急性缺血性腦卒中患者外周血紅細胞α?突觸核蛋白寡聚體濃度的研究

蘆林龍，李芳菲，馮 濤*，陳慧敏，郜麗妍

（1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)中心神經(jīng)變性病科，2國家神經(jīng)系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100050）

α?突觸核蛋白是一種相對分子質(zhì)量為14.5ku的蛋白質(zhì)，在多種神經(jīng)退行性疾病中含量增加[1]，但確切的神經(jīng)機制尚不清楚。α?突觸核蛋白相關(guān)的病理改變可發(fā)生在帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）患者的神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚、唾液腺等全身多個系統(tǒng)，是該病經(jīng)典的病理標志物[2?5]。此外，PD患者及多系統(tǒng)萎縮患者外周血α?突觸核蛋白濃度均增加[6]，而阿爾茨海默癥患者也存在α?突觸核蛋白相關(guān)的病理改變[7]。這些研究說明，α?突觸核蛋白病理改變存在于多種神經(jīng)退行性疾病，且可能累及全身多個系統(tǒng)。然而，除了神經(jīng)退行性疾病以外，目前α?突觸核蛋白病理改變與其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病[如急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke，AIS）]的關(guān)系研究較少。

神經(jīng)細胞急性缺血損傷與α?突觸核蛋白有一定聯(lián)系。動物研究發(fā)現(xiàn)，大腦中動脈急性閉塞可誘發(fā)急性氧化應(yīng)激反應(yīng)，并誘發(fā)α?突觸核蛋白聚集[8]。早期研究也發(fā)現(xiàn)，在大腦中動脈閉塞小鼠模型中海馬缺血5min后就開始出現(xiàn)α?突觸核蛋白的異常聚集[9]。此外，陳予東等[10]發(fā)現(xiàn)腦卒中患者血漿中α–突觸核蛋白寡聚體濃度增高。然而，其產(chǎn)生機制和病理意義尚有待進一步研究。此外，外周血紅蛋白α?突觸核蛋白寡聚體濃度與AIS的關(guān)系尚無研究報道。

于是，我們招募正常對照、PD患者和AIS患者并留取血樣標本，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）定量觀察血紅細胞α?突觸核蛋白濃度，并進行組間比較，同時觀察年齡和性別對其含量的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象

招募55名正常對照組、55例PD患者和55例AIS患者。納入標準：（1）PD組受試者符合英國帕金森病腦庫的PD診斷標準；（2）卒中組為急性期缺血性腦卒中患者，其中，急性期定義為病程在2周內(nèi)；（3）有抗凝血樣；（4）簽署知情同意書。正常對照組為與PD患者年齡和性別相匹配的健康老年人。排除標準：（1）繼發(fā)性帕金森綜合征患者；（2）符合癡呆診斷標準，臨床癡呆評定量表（Clinical Dementia Rating，CDR）≥1；（3）頭部CT/MRI提示顱內(nèi)器質(zhì)性病變者；（4）嚴重焦慮、抑郁和精神分裂癥患者；（5）合并心臟、肺、肝臟、腎臟、內(nèi)分泌、血液系統(tǒng)嚴重疾病患者；（6）患有失語、嚴重構(gòu)音障礙等影響臨床測評的疾??；（7）預(yù)計依從性較差的患者。

1.2 紅細胞的提取

EDTA?抗凝管采集樣本血液10ml，低速短時離心（2 000轉(zhuǎn)/min，4℃，20min）；吸取血漿：上層透明的黃色血漿（留?。?；洗滌：下層暗紅色的紅細胞加入1倍體積的1×PBS溶液，輕輕混勻；低速短時間離心后棄上清，重復(fù)3次；最后一次離心棄上清后，加入1倍體積的1×PBS溶液，輕輕混勻后分裝，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 免疫組化分析

1.3.1 重組人α?突觸核蛋白的制備和純化將含有α?突觸核蛋白基因的pET重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌B121感受態(tài)細胞中，在含氨芐青霉素的2*YTA培養(yǎng)液中培養(yǎng)至適當濃度后加入IPTG誘導(dǎo)蛋白表達3h，超聲破碎，進一步用離子交換分層、疏水層分析及反相層析純化后獲得α?突觸核蛋白，冷凍-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 α?突觸核蛋白寡聚體標準品的制備將α?突觸核蛋白凍干粉末用PBS溶解使其終質(zhì)量濃度為100μmol/L，經(jīng)0.22μm濾膜過濾細菌，在37℃下650轉(zhuǎn)/min恒溫震蕩72h。

1.3.3 雙抗體夾心ELISA法測定紅細胞α?突觸核蛋白寡聚體濃度用濃度1mg/L3D5單抗包被96孔酶標板，2.5%明膠封閉2h。加用封閉液稀釋生物素化的3D5抗體，向酶標板每孔加入100μl，孵育；用封閉液稀釋親和素標記的堿性磷酸酶（1︰5000），向酶標板每孔加入100μl，孵育；向酶標板每孔加入100μl pNPP，顯色；用酶標儀測定405nm處吸光度值（A405nm）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以均值±標準差表示，3組組間比較采用方差分析（ANOVA）及驗后檢驗；非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（百分位數(shù)間距）表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗。計數(shù)資料和等級資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 α?突觸核蛋白寡聚體濃度組間差異性分析

正常對照組、PD組及AIS組各組紅細胞α?突觸核蛋白寡聚體濃度均符合正態(tài)分布。血紅細胞α?突觸核蛋白寡聚體在正常對照組、PD組及AIS組中分別為（0.41±0.14）、（0.82±0.55）及（1.01±0.56）mmol/L。ANOVA示3組患者紅細胞α?突觸核蛋白寡聚體濃度差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝24.305，P＜0.001）。驗后檢驗示PD患者紅細胞α?突觸核蛋白寡聚體濃度顯著高于正常對照組（P＜0.001，95%CI 0.230～0.577）；AIS組患者紅細胞α?突觸核蛋白寡聚體濃度顯著高于正常對照組（P＜0.001，95%CI 0.426～0.773）及PD組患者（P＝0.027，95%CI 0.022～0.369；圖1）。

圖1 3組患者血紅細胞α?突觸核蛋白寡聚體濃度比較Figure1 Comparison of the oligomeric α-synuclein levels in the red blood cells among the three groups

2.2 性別對AIS患者血紅細胞α?突觸核蛋白寡聚體濃度影響

55例AIS患者中男性43例，女性12例。血紅細胞α?突觸核蛋白寡聚體濃度在男性患者中為（1.01±0.58）mmol/L，女性患者中為（1.03±0.51）mmol/L。男性AIS患者與女性患者相比，血紅細胞α?突觸核蛋白寡聚體濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05；圖2）。

圖2 不同性別AIS患者血紅細胞α?突觸核蛋白寡聚體濃度比較Figure2 Comparison of oligomeric α-synuclein levels in the red blood cells between different genders in the patients with AIS

2.3 AIS患者及PD患者中α?突觸核蛋白寡聚體濃度與年齡相關(guān)性

AIS患者年齡為（57.6±12.1）歲，PD患者年齡為（54.4±11.8）歲。年齡與血紅細胞α?突觸核蛋白寡聚體濃度在AIS患者（r＝0.036，P＝0.793）及PD患者（r＝?0.185，P＝0.190）中均無顯著相關(guān)性（圖3，圖4）。

圖3 AIS患者血紅細胞α?突觸核蛋白寡聚體濃度與年齡的關(guān)系Figure3 Correlations between oligomeric α-synuclein levels in the red blood cell and age in patients with AIS

圖4 PD患者血紅細胞α?突觸核蛋白寡聚體濃度與年齡的關(guān)系Figure4 Correlations between oligometric α-synuclein levels in the red blood cell and age in patients with PD

3 討 論

α?突觸核蛋白寡聚體在PD和其他神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機制中具有重要的作用，可以直接導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡[6,11]。在本研究中，我們首次對AIS患者紅細胞中的α?突觸核蛋白寡聚體進行了定量研究。結(jié)果表明，AIS患者紅細胞α?突觸核蛋白寡聚體的含量明顯高于對照組，甚至高于PD患者，但其濃度與性別、年齡無關(guān)。

AIS患者外周血紅細胞α?突觸核蛋白含量升高，且升高程度較PD患者更為顯著。這提示α?突觸核蛋白的功能異?？赡懿皇荘D患者的特異性改變。研究顯示，在阿爾茲海默癥患者[12]及多系統(tǒng)萎縮患者[6]中均存在α?突觸核蛋白的功能改變，與我們的研究結(jié)果一致。

α?突觸核蛋白廣泛存在于人體細胞中，其功能和致病機制尚不明確。研究指出α?突觸核蛋白可調(diào)節(jié)突觸傳遞功能、突觸囊泡密度和神經(jīng)元可塑性[13,14]，其異常增高可以形成路易小體，從而導(dǎo)致細胞死亡。α?突觸核蛋白寡聚體具有細胞毒性，在神經(jīng)退行性疾病中有重要作用[15]，但其在急性腦血管事件中所扮演角色尚缺乏解釋。陳予東等人對腦卒中患者血漿進行分析，發(fā)現(xiàn)血漿α?突觸核蛋白寡聚體濃度增高。他們猜測：這可能是因為腦梗死部位缺血、缺氧，能量代謝下降，導(dǎo)致缺血神經(jīng)元胞膜破裂或分泌囊泡釋放α?突觸核蛋白至細胞間質(zhì)，進一步彌散至血漿中[10]。本研究發(fā)現(xiàn)的AIS患者外周血紅細胞中α?突觸核蛋白寡聚體濃度升高，進一步驗證了急性缺血事件與α?突觸核蛋白病理改變的關(guān)系，但并不支持陳予東等人提出的假說。我們猜測：AIS患者外周血及血漿內(nèi)α?突觸核蛋白寡聚體濃度增加是由氧化應(yīng)激損傷誘發(fā)的。

早期研究發(fā)現(xiàn)，在大腦中動脈閉塞小鼠模型中海馬缺血5min后就開始出現(xiàn)α?突觸核蛋白的異常聚集[9]。具有細胞毒性的α?突觸核蛋白的異常聚集可能導(dǎo)致神經(jīng)細胞的缺血損傷[16]。這提示，神經(jīng)細胞中α?突觸核蛋白的異常聚集可能是神經(jīng)細胞缺血性損傷的機制之一。近期動物研究發(fā)現(xiàn)，大腦中動脈急性閉塞可誘發(fā)急性氧化應(yīng)激反應(yīng)，并誘發(fā)α?突觸核蛋白聚集[8]。在PD和阿爾茲海默癥患者中，氧化應(yīng)激可能是導(dǎo)致α?突觸核蛋白異常聚集的原因之一[12,17]。因此，我們認為氧化應(yīng)激也可能導(dǎo)致急性缺血事件中α?突觸核蛋白細胞內(nèi)異常聚集。我們猜測：AIS患者神經(jīng)細胞急性缺血不僅引起神經(jīng)細胞的氧化應(yīng)激損傷，也可能引起外周細胞（如外周血紅細胞）的氧化應(yīng)激損傷，從而引起α?突觸核蛋白功能異常。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，AIS患者外周血紅細胞α?突觸核蛋白寡聚體濃度顯著升高。外周血紅細胞α?突觸核蛋白寡聚體濃度改變可能參與急性缺血事件的病理生理改變，但其是否能夠作為疾病早期診斷、反映預(yù)后的生物學(xué)標記物或能否作為AIS的獨立危險因素，有待進一步研究。在未來的研究中，我們需要對AIS患者外周血α?突觸核蛋白寡聚體濃度及其他危險因素進行流行病學(xué)研究；同時對缺血性腦卒中患者外周血α?突觸核蛋白寡聚體濃度與疾病的嚴重程度之間的關(guān)系及其神經(jīng)損傷機制進一步進行研究。

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