B7家族在非霍奇金淋巴瘤中的表達(dá)及意義

魯 一,韓麗娟,慕竹青,周林靜,孟娜娜,馬曉艷,齊路霞,項(xiàng)紅霞,何秋立,張桂芳

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,新鄉(xiāng) 453000)

非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma,NHL)是惡性淋巴瘤中較常見的一大類型,主要發(fā)生于淋巴結(jié),也可發(fā)生于結(jié)外淋巴組織和非淋巴組織,其腫瘤行為從惰性到侵襲性不等。預(yù)后較差的高度惡性淋巴瘤在我國發(fā)病率較高,約占NHL的30%[1]。NHL是一種異質(zhì)性較強(qiáng)的疾病,根據(jù)不同的淋巴細(xì)胞起源,可分為B細(xì)胞淋巴瘤(B-NHL)、T細(xì)胞淋巴瘤(T-NHL)和NK/T細(xì)胞淋巴瘤(NKTL)。除少數(shù)類型外,T-NHL及NKTL較B-NHL侵襲性強(qiáng)、預(yù)后差。NHL患者往往存在著免疫抑制或免疫紊亂,我們考慮NHL可能通過某種機(jī)制逃避了機(jī)體的免疫監(jiān)視和殺傷。而免疫逃逸機(jī)制的差異可能在決定NHL不同腫瘤類型中起到了關(guān)鍵作用。PD-L1和PD-L2是B7家族共刺激分子的重要成員。研究發(fā)現(xiàn)[2,3],多種惡性腫瘤細(xì)胞通過高表達(dá)PD-Ls,與其受體PD-1(programmed death-1,PD-1)結(jié)合傳遞負(fù)性調(diào)控信號(hào),從而誘導(dǎo)腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的凋亡和免疫無能,促使腫瘤的免疫逃逸。我們考慮NHL可能通過高表達(dá)B7家族,與其受體PD-1相互作用,從而介導(dǎo)腫瘤的免疫逃逸。本文主要檢測(cè)PD-L1和PD-L2在NHL中的表達(dá),并探討其意義,旨在為NHL各淋巴瘤亞型尋找新的免疫治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基購自Solarbio生物公司;無支原體胎牛血清(fetal booine serum,FBS)購自杭州四季青公司;人AB血清由河南省中心血站提供;非必需氨基酸購自Thermo公司;人淋巴細(xì)胞分離液購自天津?yàn)笊锕?RNA提取試劑盒購自北京天根生物公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas;引物均由上海生工合成;SYBR Green Mixture購自北京康為世紀(jì)。

1.2 細(xì)胞系及培養(yǎng)

NKTL細(xì)胞系SNK-6及SNK-8由日本千葉大學(xué)Norio Shimizu教授惠贈(zèng),培養(yǎng)于含人AB血清(10%)和IL-2(1 000U/ml)的RPMI 1640培養(yǎng)基中。YTS細(xì)胞系由美國Mayo醫(yī)學(xué)中心Scott Kaufmann教授惠贈(zèng),培養(yǎng)于含非必需氨基酸(1%)和FBS(10%)的RPMI 1640培養(yǎng)基中。急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系Jurkat、間變大細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系Karpas-299、皮膚T-NHL細(xì)胞系Hut-78、B-NHL細(xì)胞系LY-1和LY-8、Burkitt’s淋巴瘤細(xì)胞系Ramos均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所,均用含F(xiàn)BS(10%)的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。所有細(xì)胞系均置于37oC、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2～3d換液。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 外周血單個(gè)核細(xì)胞的提取

收集健康志愿者新鮮外周血,肝素抗凝,用等體積的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS;pH＝7.2)稀釋;吸取2倍體積的淋巴細(xì)胞分離液置于離心管中,毛細(xì)滴管吸取已稀釋的血標(biāo)本沿管壁緩慢加入分離液面上(切勿沖破液面),3 000轉(zhuǎn)/min離心20min;然后吸取中間白色云霧層,所得即為外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood monocyte cells,PBMCs),經(jīng)PBS洗滌,2 000轉(zhuǎn)/min離心5min后棄上清,重復(fù)操作3次,最后用少量PBS重懸。

1.4 總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄

取5×106個(gè)/ml對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞,操作按離心柱法RNA提取試劑盒說明書,收集RNA約70μl。經(jīng)純度檢測(cè)所有樣品的D260/D280均在1.85～2.00之間。逆轉(zhuǎn)錄操作按Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒程序,反應(yīng)條件:42℃、60min,70℃、5min,4℃、暫停。所得cDNA保存于-20℃冰箱備用。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR,RQ-PCR)檢測(cè)B7家族PD-L1和PD-L2 mRNA在B-NHL、T-NHL及NKTL細(xì)胞系中的表達(dá)水平。按SYBR Green Mixture試劑盒說明書操作。以PBMCs的β-actin基因?yàn)閮?nèi)參照,引物序列如下。PD-L1:F1 CTT CTT ATT ATG CCT TGG TGT TGC A,R1 GGA ATA CGT CTC CTC CAA ATG TG;PD-L2:F1 CAA CAT GGC TGC TTC ACA TTT T,R1 TGT GGT GAC AGG TCT TTT TGT TGT;β-actin:F1 TCA CGT GGA CAT CCG CAA AG,R1 CTG GTA GGT GGA CAG GG。擴(kuò)增產(chǎn)物分別為146bp,110bp及205bp。反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃、10min,變性95℃、15s,變性/延伸60℃、1min,40個(gè)循環(huán)。溶解曲線分析:95℃、15s,60℃、1min,95℃、15s,60℃、15s,得到相應(yīng)Ct值,應(yīng)用ABI 7500 Fast System軟件進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PD-L1和PD-L2 mRNA的擴(kuò)增曲線和溶解曲線

應(yīng)用RQ-PCR對(duì)NHL各細(xì)胞系PD-L1和PD-L2 mRNA的表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量分析,獲得單峰溶解曲線。峰的形狀銳利,顯示擴(kuò)增產(chǎn)物為特異序列(圖1)。

圖1 NHL各細(xì)胞系中PD-L1和PD-L2 mRNA的擴(kuò)增曲線和溶解曲線Figure 1 The amplification curves and dissolution curves of mRNA of PD-L1 and PD-L2 in NHL cell lines

2.2 NHL各細(xì)胞系中PD-L1、PD-L2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量

以正常PBMCs為對(duì)照,NKTL細(xì)胞系(SNK-6、SNK-8和YTS)和T-NHL細(xì)胞系(Jurkat、Karpas-299和Hut-78)中,PD-L1和PD-L2 mRNA表達(dá)量均明顯高于正常PBMCs(P＜0.05)。B-NHL細(xì)胞系(LY-1、LY-8和Ramos)中,PD-L1和PD-L2 mRNA表達(dá)量與正常PBMCs無明顯差異(P＞0.05)。詳見圖2和圖3。

圖2 NHL各細(xì)胞系中PD-L1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量Figure 2 The relative expression of PD-L1 mRNA in NHL cell lines (n＝3, ±s )

圖3 NHL各細(xì)胞系中PD-L2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量Figure 3 The relative expression of PD-L2 mRNA in NHL cell lines (n＝3, ±s )

3 討 論

惡性淋巴瘤在全世界范圍內(nèi)的發(fā)病率及死亡率呈逐年增高趨勢(shì),占惡性腫瘤的4.1%,位居惡性腫瘤的第7位,主要包括霍奇金淋巴瘤和NHL。NHL由于組織學(xué)分類不同,其分子生物學(xué)行為、對(duì)治療的反應(yīng)、臨床過程及預(yù)后等亦不同[1]。我們考慮腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制在NHL不同的組織類型中起到了關(guān)鍵作用。

B7家族作為唯一能從抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell,APC)單向傳遞信號(hào)至T細(xì)胞的共刺激分子,其成員有8種:B7-1(CD80),B7-2(CD86),B7-H1(PD-L1/CD274),B7-DC(PD-L2/CD273),ICOS-L(CD275),B7-H3(CD276),B7-H4和B7-H6[4,5]。PD-L1主要誘導(dǎo)性表達(dá)于激活的T細(xì)胞、B細(xì)胞、APC及人類腫瘤細(xì)胞上[5]。PD-L2和PD-L1在結(jié)構(gòu)、基因序列及功能上相似,有40%的一致性,PD-L2不僅限制性表達(dá)于APC(如:巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞)上,而且誘導(dǎo)性表達(dá)在T細(xì)胞、Th2細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞上[6,7]。PD-Ls主要通過與其受體PD-1結(jié)合傳遞負(fù)性調(diào)控信號(hào),誘導(dǎo)腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的免疫無能或促進(jìn)其凋亡,從而使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和殺傷。

研究證實(shí),PD-Ls/PD-1途徑在慢性感染、炎癥及自身免疫性疾病等中發(fā)揮負(fù)性調(diào)控免疫應(yīng)答的作用[7,8]。最近的研究[9?11]顯示,在多種腫瘤微環(huán)境中(如:惡性黑色素瘤、腎癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌及血液系統(tǒng)惡性腫瘤等),PD-L1參與了腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。朱等[12]發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1途徑調(diào)節(jié)了肺癌惡性胸腔積液中CD8+T淋巴細(xì)胞IFN-γ的分泌,并促進(jìn)了CD8+T淋巴細(xì)胞的凋亡。非小細(xì)胞肺癌中PD-L1與表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor,EGFR)的突變狀態(tài)相關(guān),與PD-L1陰性病例相比,PD-L1陽性病例對(duì)酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor,TKI)治療(如:吉非替尼、厄洛替尼)更敏感,其疾病進(jìn)展時(shí)間明顯延長[13]。這不僅說明PD-L1通過某種途徑抑制了肺癌患者的抗腫瘤免疫,而且有助于篩選靶向治療的優(yōu)勢(shì)人群,預(yù)示了抗PD-L1免疫治療的潛在臨床價(jià)值。在研究卵巢癌細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞溶解中發(fā)現(xiàn)[14],PD-L1高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞其細(xì)胞溶解受到抑制,而將腫瘤細(xì)胞PD-L1基因沉默反而促進(jìn)了其溶解效應(yīng)。在腹膜轉(zhuǎn)移的卵巢癌小鼠模型中,破壞了PD-L1基因后不僅抑制了腫瘤的生長,且延長了其生存期[14]。這充分說明腫瘤細(xì)胞通過高表達(dá)PD-L1而逃避了CTL的細(xì)胞毒作用。

但大多數(shù)研究僅關(guān)注了PD-L1所扮演的角色,而忽視了PD-L2的表達(dá)及意義。Iwamura等[15]發(fā)現(xiàn)PD-L2與T細(xì)胞受體結(jié)合后T細(xì)胞IFN-γ的分泌受到抑制,當(dāng)沉默PD-L2 siRNA后其抑制效應(yīng)解除,這高度提示PD-L2是通過提供負(fù)性調(diào)控信號(hào)來調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能的。本研究同時(shí)檢測(cè)了PD-L1及PD-L2在NHL細(xì)胞系中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)PD-L1及PD-L2在T-NHL、NKTL及B-NHL細(xì)胞株中均呈不同程度表達(dá)。以正常PBMCs為對(duì)照,T-NHL細(xì)胞系及NKTL細(xì)胞系中,PD-L1和PD-L2 mRNA表達(dá)量均明顯高于正常PBMCs。而B-NHL細(xì)胞系中,PD-L1和PD-L2 mRNA表達(dá)量與正常PBMCs均無明顯差異。我們的研究結(jié)果充分顯示,B7家族高表達(dá)于NKTL及T-NHL細(xì)胞系上,這高度提示PD-Ls可能通過對(duì)機(jī)體免疫產(chǎn)生抑制效應(yīng)參與其腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。而在B-NHL中,PD-L1及PD-L2的表達(dá)量與正常PBMCs無明顯差異,可能是由于PD-Ls在其免疫逃逸機(jī)制中的貢獻(xiàn)較小,或者由其他復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制調(diào)控。

本研究表明B7家族高表達(dá)于NKTL及T-NHL細(xì)胞系,這高度提示其可能參與了這兩種淋巴腫瘤的免疫逃逸。PD-L1及PD-L2將成為T-NHL及NKTL免疫治療的新靶點(diǎn)。我們將進(jìn)一步建立功能試驗(yàn)及動(dòng)物模型來闡述B7家族在NHL中的免疫調(diào)節(jié)功能。

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