HIF－1α 及STAT3 聯(lián)合預(yù)測異時性結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移*

王 強，郭德正，劉焱偉，史 佳，黃 健，郝朗松

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 外科教研室，貴州 貴陽 550004;2.貴州省人民醫(yī)院 普外科，貴州 貴陽 550000;3.六安市立醫(yī)院 普外科，安徽 六安237000;4.十堰市太和醫(yī)院 普外科，湖北 十堰 442000)

結(jié)直腸癌治療后的異時性肝轉(zhuǎn)移(colorectal liver metastases，CRLM)是導(dǎo)致結(jié)直腸癌治療失敗及死亡的主要原因［1］。盡管轉(zhuǎn)化治療提高了CRLM 的可切除率，但效果仍不理想［2］。國外研究表明CRLM 危險因素中較為肯定的有年齡、術(shù)前癌胚抗原(CEA)水平［3］，但上述危險因素是否可用于國內(nèi)患者尚存在爭議。缺氧誘導(dǎo)因子1α(Hypoxia inducible factor，HIF－1α)是腫瘤在低氧狀態(tài)下生物學(xué)特性改變的始動因素，其表達(dá)程度及穩(wěn)定性與腫瘤的生物學(xué)特性、臨床密切相關(guān)。既往研究證實HIF－1α 的表達(dá)程度與結(jié)直腸癌的預(yù)后、復(fù)發(fā)、生存、轉(zhuǎn)移、亞型分類、腫瘤侵襲性相關(guān)［4］。信號傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3(Signal transducers and activators 3，STAT3)是HIF－1α 的協(xié)同刺激因子，可激活HIF－1α 下游目標(biāo)基因(如血管內(nèi)皮生長因子等)并驅(qū)動低氧環(huán)境下的HIF－1α 依賴性腫瘤發(fā)生［5］。本研究對2012 年3 月～2014 年8 月收治的68 例初診結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織中HIF－1α 與STAT3 蛋白水平進(jìn)行測定，探討HIF－1α與STAT3 蛋白水平與CRLM 發(fā)生率之間的關(guān)系，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2012 年3 月～2014 年8 月收治的初診結(jié)直腸癌患者68 例，男性43 例，女性25 例，中位年齡58歲(36 ～81 歲)。所有患者均經(jīng)病理活檢確診，腫瘤位于直腸41 例、結(jié)腸27 例;腫塊型腫瘤34 例，潰瘍型21 例，浸潤型13 例;高分化19 例，中度分化40 例，低分化8 例;中腺癌45 例，黏液腺癌18例，未分化癌5 例;Ⅰ～Ⅱ期30 例，Ⅲ～Ⅳ期38例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36 例，無轉(zhuǎn)移32 例;脈管侵犯29例，無脈管侵犯者39 例。對照組為結(jié)直腸息肉患者35 例，亦經(jīng)內(nèi)鏡下病理活檢確診。結(jié)直腸癌的治療均參照2010 年NCCN《結(jié)直腸癌診療指南中文版》進(jìn)行。

1.2 觀察指標(biāo)

1.2.1 HIF－1α 及STAT3 的表達(dá) 所有受檢者內(nèi)鏡下所取部分組織標(biāo)本迅速凍存至－80 ℃，用以檢測HIF－1α 及STAT3 的表達(dá)。采用Western－blot 法，利用液氮、研缽粉碎組織，加入RIPA 緩沖液，PMSF，采用Polytron 4 ℃15 000 r/min 勻漿1 min，移入離心管4℃15 000 r/min 離心15 min，取上清液，采用二喹啉甲酸(BCA，東莞市瓦里西化工有限公司)定量總蛋白。取30 μg 總蛋白經(jīng)10%聚丙烯凝膠電泳、聚偏氟乙烯(PVDF)膜+5%脫脂牛奶室溫封閉后，加入HI－1α(上海常斤生物科技有限公司)、STAT3 一抗(上海安妍生物科技有限公司)，4 ℃過夜孵育，洗膜后加入二抗，室溫孵育1 h 再次洗膜，經(jīng)化學(xué)發(fā)光(ECL)曝光(2 min)、顯影(1 min)及定影，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析蛋白條帶灰度值，以β－actin 作為內(nèi)參，按HIF－1α(或STAT3)/β－actin 計算兩者的相對表達(dá)量。分析比較CRLM 病例與非CRLM 病例臨床資料及HIF－1α 和STAT3 表達(dá)。

1.2.2 隨訪 所有患者隨訪6 ～22 月。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 19.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，均數(shù)比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用LSD 法。計數(shù)資料采用非參數(shù)檢驗的Fisher exact test 及Kruscal Wallis H 檢測進(jìn)行評估。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料

經(jīng)系統(tǒng)治療后，68 例結(jié)直腸癌患者中，11 例在隨訪過程中出現(xiàn)CRLM(11/68，16.18%)。與初診時的臨床特征比較，非CRLM 組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者明顯低于CRLM 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.036)，而年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤形態(tài)、分化程度、TNM分期、脈管侵犯等因素在CRLM 組與非CRLM 組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。見表1。

2.2 STAT3 及HIF－1α 的蛋白表達(dá)

3 組患者STAT3、HIF－1α 蛋白表達(dá)水平兩兩比較，CRLM 組＞非CRLM 組＞對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。見圖1。

2.3 STAT3+、HIF－1α+不同組合時，CRLM 的發(fā)生率

STAT3 蛋白相對表達(dá)量中位數(shù)為2.1，HIF－1α 蛋白相對表達(dá)量中位數(shù)為1.7。分別根據(jù)蛋白表達(dá)的中位數(shù)將患者分為陰性組(≤中位數(shù)組，n=34)及陽性組組(＞中位數(shù)組，n=34)。不同組合見表2，結(jié)果顯示初診結(jié)直腸癌患者治療前活檢腫瘤組織STAT3、HIF－1α 同時過表達(dá)時，患者出現(xiàn)異時性CRLM 的幾率明顯高于單獨過表達(dá)或均不過表達(dá)的患者(P ＜0.05)。見表2。

表1 非CRLM 組與CRLM 組患者就診時臨床特征Tab.1 Comparison of clinical features between CRLM and non－CRLM group

圖1 不同分組中的HIF－1α、STAT3蛋的表達(dá)水平Fig 1.The variation trend of relative expression level of STAT3 and HIF－1αh group

表2 兩組結(jié)直腸癌患者STAT3+與HIF－1α+不同組合時，CRLM 發(fā)生率Tab 2.The incidence rate of CRLM in terms of different combination of HIF－1α and STAT3 protein expression

3 討論

腫瘤細(xì)胞的相對缺氧可應(yīng)激性的導(dǎo)致HIF－1α 表達(dá)上調(diào)，并驅(qū)動糖酵解及腫瘤細(xì)胞的能量代謝及生物學(xué)特性改變，其上調(diào)程度與腫瘤患者的生存率、緩解率呈負(fù)相關(guān)，并可導(dǎo)致耐藥及預(yù)后不良(獨立危險因素)［6－8］。有研究表明HIF－1α 在結(jié)直腸癌早期即出現(xiàn)高表達(dá)，且隨病程進(jìn)展進(jìn)行性增高，可作為肝臟轉(zhuǎn)移的獨立危險因素，而其他相關(guān)分子標(biāo)記物如P53，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，Glut－1 及癌胚抗原－9(CA－9)等卻并未顯示出類似的相關(guān)性［9－11］。STAT3 可協(xié)同HIF－1α 激活HIF－1α 的下游基因并驅(qū)動低氧環(huán)境下的HIF－1α 依賴性腫瘤發(fā)生，并與人結(jié)直腸癌的臨床特征、預(yù)后密切相關(guān)［12－14］。然而，目前尚無關(guān)于STAT3與HIF－1α 協(xié)同表達(dá)與結(jié)直腸癌CRLM 的相關(guān)臨床報道。

本研究中，除淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移因素與CRLM 的發(fā)生有關(guān)外，與年齡、性別、腫瘤部位、直徑、形態(tài)、分化程度、分期、脈管侵犯等因素?zé)o關(guān)。與既往研究傾向于將結(jié)直腸癌治療前的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、年齡等作為異時性CRLM 的危險因素的觀點不符［8－14］?？赡苁怯捎诒敬窝芯繕颖玖枯^小所致。本研究還發(fā)現(xiàn)3 組患者STAT3、HIF－1α 蛋白表達(dá)水平兩兩比較，CRLM 組＞非CRLM 組＞對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。該結(jié)果與既往研究相同［10］。

本研究還對STAT3、HIF－1α 過表達(dá)(＞中位數(shù))及未過表達(dá)(≤中位數(shù))及其不同組合時的CRLM 發(fā)生率進(jìn)行比較。結(jié)果表明當(dāng)STAT3、HIF－1α 同時過表達(dá)時，患者出現(xiàn)異時性CRLM 的發(fā)生率為60%，明顯高于兩者均未過表達(dá)患者的10%。提示STAT3、HIF－1α 的蛋白表達(dá)程度聯(lián)合分析可有效預(yù)測患者發(fā)生異時性CRLM 的發(fā)生率，可幫助臨床醫(yī)師在治療前進(jìn)行風(fēng)險評估及制定更為有效的個體化治療方案。

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