yīng)率雖有差異，但普遍較高，都在90%以上。胚珠啟動(dòng)發(fā)育，明顯膨大后，培養(yǎng)5d，胚珠長(zhǎng)出少量白色或淡黃色愈傷組織，此時(shí)愈傷組織比較疏松（圖版-3）。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，愈傷組織明顯增多，體積迅速膨大，暗培養(yǎng)10d轉(zhuǎn)移到光照條件下，愈傷組織由白色或者淡黃色轉(zhuǎn)為黃綠色、綠色（圖版-4），比較疏松的愈傷組織經(jīng)過(guò)繼代培養(yǎng)會(huì)變得質(zhì)密。不同的基因型愈傷組織生長(zhǎng)狀況不一樣，野生西瓜‘09005和栽培品種相比愈傷誘導(dǎo)率較低，‘中科6號(hào)的愈傷率高達(dá)92.30%，而野生西瓜‘09005的愈傷率只有57.20%，兩者之間的愈傷質(zhì)量相差很大。栽培品種誘導(dǎo)出的愈傷大多質(zhì)地疏松（圖版-4），后期培養(yǎng)中易玻璃化，野生西瓜‘09005誘導(dǎo)出的愈傷質(zhì)地較硬、顏色略白（圖版一5），后期培養(yǎng)容易變褐死亡。疏松黃綠色或綠色的愈傷組織在后期培養(yǎng)中可以轉(zhuǎn)變?yōu)橘|(zhì)地良好的愈傷組織（圖版-6）。試驗(yàn)中的栽培品種的愈傷組織經(jīng)過(guò)進(jìn)一步培養(yǎng)增殖分化，而野生西瓜‘09005的愈傷組織卻在培養(yǎng)過(guò)程中易死亡，表明基因型對(duì)未受精胚珠離體培養(yǎng)的誘導(dǎo)有重要影響。

2.2低溫預(yù)處理時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)的影響

以‘中科6號(hào)為試材進(jìn)行低溫預(yù)處理，結(jié)果表明：對(duì)材料進(jìn)行低溫預(yù)處理沒(méi)有顯著提高胚珠的反應(yīng)率和愈傷誘導(dǎo)率（表3），低溫預(yù)處理時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)率的影響會(huì)因培養(yǎng)基的不同而異。在1號(hào)培養(yǎng)基上，低溫預(yù)處理0-6d對(duì)胚珠的反應(yīng)率和愈傷率的影響沒(méi)有顯著性差異，愈傷率以低溫預(yù)處理4d最高為44.73%。在2號(hào)培養(yǎng)基上，胚珠反應(yīng)率和愈傷率在低溫處理不同時(shí)間上有顯著性差異。未經(jīng)過(guò)低溫預(yù)處理的胚珠反應(yīng)率和愈傷率最高，為80.99%和25.59%，經(jīng)過(guò)低溫預(yù)處理的胚珠反應(yīng)率和愈傷誘導(dǎo)率降低。

2.3高溫預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)的影響

以‘中科6號(hào)、‘西農(nóng)8號(hào)和野生西瓜‘09005為試材，在35℃高溫下進(jìn)行不同時(shí)間的預(yù)培養(yǎng)，結(jié)果表明：高溫預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)3種材料的胚珠反應(yīng)率都沒(méi)有顯著性差異，但對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率有顯著差異（表4）?！鬓r(nóng)8號(hào)高溫不同時(shí)間之間有顯著性差異，隨高溫預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，愈傷誘導(dǎo)率增高，高溫5d愈傷誘導(dǎo)率最高為69.43%?！锌?號(hào)和野生西瓜‘09005高溫不同時(shí)間之間沒(méi)有顯著性差異，‘中科6號(hào)的愈傷誘導(dǎo)率在5d最高為63，99%，野生西瓜‘09005在高溫預(yù)培養(yǎng)3d時(shí)愈傷誘導(dǎo)率最高為52.38%。3種材料對(duì)高溫預(yù)培養(yǎng)的差異性表現(xiàn)也說(shuō)明基因型在培養(yǎng)過(guò)程中起重要作用。胚珠處于35℃二高溫條件下培養(yǎng)時(shí)，胚珠迅速膨大，愈傷生長(zhǎng)快而疏松，后期分化比較難。綜合考慮，以35℃高溫預(yù)培養(yǎng)3d為宜。在培養(yǎng)過(guò)程中，胚珠經(jīng)35℃高溫預(yù)培養(yǎng)比未經(jīng)高溫預(yù)培養(yǎng)膨大轉(zhuǎn)綠所需要的時(shí)間短。未經(jīng)過(guò)高溫預(yù)培養(yǎng)的胚珠一般3d才能看出來(lái)稍有膨大，一般5-7d胚珠顏色略為變黃。經(jīng)過(guò)高溫預(yù)培養(yǎng)的胚珠2d就有所膨大，3d就會(huì)變黃。合適的高溫預(yù)培養(yǎng)時(shí)間能增加誘導(dǎo)率，同時(shí)也獲得質(zhì)量較好的愈傷組織。

2.4激素對(duì)胚珠離體培養(yǎng)的影響

試驗(yàn)對(duì)不同激素組合進(jìn)行了篩選（表5），12號(hào)培養(yǎng)基為不添加激素的MS培養(yǎng)基。未受精胚珠在MS培養(yǎng)基上反應(yīng)率最低為18.12%，且最后都褐化死亡，培養(yǎng)基中添加激素能提高未受精胚珠反應(yīng)率和愈傷組織誘導(dǎo)率。在相同的6-BA和NAA質(zhì)量濃度下，2，4-D的質(zhì)量濃度為1mg·L^-1愈傷率最高（63.07%）；TDZ質(zhì)量濃度為0.05mg·L^-1時(shí)愈傷率最高（84.64%）；KT質(zhì)量濃度為3mg·L^-1時(shí)愈傷率最高（53.95%）。3種激素相比較，誘導(dǎo)未受精胚珠愈傷率的高低順序是TDZ>2，4-D>KT。

3.討論

3.1基因型對(duì)未受精胚珠的影響

在西葫蘆、黃瓜等許多種作物中證明，基因型是影響獲得單倍體植株的關(guān)鍵因素。在西瓜上，李玲等做西瓜未受精子房和未受精胚珠離體培養(yǎng)時(shí)，認(rèn)為基因型在培養(yǎng)中起重要作用。劉曉輝做西瓜紫外輻射花粉誘導(dǎo)西瓜單倍體中也證明出胚率、植株再生率和單倍體誘導(dǎo)率受基因型的影響。緱艷霞等研究西瓜花藥離體培養(yǎng)認(rèn)為，供體植株的基因型是影響花藥培養(yǎng)的關(guān)鍵因素?；蛐蛯?duì)誘導(dǎo)的影響會(huì)因作物而異，本試驗(yàn)中選擇了8個(gè)不同基因型的材料，材料在反應(yīng)率和愈傷組織誘導(dǎo)率上都有差異，與前人研究結(jié)果一致。在研究中可以選擇高反應(yīng)率和愈傷率的材料進(jìn)行試驗(yàn)，增加誘導(dǎo)成功的可能性。

3.2低溫對(duì)未受精胚珠的影響

許多未受精子房或胚珠離體培養(yǎng)的研究認(rèn)為低溫預(yù)處理有很重要的作用。低溫預(yù)處理是改變細(xì)胞分裂方式和發(fā)育途徑，提高胚或者愈傷組織誘導(dǎo)率的一種途徑。朱迎春等、羊杏平等認(rèn)為4℃處理2 d能夠提高西瓜小孢子的活性。魏瑛認(rèn)為低溫處理可以提高西瓜花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率，針對(duì)不同的基因型進(jìn)行不同的低溫預(yù)處理。魏瑛報(bào)道在做花藥培養(yǎng)時(shí)，一段時(shí)間低溫處理可以抑制花藥壁產(chǎn)生愈傷組織；在西瓜未受精離體培養(yǎng)中，誘導(dǎo)出的愈傷組織也可能來(lái)源于珠被細(xì)胞，需要進(jìn)一步研究證明愈傷組織的來(lái)源，以抑制珠被產(chǎn)生愈傷組織。本試驗(yàn)中用一個(gè)材料做了低溫預(yù)處理，比較了在兩種不同的培養(yǎng)基上的反應(yīng)率和愈傷誘導(dǎo)率，在1號(hào)培養(yǎng)基上4℃低溫預(yù)處理并沒(méi)有顯著提高胚珠的反應(yīng)率、愈傷組織誘導(dǎo)率，但對(duì)愈傷組織的質(zhì)量有影響；在2號(hào)培養(yǎng)基上低溫預(yù)處理不利于未受精胚珠的發(fā)育。因?yàn)榛蛐椭g存在差異，4℃低溫預(yù)處理對(duì)不同試驗(yàn)材料的影響也可能不同。低溫預(yù)處理對(duì)西瓜未受精胚珠的影響還需進(jìn)一步研究。

3.3高溫對(duì)未受精胚珠的影響

許多研究表明，30℃或35℃黑暗熱激可以促進(jìn)雌核發(fā)育，不同的作物熱激時(shí)間不同。G6mes-Juhfisz A等在黃瓜未受精子房離體培養(yǎng)試驗(yàn)中，比較了24、28、35℃對(duì)雌核發(fā)育誘導(dǎo)的影響，以35℃熱激時(shí)胚胎數(shù)量最多。本試驗(yàn)中，采用35℃黑暗熱激，經(jīng)過(guò)黑暗熱激的胚珠反應(yīng)速度比未經(jīng)過(guò)高溫?zé)峒さ目欤鷤实玫教岣?，可能是高溫促進(jìn)愈傷的生長(zhǎng)。胚珠黑暗熱激時(shí)間長(zhǎng)，會(huì)影響愈傷組織質(zhì)量。高溫條件下，愈傷組織生長(zhǎng)速度明顯加快，但形成的愈傷組織易蓬松、水漬狀，繼代培養(yǎng)也難以轉(zhuǎn)化為質(zhì)地好的愈傷?！锌?號(hào)和‘西農(nóng)8號(hào)的愈傷誘導(dǎo)率在5 d最高，但綜合考慮生長(zhǎng)狀況，本試驗(yàn)以35℃黑暗熱激3d為宜。

3.4激素對(duì)西瓜未受精胚珠離體培養(yǎng)的影響

未受精胚珠接種在不加任何激素的MS基本培養(yǎng)基上，胚珠全部褐化死亡。由未受精胚珠誘導(dǎo)出愈傷組織轉(zhuǎn)接在MS基本培養(yǎng)基上也全部褐化死亡。這說(shuō)明，激素在西瓜未受精胚珠離體培養(yǎng)誘導(dǎo)過(guò)程中起關(guān)鍵作用。許多研究者認(rèn)為，一定濃度的2，4-D對(duì)誘導(dǎo)十分必要，試驗(yàn)中誘導(dǎo)培養(yǎng)基添加一定濃度的2，4-D能夠明顯提高愈傷組織的誘導(dǎo)率，但是添加一定濃度的TDZ和2，4-D相比更利于誘導(dǎo)出愈傷組織。最佳愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA2mg·L^-1%NAA3mg·L^-1+TDZ0.05mg·L^-1，誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)接到6-BA2mg·L^-1+NAA2mg·L^-1+KT2mg·L^-1的培養(yǎng)基上，愈傷生長(zhǎng)狀況良好。

取材時(shí)間、基因型、溫度變化、培養(yǎng)基等許多因素影響西瓜未受精胚珠離體培養(yǎng)，這些因素之間的作用不是獨(dú)立的，只使其中的一個(gè)條件達(dá)到最優(yōu)，再和其他影響因素相互作用不一定能建立最適合西瓜未受精胚珠離體培養(yǎng)的體系。西瓜未受精胚珠的離體培養(yǎng)，由于取材的限制和培養(yǎng)過(guò)程漫長(zhǎng)、重復(fù)性差等特點(diǎn)，所以研究過(guò)程相對(duì)緩慢。西瓜未受精胚珠離體培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生愈傷組織或者胚狀體是獲得單倍體植株的有效途徑，一般試驗(yàn)中愈傷組織更易獲得，但培養(yǎng)中體細(xì)胞也有可能脫分化形成愈傷組織，所以如何抑制體細(xì)胞產(chǎn)生愈傷也是誘導(dǎo)成功的關(guān)鍵。在黃瓜、西葫蘆等作物的單倍體培養(yǎng)中，已經(jīng)建立了比較完整穩(wěn)定的培養(yǎng)體系，而西瓜單倍體培養(yǎng)體系還在探索階段，需進(jìn)一步的研究。