PEP－3與HBc融合原核表達載體的構(gòu)建與表達

楊 星，陳 皓，葉明付，代 鑫，夏海濱

（陜西師范大學 生命科學學院，秦巴山區(qū)可持續(xù)發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 西安710119）

乙肝病毒核心蛋白（Hepatitis B Virus Core Protein，HBc）是構(gòu)成乙肝病毒（Hepatitis B Virus，HBV）核心抗原（Hepatitis B Core Antigen，HB－cAg）的主要單體蛋白［1］，能夠形成二十面體對稱病毒樣粒子（Virus－like Particles，VLPs）的結(jié)構(gòu)［2］，可被用來展示外源序列。作為免疫載體蛋白［3］，HBc可在自身表面重復且高密度地展示外源性序列，從而誘發(fā)強有力的體液或細胞免疫反應，同時對免疫檢測也有放大作用。使用單克隆抗體研究發(fā)現(xiàn)，位于HBc衣殼表面刺突頂端的78—82位氨基酸是它的主要免疫顯性區(qū)域（Major Immunodominant Region，MIR）。MIR為特異性抗原小肽的插入提供了極佳位點［4］。HBc作為抗原表位小肽的載體蛋白，形成的 HBc－VLPs［5］，在研究表位小肽疫苗的制備及應用等方面具有巨大的應用前景。

人表皮生長因子受體突變體Ⅲ（EGFRvⅢ）首次在多形性膠質(zhì)母細胞瘤中發(fā)現(xiàn)，普遍存在于多種惡性腫瘤細胞表面［6－7］。EGFRvⅢ 由 EGFR 缺失2—7外顯子區(qū)域所致。EGFRvⅢ的胞外區(qū)域形成了一段含有13氨基酸的特異性小肽片段，其氨基酸序列為LEEKKGNYVVTDH，該小肽被命名為PEP－3［8－9］。據(jù)報道，針對 EGFRvⅢ表面特異性小肽的腫瘤疫苗已用于小鼠動物腫瘤模型的實驗研究［10］。由于EGFRvⅢ中的PEP－3小肽僅在腫瘤細胞表面特異性表達，因此PEP－3可以作為腫瘤治療中理想的靶分子，針對PEP－3的腫瘤疫苗將在腫瘤治療中發(fā)揮重要的作用。

目前，抗原表位小肽在治療性或預防性疫苗的研究中得到廣泛應用。為了快速檢測抗原表位小肽作為疫苗的效果，本研究通過小肽的一步連接及陽性克隆的藍白班篩選，構(gòu)建了嵌合可呈現(xiàn)抗原表位小肽的HBc病毒樣粒子的原核表達載體。在此基礎上，為了進一步測試該載體，我們將腫瘤特異性表位小肽PEP－3插入該載體，利用藍白班篩選原理獲得HBc／PEP－3融合蛋白的原核表達載體，并通過大腸桿菌原核表達及純化獲得HBc／PEP－3融合蛋白。呈遞抗原表位小肽的乙肝病毒核心蛋白類病毒顆粒通用原核表達載體的構(gòu)建為研究其他表位小肽的疫苗作用奠定基礎，同時 HBc／PEP－3融合蛋白的表達與純化也為后續(xù)PEP－3小肽抗腫瘤疫苗的實驗治療研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒pET－28a（＋）、大腸桿菌 E.coli DH5α、BL21（DE3）均由本實驗室保存，限制性內(nèi)切酶為Fermentas公司產(chǎn)品，pGEM－T Easy Vector，T4 DNA連接酶購自Promega公司。rTaq酶為TaKa－Ra公司產(chǎn)品，DNA Marker為Hybigen公司出品，DNA凝膠回收試劑盒購于AXYGEN公司，所有引物由華大基因公司合成。增強型化學發(fā)光底物試劑盒、Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder、PageRuler Unstained Protein Ladder 購 自Thermo 公 司，蛋 白 純 化 所 用 Ni－NTA His－Bind Resin為Novagen公司產(chǎn)品，鼠源Anti－His Antibody購自天根公司，辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG購自中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 攜帶BamHⅠ及SfuⅠ單一位點的基因片段HBc－BS的獲得 根據(jù)Gene Bank公布的HBV基因組（GI 22203511）信息，以本實驗室已有的HBc的基因片段作為模板，使用引物P1（AGAATTCATGGACATTGACCCGTATAA）及P2（TTCGAATATGTGAAGCTTGGATCCATTACTT CCCACCCAGGT）擴增 HBc－BS 基因F1片段（即包含HBc基因1－225bp的片段），在F1片段的5′－端引入EcoRⅠ位點，3′－端引入BamHⅠ－SfuⅠ位點；使用引物P3（GGATCCAAGCTTCACATATTCGAATTAGTAGTCAGCTAT）及 P4（TCTCGAGTTAACACTGAGATTCCCGAGAT）擴 增HBc基因F2片段（即包含HBc基因247－552bp的片段），在F2片段的5′－端引入BamHⅠ－SfuⅠ位點，3′－端引入XhoⅠ位點。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳回收后，采用Overlap PCR方法，以P1及P4為引物，F(xiàn)1，F(xiàn)2為模板，擴增獲得HBc MIR區(qū)域78—82位氨基酸缺失的HBc基因片段。此外，在缺失HBc MIR片段的區(qū)域兩側(cè)分別攜帶單一的限制性內(nèi)切酶位點BamHⅠ及SfuⅠ位點，將獲得的片段命名為HBc－BS，約564bp。回收產(chǎn)物連至pGEM－T easy載體，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化后，獲得的陽性克隆經(jīng)酶切鑒定和測序確認，命名為pGEM－T Easy／HBc－BS，于－20℃存儲備用。

1.2.2 pRGHBc－BS／Lac Zα原核表達通用載體構(gòu)建

限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切原核表達載體pET－28a（＋），隨后將一段兩端攜帶BamHⅠ與XhoⅠ粘性末端的多克隆位點片段連入上述酶切載體中，從而導致載體中的BamHⅠ位點發(fā)生突變，所獲得的陽性克隆稱為pET－28a（＋）／BX。多克隆酶切位點片段序列為：GGATCGGTCGACGAATTCTTCGAAGGATCCACAGTGGTACCCTCGAG。

載體pGEM－T Easy／HBc－BS經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，將獲得的片段HBc－BS連入經(jīng)相同酶切的表達載體pET－28a（＋）／BX中，經(jīng)酶切鑒定并測序確認后，獲得的陽性克隆命名為pRGHBc。

將兩端攜帶BamHⅠ與SfuⅠ粘性末端的Lac Zα片段連入同樣酶切的載體pRGHBc中。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α，37℃孵育1.5h后，全菌液與50μL 40mg／μL X－gal混勻，涂至 Kan＋抗性LB固體培養(yǎng)基平板上。37℃培養(yǎng)過夜，利用藍白斑篩選，挑取藍色單菌落，對所提取的質(zhì)粒DNA進行酶切鑒定，獲得陽性克隆。所獲得的陽性克隆載體可以作為一種通用的原核表達載體，可用于獲得表面呈現(xiàn)抗原表位小肽的HBc類病毒顆粒，該載體命名為pRGHBc－BS／Lac Zα。

1.2.3 表面呈現(xiàn)PEP－3小肽的HBc融合蛋白表達載體pRGHBc－BS／PEP－3構(gòu)建 PEP－3基因序列共39 bp，序列為 CTGGAGGAAAAGAAAGG TAATTATGTGGTGACAGATCAC ?；蚱蜭1（GATCCCTGGAGGAAAAGAAAGGTAATTATGTGGTGACAGA TCACTT）及 L2（CGAAGTGATCTGTCACCACATAATTACCTTTCTTTTCCTCCAGG ）由華大基因公司合成，室溫退火2h后，獲得兩端帶有BamHⅠ、SfuⅠ粘性末端的PEP－3基因片段。載體pRGHBc－BS／Lac Zα經(jīng)BamHⅠ及SfuⅠ雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳回收pRGHBc－BS載體，并將退火所形成的PEP－3片段連入其中，所獲得的陽性克隆命名為pRGHBc－BS／PEP－3。

1.2.4 抗原表位小肽PEP－3的 HBc融合蛋白原核表達及純化 將重組質(zhì)粒 pRGHBc－BS／PEP－3電轉(zhuǎn)至大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21（DE3），條件為1 500V，5.0ms。加1mL無抗性LB培養(yǎng)基后，37℃孵育2h，取20μL菌液均勻涂至Kan＋抗性LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜。次日挑取單克隆至5mL Kan＋抗性液體培養(yǎng)基中，225r／min，37℃搖床培養(yǎng)。至菌液OD600＝0.35時進行異丙基β－D－1－硫代半乳糖苷（IPTG，Isopropylβ－D－1－Thiogalactopyranoside）誘導，IPTG 終濃度為1mmol／L。誘導5h后收集菌液，留樣進行檢測。以IPTG誘導前菌液作為對照組。

將誘導后的菌液100mL，7 000r／min，4℃離心10min，棄上清培養(yǎng)基，收集離心后沉淀。首先采取非變性法處理目的蛋白，即用1×Lysis Buffer（pH＝8.0）重懸菌體，加溶菌酶至終濃度為1mg／mL，冰上靜置30min。超聲破碎2×5min后，4℃，13 200r／min離心10min，棄上清，收集沉淀。隨后用1mol／L尿素漂洗沉淀2次，洗去不溶性碎片后，13 200r／min離心10min后收集沉淀。最后采用變性的方法，8mol／L尿素重懸沉淀。超聲破碎2min，相同條件下離心后，收集上清。4℃、旋轉(zhuǎn)條件下，目的蛋白與Ni－NTA結(jié)合3h。采用梯度洗脫純化目的蛋白，咪唑終濃度分別為40、60、80、300、400、900mmol／L，在300、400mmol／L咪唑濃度范圍內(nèi)收集目的蛋白。同時采用梯度透析方法進行蛋白透析，透析液（咪唑、磷酸緩沖液PBS）中尿素終濃度分別為6、4、1、0mol／L，4℃ 磁力攪拌器攪拌下，每個梯度透析液工作45min。最終收集蛋白，測定蛋白濃度OD280。

1.2.5 重組蛋白 HBc／PEP－3的檢測 純化樣品及透析后樣品與2×SDS Loading Buffer混勻后，95℃變性10min，冰上放置2min。隨后分別進行SDS－PAGE和 Western Blot檢測。

HBc／PEP－3樣 品 經(jīng) 10%SDS－PAGE 進 行 分離，電泳條件為80V，30min，當進入分離膠時，電泳條件改變?yōu)?00V，24min。隨后采用半干法轉(zhuǎn)至PVDF（聚偏二氟乙烯膜）膜上，條件為：13V，35 min。1%脫脂牛奶－PBST溶液，4℃封閉PVDF膜，過夜。一抗為小鼠抗His抗體（His·tag mAb 1∶800稀釋），室溫下孵育2h，PBST洗滌3×8 min。二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG抗體（1∶10 000稀釋），室溫下孵育二抗1.5h，PBST洗滌3×5min，后PBS洗滌3×4min。隨后進行ECL顯色。實驗中以不帶His·tag的GST蛋白為陰性對照，以帶 His·tag的Glrx3－6His蛋白為陽性對照。上述兩種對照蛋白均為本實驗室以往表達并驗證過的蛋白。

2 結(jié)果

2.1 HBc－BS 片段基因的擴增

通過PCR擴增獲得基因片段F1及F2，其長度分別為 230、300bp（見圖1a），然后采用 Overlap PCR法擴增HBc－BS片段，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，獲得一條558bp的特異性條帶，大小與預期結(jié)果相符（見圖1b），結(jié)果表明HBc－BS全長片段擴增成功。最終測序表明，所獲得HBc基因片段中第78—82位氨基酸缺失，且HBc MIR的兩側(cè)成功引入兩個單一特異性的酶切位點BamHⅠ及SfuⅠ。HBc－BS的片段示意圖（見圖1c）。

圖1 HBc－BS基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖及其結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR products and structure schematic diagram of HBc－BSa.HBc－BS 的PCR結(jié)果，M：DNA marker；1：HBc－BS F1片段。2：HBc－BS F2片段。b.HBc－BS 全長的PCR結(jié)果，M：DNA marker；1：HBc－BS 全長。c.HBc－BS 基因片段圖。

2.2 原核表達通用載體pRGHBc－BS／Lac Zα的構(gòu)建與鑒定

通過BamHⅠ和XhoⅠ位點將多克隆位點片段連入pET－28a（＋）載體，經(jīng)測序確認，載體中158 bp處的BamHⅠ位點成功被突變，同時EcoRⅠ、BamHⅠ、SfuⅠ、XhoⅠ單一酶切位點被成功引入載體，表明質(zhì)粒pET－28a（＋）／BX正確構(gòu)建。

通過EcoRⅠ、XhoⅠ位點將HBc－BS片段連入pET－28a（＋）／BX載體中，獲得重組質(zhì)粒pRGHBc。質(zhì)粒pRGHBc經(jīng)HBc－BS兩端的內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切，得到約560bp條帶，表明基因片段HBc－BS成功連入pET－28a（＋）／BX，確定為陽性。質(zhì)粒pET－28a（＋）／BX作為對照，被相同的內(nèi)切酶雙切后，未得到條帶（見圖2a中的1、2泳道）。

圖2 pRGHBc－BS／Lac Zα酶切鑒定圖及其載體示意圖Fig.2 The enzyme digestion and structure schematic diagram of universal expression vector pRGHBc－BS／Lac Zαa.pRGHBc－BS／Lac Zα的酶切鑒定圖，M：DNA marker；1：EcoRⅠ＆XhoⅠ雙切 pRGHBc；2：EcoRⅠ＆XhoⅠ雙切pET－28a（＋）／BX；3：BamHⅠ＆XhoⅠ雙切pRGHBc－BS／Lac Zα；4：BamHⅠ＆ XhoⅠ雙切pRGHBc。b.pRGHBc－BS／Lac Zα的載體結(jié)構(gòu)圖。

通過BamHⅠ、SfuⅠ位點將Lac Zα片段連入pRGHBc載體中，獲得重組質(zhì)粒pRGHBc－BS／Lac Zα。重組質(zhì)粒經(jīng)內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切，得到約800bp條帶，確定為陽性。質(zhì)粒pRGHBc作為對照，經(jīng)相同的內(nèi)切酶雙切后，得到約200bp條帶（見圖2a中的3、4泳道）。電泳結(jié)果表明Lac Zα成功連入pRGHBc表達載體中，為采用一步連接法將抗原小肽連入HBc，原核表達融合蛋白奠定基礎。以上實驗結(jié)果表明，pRGHBc－BS／Lac Zα表達載體構(gòu)建成功（見圖2b）。

2.3 pRGHBc－BS／PEP－3載體的構(gòu)建及鑒定

PEP－3基因片段通過BamHⅠ、SfuⅠ位點將pRGHBc－BS／Lac Zα載體中的Lac Zα片段替代，獲得重組質(zhì)粒 pRGHBc－BS／PEP－3。質(zhì)粒 pRGHBc－BS／PEP－3和pRGHBc－BS／Lac Zα經(jīng)EcoRⅠ、SfuⅠ雙切，前者得到約250bp條帶，后者得到約800bp條帶，二者結(jié)果對比得出，PEP－3片段成功替代Lac Zα片段，連入pRGHBc表達載體（見圖3a）。同時，以HBc基因的上游引物P1及PEP－3基因片段的下游引物L2作為引物、重組質(zhì)粒pRGHBc－BS／PEP－3作為模板，采用PCR法進行鑒定。PCR擴增得到230bp大小條帶，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果與理論推斷相符（見圖3b）。最后測序結(jié)果也證實，pep－3已成功克隆到上述表達載體中。以上實驗結(jié)果表明，pRGHBc－BS／PEP－3載體構(gòu)建成功（見圖3c）。

圖3 pRGHBc－BS／PEP－3酶切鑒定圖及載體示意圖Fig.3 The schematic diagram and identification of expression vector pRGHBc－BS／PEP－3a.pRGHBc－BS／PEP－3的酶切鑒定圖，M：DNA marker；1：EcoRⅠ＆SfuⅠ雙切 pRGHBc－BS／PEP－3；2：EcoRⅠ＆SfuⅠ雙切pRGHBc－BS／Lac Zα。b.pRGHBc－BS／PEP－3的PCR鑒定結(jié)果，M：DNA marker；1：PCR結(jié)果；2：陰性對照。c.pRGHBc－BS／PEP－3的載體結(jié)構(gòu)圖。

2.4 HBc／PEP－3融合蛋白的原核表達及純化

重組質(zhì)粒pRGHBc－BS／PEP－3轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導表達融合蛋白 HBc／PEP－3。表達產(chǎn)物經(jīng)超聲裂解后，采用Ni－NTA柱對表達的HBc／PEP－3重組蛋白進行親和純化。純化目的蛋白進行蛋白復性后再次測定濃度，所獲得的融合蛋白濃度大約為0.6mg／mL。HBc／PEP－3融合蛋白經(jīng)純化后，經(jīng)SDS－PAGE電泳顯示所得到的蛋白分子量大小約27kDa（見圖4a剪頭所示），與預測的分子量相吻合。通過Western blot進一步驗證，得到分子量約27kDa的單一條帶。以上實驗結(jié)果表明，HBc／PEP－3表達與純化成功，為下一步的實驗奠定了基礎。

圖4 融合蛋白HBc／PEP－3原核表達純化產(chǎn)物的SDS－PAGE分析及其Western blot鑒定Fig.4 SDS－PGAE profile and Wstern blot identification of fusion protein HBc／PEP－3expressed from prokaryotic expression vectora.融合蛋白 HBc－PEP3的SDS－PAGE分析，箭頭所指為目的蛋白；1：洗脫液1，咪唑濃度為300mmol／L；2：洗脫液；2：咪唑濃度為400mmol／L。b.Western Blot鑒定；M：蛋白 Marker；1：融合蛋白 HBc／PEP－3；2：陰性對照蛋白GST；3：陽性對照蛋白Glrx3－6His。

3 討論

本研究成功構(gòu)建了表面呈現(xiàn)抗原小肽的HBc類病毒顆粒的通用原核表達載體。同時在此基礎上，進行了嵌有PEP－3小肽的 HBc／PEP－3融合蛋白的原核表達載體的構(gòu)建、表達及純化，并通過Western blot對所表達的融合蛋白進行鑒定。實驗結(jié)果表明，該通用載體的構(gòu)建提高了嵌有抗原表位小肽的HBc類病毒顆粒的原核表達，降低了實驗成本，可為深入研究各種小肽在腫瘤疫苗治療中的作用提供良好的實驗平臺。以PEP－3小肽為例所獲得的HBc－PEP－3融合蛋白將在腫瘤疫苗的研發(fā)及單克隆抗體的制備中發(fā)揮作用。

近年來，以HBc作為免疫載體蛋白在腫瘤免疫治療方面顯示出巨大的應用前景。相關研究利用HBc－VLPs進行抗原的遞呈，如 Ravin NV等人［11］利用攜帶有M2蛋白的HBc－VLPs制備流感疫苗；或者利用HBc－VLPs高效的外源序列展示效果，進行特異性抗體的制備，如Sun Chang等人［12］在HBc－VLPs的抗原展示系統(tǒng)上，獲得了針對AFP、MGAE－1的多克隆抗體。本研究寄希望于借助HBc免疫原性高，可攜帶高拷貝數(shù)免疫抗原等特點［13］，將抗原表位小肽嵌合至HBc表面，獲得表面呈現(xiàn)抗原表位小肽的HBc－VLPs，制備具有高效特異免疫原性的抗原蛋白，為腫瘤免疫治療或抗體制備提供良好的抗原來源。

相關文獻報道，來源于EGFRvⅢ特異性小肽的疫苗接種對腦部腫瘤的治療效果顯著［14］，本研究以PEP－3為例，將PEP－3基因插入HBc基因的225 bp處，使其在大腸桿菌BL21（DE3）中表達融合蛋白HBc／PEP－3。結(jié)果表明：重組基因可在大腸桿菌中表達，融合蛋白主要以包涵體的形式存在于菌體中。融合蛋白HBc／PEP－3的表達為后續(xù)研究抗原融合蛋白在惡性腦膠質(zhì)母細胞瘤動物模型體內(nèi)引發(fā)免疫應答［15－16］，及針對腫瘤的疫苗治療研究等奠定實驗基礎。

文獻報道HBc核心蛋白單體MIR區(qū)域插入外源抗原小肽后，仍能夠形成由240個亞基聚集而成正二十面體殼粒結(jié)構(gòu)［1］，根據(jù) HBc蛋白單體及HBV衣殼蛋白二聚體的結(jié)構(gòu)模式圖分析［17］，單體結(jié)構(gòu)中蛋白C端可能游離暴露在外端，而經(jīng)包裝后，C端則會被包裹在 HBc－VLPs內(nèi)部，從而對HBc／抗原小肽融合蛋白的純化造成影響。此猜想在本試驗實驗過程中，通過親和層析、Western blot試驗均得到驗證（結(jié)果未顯示）。關于HBc蛋白聚集成二聚體或顆粒結(jié)構(gòu)的詳細組裝過程，仍需進一步研究。為了提高蛋白純化效率及純度，本實驗選擇了在目的蛋白N端和C端均表達6His·tag的商業(yè)化載體pET－28a（＋），此商業(yè)化載體經(jīng)改造后用于表達嵌有抗原表位小肽的HBc融合蛋白的表達與純化。同時，分別采用非變性法（1×Lysis buffer溶解蛋白）和變性（8mol／L尿素溶解蛋白）進行蛋白純化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)8mol／L尿素處理蛋白后，對親和鎳柱的結(jié)合效率明顯高于非變性法處理效果。其次，實驗結(jié)果與預實驗（全菌液蛋白直接進行純化）結(jié)果相較，大腸桿菌自身表達的蛋白大部分溶解在1×Lysis buffer中，沉淀中雜蛋白含量較少，多數(shù)為目的蛋白。因此為了減少其他雜蛋白在純化過程中的非特異性結(jié)合，本實驗采取提取包涵體的方法進行目的融合蛋白的純化。

4 結(jié)論

本文成功構(gòu)建了表面呈現(xiàn)抗原小肽的HBc融合蛋白的原核通用表達載體，借此通用載體可實現(xiàn)表面呈遞抗原小肽的HBc融合類病毒顆粒表達載體的構(gòu)建。實驗利用通用載體成功構(gòu)建表達載體pRGHBc－BS／PEP－3，并在大腸桿菌中成功表達和純化融合蛋白HBc／PEP－3。本實驗對此通用載體所表達的融合蛋白的純化條件進行了探索，初步獲得了利用此載體進行融合蛋白的表達和純化策略，為該載體以后在基于HBc的表位抗原表達及其在疫苗等應用研究方面奠定了基礎。

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