增免肽顆粒增強雞新城疫疫苗免疫效果試驗

胡莉萍

摘 ?要：首先取11日齡青腳黃羽肉雞150只分為5組，每組30只，分別為給予1%、0.8%、0.6%、0.4%濃度的增免肽顆?；祜?個給藥組和1個空白對照組，經(jīng)連續(xù)給藥7d、觀察14d的藥物耐受性試驗證實，增免肽顆粒以1%濃度下連續(xù)對雛雞無不良反應(yīng)和毒性作用，且0.4%以下濃度混飲有明顯的促進(jìn)生長作用。再取462只11日齡雛雞，隨機(jī)分為7組?？瞻讓φ战M30只隔離飼養(yǎng)，不做任何處理。其余6組每組72只，設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)24只;次日3個藥物劑量組開始混飲高、中、低劑量的增免肽顆粒，藥物對照組混飲鹽酸左旋咪唑-黃芪多糖粉，連續(xù)5d，疫苗對照組和攻毒對照組不給藥;14日齡各組用ND-La Sota苗滴鼻點眼免疫;26日齡重復(fù)以上給藥，連續(xù)5d，28日齡重復(fù)免疫;40日齡重復(fù)以上給藥，連續(xù)5d，42日齡除疫苗對照組外各組均用新城疫強毒攻毒。分別于21、28、35、42日齡每組隨機(jī)抽取12只頸靜脈采血，分離血清，用血凝抑制法測定新城疫抗體效價;于21、35、42日齡每組隨機(jī)抽取6只，采血分離外周血淋巴細(xì)胞，用MTT法測定其增殖;于21和42日齡每組隨機(jī)抽取6只稱重、撲殺，測免疫器官指數(shù);攻毒后每天觀察14d內(nèi)各組發(fā)病和死亡情況，計算發(fā)病率、死亡率和免疫保護(hù)率;于21、42、56日齡統(tǒng)計攻毒前后的平均日增重、耗料量和料重比。結(jié)果表明，增免肽顆粒顯著提高血清抗體效價，促進(jìn)外周血淋巴細(xì)胞增殖，提高免疫器官指數(shù)和攻毒保護(hù)率，并能提高增重和降低料重比。高、中劑量組效果較好，明顯優(yōu)于鹽酸左旋咪唑-黃芪多糖，兩組之間多無顯著差異，建議中劑量（按0.2%混飲）為臨床應(yīng)用劑量。

關(guān)鍵詞：增免肽顆粒;藥物耐受;雞新城疫;免疫效果;免疫保護(hù)

中圖分類號：S858.312.4 ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B ? ? 文章編號：1673-1085（2015）03-0043-05

增免肽顆粒主要成分為黃芪、白術(shù)等純中藥成分，有補氣健脾、益衛(wèi)固表功能，主要用于免疫功能低下、免疫抑制等。依據(jù)有關(guān)臨床試驗指導(dǎo)原則，我們對增免肽顆粒進(jìn)行了耐受性試驗和增強免疫效果試驗。

1 ?材料與方法

1.1 ?藥物、試劑和儀器 ?受試藥物增免肽顆粒，每1ml含生藥1g，批號：2014020402。由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)用生物制藥實驗室提供。

對照藥物：鹽酸左旋咪唑-黃芪多糖可溶性粉，每出口袋100g，含鹽酸左旋咪唑5g、黃芪多糖8g，批號：20140114。湖南湘大獸藥有限公司出品。

疫苗和病毒：雞新城疫低毒力活疫苗（La Sota株），批號：20140104。武漢中博生物科技股份有限公司出品。新城疫強毒株（NDV-F48E8）、新城疫抗體效價測定（血凝抑制法）抗原SPF雞胚NDV-La Sota尿囊液、新城疫抗體陽性血清，均由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室提供。其中NDV-F48E8種毒用10日齡SPF雞胚增殖，經(jīng)Reed-Muench法測定其EID50為10-7.97，臨用前用PBS稀釋成104、105、106、107EID50。

主要儀器：CO2培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，超凈工作臺，酶標(biāo)儀，離心機(jī)，分析天平等。

1.2 ?動物 ?1日齡青腳黃羽肉雞，購自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所。試驗前按常規(guī)飼養(yǎng)，喂不含任何藥物的全價飼料，自由采食及飲水，飼養(yǎng)至11日齡用于試驗。

1.3 ?方法

1.3.1 ?藥物耐受性試驗 ?選150只11日齡臨床健康的雛雞，公母兼有，稱重，按體重（兼顧公母）隨機(jī)分成5組，參照中華人民共和國獸藥典[1]和大鼠急性毒性試驗結(jié)果[2]，其中4個給藥組分別按1%、0.8%、0.6%、0.4%的增免肽顆?；祜嬤B續(xù)給藥7d，1個空白對照組則不給藥。每天觀察1次，仔細(xì)記錄動物的采食、飲水、排便和毒性反應(yīng)出現(xiàn)的時間、死亡情況，連續(xù)觀察14d。觀察期內(nèi)動物自由采食和飲水。觀察期結(jié)束后分別稱重，統(tǒng)計各組的日均增重、日均采食量和料重比，最后處死所有存活雞，進(jìn)行眼觀病理學(xué)檢查。

1.3.2 ?增強免疫效果試驗 ?同上選462只11日齡臨床健康的雛雞，隨機(jī)分為7組?？瞻讓φ战M30只隔離飼養(yǎng)，不做任何處理。其余6組每組72只，設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)24只，疫苗對照組和攻毒對照組各加24只用于攻毒劑量測定;次日起3個藥物劑量組開始混飲高、中、低劑量的增免肽顆粒，藥物對照組混飲鹽酸左旋咪唑-黃芪多糖粉，連續(xù)5d，疫苗對照組和攻毒對照組不給藥;14日齡時（測得母源抗體效價為2.8±0.3log2）各組均用新城疫La Sota苗滴鼻點眼免疫，2羽份/只;26日齡開始重復(fù)以上給藥，連續(xù)5d;28日齡時重復(fù)免疫;40日齡開始重復(fù)以上給藥，連續(xù)5d;42日齡時除疫苗對照組和空白對照組外各組用新城疫強毒F48E8攻毒。具體分組與處理（藥物濃度參照耐受性試驗結(jié)果確定）如表1。

1.3.3新城疫抗體效價測定 ?分別于21、28、35、42日齡時，3個試驗藥物組、藥物對照組和疫苗對照組每組隨機(jī)抽取12只，頸靜脈采血，分離血清，用血凝抑制法[3]測定新城疫抗體效價的動態(tài)變化。首先測抗原血凝價（HA），主要步驟為：在96孔“V”形微量反應(yīng)板上，用生理鹽水50μl/孔自左向右將NDV-La Sota尿囊液抗原病毒作2倍比稀釋至第11孔（21～211），第12孔為生理鹽水對照孔，向各孔加入1%雞紅血球50μl，振蕩混勻1min，37℃靜置作用20min左右觀察結(jié)果，以100%凝集（紅血球呈顆粒性傘狀凝集沉于孔底）的病毒最大稀釋孔為該病毒血凝價（即1個凝集單位）。實測的NDV-La Sota尿囊液抗原病毒的凝集價為1：29。其次用4單位（1：27即128倍稀釋的尿囊液）病毒測各時間點血清中新城疫抗體的紅細(xì)胞凝集抑制效價（HI），主要步驟為：在96孔“V”形微量反應(yīng)板上，用生理鹽水50μl/孔自左向右將50μl/孔待檢血清作2倍比稀釋至第10孔（21～210），第11孔為病毒對照，第12孔陽性血清對照，1～11孔加入4單位病毒50μl/孔，振蕩混勻1min，置37℃溫箱作用20min，再加入1%雞紅血球50μl/孔，再振蕩混勻1min，37℃靜置作用20min左右觀察結(jié)果，以100%抑制凝集的血清最大稀釋度為該血清的抗體滴度（即抗體效價），用-log2表示。

1.3.4 ?外周血淋巴細(xì)胞增殖測定 ?分別于21、35、42日齡時，3個試驗藥物組、藥物對照組和疫苗對照組每組隨機(jī)抽取6只（設(shè)3個重復(fù)），每只頸靜脈無菌采血（肝素抗凝）1.5ml，用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血淋巴細(xì)胞，采用MTT法[4，5，6]測定外周血淋巴細(xì)胞增殖。

1.3.5 ?免疫保護(hù)效果測定

1.3.5.1 ?攻毒劑量預(yù)試 ?另取分別于14日齡和28日齡經(jīng)新城疫La Sota苗滴鼻點眼，2羽份/只，2次免疫的32日齡雛雞96只，隨機(jī)均分為4組，每組24只，分別用104、105、106、107 EID50的NDV-F48E8 0.2ml經(jīng)滴鼻點眼攻毒，之后每天觀察1次，仔細(xì)記錄每組的發(fā)病及死亡情況，觀察10d，統(tǒng)計各組死亡率，作為攻毒劑量依據(jù)。

1.3.5.2 ?攻毒試驗 ?42日齡時，3個試驗藥物組、藥物對照組和攻毒對照組每組取12只（設(shè)3個重復(fù)），每羽經(jīng)滴鼻點眼106EID50的NDV-F48E8 0.2ml攻毒（參照上述攻毒劑量測試結(jié)果）。每天觀察各組雞的發(fā)病和死亡情況，死亡雞剖檢觀察病理變化，連續(xù)觀察14d，計算各組的發(fā)病率、死亡率和免疫保護(hù)率。免疫保護(hù)率=存活健康雞數(shù)/樣本數(shù)。

1.3.6 ?免疫器官指數(shù)測定 ?于21和42日齡時，3個試驗藥物組、藥物對照組和疫苗對照組每組隨機(jī)抽取6只稱重，撲殺，分離胸腺、脾臟和法氏囊、稱重，計算免疫器官指數(shù)。免疫器官指數(shù)=免疫器官（g）/體重（g）。

1.3.7 ?生長性能測定

1.3.7.1 ?日均增重 ?分別于14、21、42、56日齡時，各組稱重，分別計算14～21、22～42、43～56日齡3個時間段的日均增重。日均增重（g/d/羽）=（平均末重-平均始重）/飼喂天數(shù)。

1.3.7.2 ?日均采食量 ?分別計算14～21、22～42、43～56日齡3個時間段的耗料量，計算日均采食量。日均采食量（g/d/羽）=耗料量/飼喂天數(shù)/羽。

1.3.7.3 ?料重比 ?分別計算各組3個時間段的總耗料量和總增重，計算料重比。料重比（g/g）=總耗料/總增重。

1.3.8 ?數(shù)據(jù)統(tǒng)計 ?數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS軟件比較各組抗體效價、淋巴細(xì)胞增殖和生長性能的差異，用卡方檢驗[7]比較各組發(fā)病率、死亡率、保護(hù)率的差異。

2 ?結(jié)果

2.1 ?藥物耐受性 ?4個給藥組分別按1%、0.8%、0.6%、0.4%的增免肽顆粒混飲連續(xù)給藥7d，觀察至14d。觀察期內(nèi)各用藥組和空白對照組所有雛雞采食、飲水、排便等均正常，未出現(xiàn)不良反應(yīng)及死亡。觀察期結(jié)束后分別稱重，處死存活雛雞，眼觀病理學(xué)檢查心、肝、腎、肺、腺胃、肌胃及腸道等組織器官，均未發(fā)現(xiàn)明顯病理變化;各組日均增重、日均采食量和料重比統(tǒng)計結(jié)果顯示，與空白對照組相比，0.4%和0.6%增免肽顆?；祜嫿M日均增重略高，0.4%組的料重比略小，但經(jīng)卡方檢驗沒有顯著性差異（P>0.05），詳細(xì)結(jié)果見表2。因日均采食量為組內(nèi)平均值，故未作顯著性統(tǒng)計分析。

2.2 ?抗體效價變化 ?21日齡（21d，首免后第7天）時，3個增免肽顆粒組和陽性藥物組的抗體效價顯著高于疫苗對照組（P<0.05）;28d時，3個增免肽顆粒組的抗體效價最高，顯著高于藥物對照和疫苗對照組（P<0.05），而后兩組之間亦有顯著差異（P <0.05）;35d和42d時，增免肽顆粒高、中劑量組的抗體效價顯著高于其余3組（P<0.05），而低劑量組和藥物對照組則顯著高于疫苗對照組（P<0.05）;由于空白對照組沒有免疫，其沒得的抗體效價是殘留的母源抗體，故不與其他各組作統(tǒng)計學(xué)差異分析;這階段攻毒對照組與疫苗對照組處理完全一樣，測得結(jié)果基本一致，故亦不再列出統(tǒng)計分析。詳細(xì)結(jié)果見表3。

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2.3 ?淋巴細(xì)胞增殖的變化 ?21d（首免后第7天）時，增免肽顆粒高、中劑量組和藥物對照組的A570值顯著高于其余2組（P<0.05），3組間無顯著差異（P>0.05），而增免肽顆粒低劑量組又顯著高于疫苗對照組（P<0.05）;35d和42d時，增免肽顆粒高、中劑量組的A570值顯著高于低劑量組和藥物對照組（P<0.05），后2組與疫苗組間亦存在顯著差異（P<0.05）;與空白對照組相比，所有其他試驗組各時間的淋巴細(xì)胞增殖都顯著高于空白對照組（P<0.05），表明新城疫La Sota苗的免疫對雞外周血淋巴細(xì)胞增殖具有顯著促進(jìn)作用。詳細(xì)結(jié)果見表4。

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2.4 ?免疫保護(hù)效果 ?32日齡雛雞的攻毒后經(jīng)10d觀察發(fā)現(xiàn)：107EID50劑量組于攻毒后第4天開始發(fā)病，第5天出現(xiàn)死亡，最終死亡率為20.8%;106EID50劑量組于攻毒后第5天發(fā)病、出現(xiàn)死亡，最終死亡率為12.5%;105EID50劑量組于攻毒后第7天發(fā)病，第8天出現(xiàn)死亡，最終死亡率為4.17%;104EID50劑量組未見發(fā)病。因此選擇106EID50的NDV-F48E8 0.2ml為攻毒劑量。各計劃攻毒組于42日齡經(jīng)滴鼻點眼攻毒后，除增免肽顆粒高、中劑量組外，其余3組雞于攻毒后第5天（D5）開始零星出現(xiàn)綠色稀便、精神、飲食下降等發(fā)病癥狀，到第7天時攻毒對照組已死亡1只，各組雞的具體發(fā)病時間、數(shù)量和死亡時間、數(shù)量詳見表5。

死亡雞剖檢，可見新城疫病理變化，如口腔、嗉囊有粘液，鼻孔有干酪樣鼻液，氣管內(nèi)有粘性分泌物、黏膜充血出血，腺胃乳頭及腸粘膜出血。

至第13天時所有存活雞全部恢復(fù)健康。增免肽顆粒高、中劑量組的免疫保護(hù)率達(dá)100%，顯著高于其余3組（P<0.05），而增免肽顆粒低劑量組的94.4%，略高于藥物對照組的91.7%（P>0.05），明顯高于攻毒對照組的89.9%（P<0.05），見表5。

2.5 ?免疫器官指數(shù) ?21日齡（21d）時，增免肽顆粒3個劑量組和藥物對照組的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)顯著高于疫苗對照和空白對照組（P<0.05），增免肽顆粒3個劑量組的法氏囊指數(shù)均高于其余3組，但無顯著性差異;42d時，增免肽顆粒3個劑量組的法氏囊指數(shù)均顯著高于其余3組（P<0.05），中劑量組的脾臟指數(shù)雖明顯高于其余各組，但無顯著性差異（P>0.05）。因攻毒對照組與疫苗對照組處理完全一樣，故沒列出統(tǒng)計分析。詳細(xì)結(jié)果見表6。

2.6 ?生長性能的變化 ?在攻毒前（14～42d），除增免肽顆粒高、中劑量組14～21d時的料重比明顯小于各組（P<0.05）外，其余各的日均增重、日均采食量和料重比無顯著差異（P>0.05）。但攻毒后（43～56d），增免肽顆粒高、中劑量組的日均增料重比與其余3個攻毒組有差異顯著（P<0.05），而與沒攻毒的疫苗對照組、空白對照組之間卻沒有顯著差異（P>0.05）。詳細(xì)結(jié)果見表7。

3 ?討論

藥物耐受性試驗結(jié)果表明，增免肽顆粒1%以下濃度連續(xù)混飲7d，對雛雞無不良反應(yīng)和毒性作用，且0.4%以下有明顯的促進(jìn)生長作用。

增強免疫效果試驗結(jié)果顯示，首先增免肽顆粒高、中劑量組的抗體效價和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率迅速上升，各觀察時間點的抗體效價、淋巴細(xì)胞增殖和攻毒保護(hù)率最高，明顯高于其余各組（P<0.05），增免肽顆粒低劑量組和藥物對照組亦顯著高于疫苗對照或攻毒對照組;其次增免肽顆粒能顯著增加21日齡前胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和21～42日齡的法氏囊指數(shù)。表明增免肽顆?？梢悦黠@提高新城疫苗的免疫應(yīng)答。同時也有一定的促進(jìn)增重和降低料重比作用，以高、中劑量效果最好，與疫苗對照無顯著差異;其次是低劑量組和藥物對照組則明顯優(yōu)于攻毒對照組。因此，鑒于高、中劑量之間多無顯著差異，建議中劑量作為臨床應(yīng)用劑量。

4 ?結(jié)論

增免肽顆粒以1%濃度下連續(xù)對雛雞無不良反應(yīng)和毒性作用，且0.4%以下濃度混飲有明顯的促進(jìn)生長作用。

增免肽顆粒具有明顯的增強免疫作用，推薦中劑量（按0.2%混飲）為臨床應(yīng)用劑量。

（參考文獻(xiàn)略）