中心組合-效應(yīng)面法優(yōu)選黔產(chǎn)鐵莧菜總黃酮超聲提取工藝

蒙慧彤，李雪營，趙鴻賓，魏學(xué)軍(黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，貴州 都勻 558000)

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中心組合-效應(yīng)面法優(yōu)選黔產(chǎn)鐵莧菜總黃酮超聲提取工藝

蒙慧彤，李雪營，趙鴻賓，魏學(xué)軍*
(黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，貴州 都勻 558000)

目的：優(yōu)選黔產(chǎn)鐵莧菜總黃酮的超聲提取工藝。方法：以總黃酮轉(zhuǎn)移率為響應(yīng)值，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用中心組合-效應(yīng)面法研究液固比、乙醇濃度、超聲時(shí)間及其交互作用對(duì)總黃酮轉(zhuǎn)移率的影響。結(jié)果：最優(yōu)提取工藝參數(shù)為：乙醇濃度70%，用量33倍，提取2次，每次31min。結(jié)論：本試驗(yàn)優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行。

黔產(chǎn)鐵莧菜；總黃酮；中心組合；效應(yīng)面法；提取工藝

鐵莧菜為大戟科植物鐵莧菜AcalyphaaustralisL.的干燥全草,含黃酮、生物堿、鞣質(zhì)等化學(xué)成分，具有清熱利濕、收斂止血的功能[1]。由于采集方便，療效顯著，在貴州黔南苗族聚集區(qū)應(yīng)用廣泛，苗藥亦稱“海蚌含珠”[2]。研究表明，其所含總黃酮具有抗菌、消炎、抗衰老和增強(qiáng)機(jī)體免疫等作用[3-6]，具有良好的開發(fā)利用前景。本文首次采用中心組合-效應(yīng)面法(CCD-RSM)對(duì)影響黔產(chǎn)鐵莧菜總黃酮超聲提取的因子及因子間的關(guān)系進(jìn)行研究，優(yōu)選提取工藝參數(shù)和建立預(yù)測(cè)模型，為鐵莧菜的進(jìn)一步開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)性理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

Cary-100型雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京安捷倫公司)；SY-1000型超聲波提取儀(北京西化儀公司)；OR型低速離心機(jī)(德國HERAEUS公司)；AE240型電子天平(瑞士METTLER公司)。蘆丁對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100080-200707)，其他試劑均為分析純。鐵莧菜藥材采于本校藥用植物園，經(jīng)鑒定為大戟科植物AcalyphaaustralisL.鐵莧菜的干燥全草，樣本留存于本校中藥標(biāo)本室。

2 方法與結(jié)果

2.1 鐵莧菜總黃酮含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取一定量蘆丁對(duì)照品，加入60%乙醇溶解并于50mL容量瓶中定容，搖勻后得 0.102 4mg/mL的蘆丁對(duì)照品液。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密移取蘆丁對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL分別置于10mL容量瓶中，加60%乙醇至5mL，加5%亞硝酸鈉溶液0.5mL，搖勻放置6min，再加10%硝酸鋁溶液0.5mL，搖勻放置5min，加4%氫氧化鈉溶液4mL，搖勻放置12min。另取2.0mL蒸餾水作為空白對(duì)照，在515nm處分別測(cè)定吸光度，以蘆丁濃度(C)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為：A = 7.498 3C + 0.002 2，R=0.999 5。試驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)照品在10.24～61.44μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 供試品溶液制備 精密稱取過3號(hào)篩干燥至恒重的鐵莧菜粉末1.0g置具塞試管中，按單因素考察試驗(yàn)條件和中心組合試驗(yàn)安排進(jìn)行超聲提取，趁熱抽濾，濾液于水浴上濃縮至無醇味，放涼后加60%乙醇定容至50mL容量瓶中，搖勻，冷藏備用。

2.1.4 總黃酮含量測(cè)定 精密移取上述供試品溶液2.0mL，按“2.1.2”項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備條件測(cè)定總黃酮，計(jì)算總黃酮轉(zhuǎn)移率(mg/g)。

2.2 單因素考察

2.2.1 液固比 按“2.1.3”制備方法取樣5份，在70%乙醇濃度、超聲10min和超聲1次的固定條件下，分別用10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1的液固比提取，按“2.1.4”項(xiàng)測(cè)定。結(jié)果總黃酮轉(zhuǎn)移率分別為2.81、3.14、3.32、3.37、3.38mg/g，轉(zhuǎn)移率隨液固比的增加而逐漸升高，超過30∶1后升高不明顯，這與總黃酮的溶出漸趨平衡有關(guān)，從縮短濃縮時(shí)間的角度考慮，選擇30∶1液固比為宜。

2.2.2 乙醇濃度 按“2.1.3”制備方法取樣5份，在液固比 30∶1、超聲10 min和超聲1次的固定條件下，分別采用50%、60%、70%、80%、90%乙醇提取，按“2.1.4”項(xiàng)測(cè)定。結(jié)果總黃酮轉(zhuǎn)移率分別為2.70、3.67、3.55、3.13、2.67mg/g，轉(zhuǎn)移率在乙醇濃度超過60%后呈逐漸降低趨勢(shì)，這與使用高濃度乙醇導(dǎo)致脂溶性雜質(zhì)溶出增多，產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)抑制作用有關(guān)，故選擇60%乙醇作為提取溶劑。

2.2.3 超聲時(shí)間 按 “2.1.3”制備方法取樣5份，在60%乙醇濃度、液固比30∶1和超聲1次的固定條件下，分別提取10、20、30、40、50min，按“2.1.4”項(xiàng)測(cè)定。結(jié)果總黃酮轉(zhuǎn)移率分別為3.23、3.94、4.30、4.35、4.06mg/g，提取超過30min后，轉(zhuǎn)移率先升后降，原因與時(shí)間過長，乙醇揮發(fā)增多，降低了提取溶劑的濃度有關(guān)，故選擇超聲提取30min。

2.2.4 超聲次數(shù) 按“2.1.3”制備方法取樣3份，在60%乙醇濃度、液固比30∶1和超聲時(shí)間30min的固定條件下，分別提取1、2、3次，按“2.1.4”項(xiàng)測(cè)定。結(jié)果總黃酮轉(zhuǎn)移率分別為3.93、4.61、4.70mg/g，提取2次和3次差異不明顯，從節(jié)約資源和縮短生產(chǎn)周期的角度考慮，選擇提取2次為宜。

2.3 提取工藝條件篩選與結(jié)果

2.3.1 中心組合設(shè)計(jì) 綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取液固比、乙醇濃度、超聲時(shí)間對(duì)總黃酮轉(zhuǎn)移率有顯著影響的三個(gè)因素，確定各因素的上、下限，按中心組合確定因素及水平，見表 1。采用中心組合將因素水平設(shè)計(jì)成 15個(gè)實(shí)驗(yàn)組，其中 12個(gè)為析因?qū)嶒?yàn)，3個(gè)為中心實(shí)驗(yàn)，用以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表 2。

表1 因素水平

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 效應(yīng)面分析方案及結(jié)果 將所有條件和實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng) SAS RSREG回歸，因子經(jīng)過回歸擬合，得回歸方程為：Y=4.61+0.516 3X1-0.285 0X2+0.151 3X3-0.703 8X1X1+0.315 0X1X2-1.241 3X2X2+0.057 5X1X3-0.130 0X2X3-0.628 8X3X3。

回歸方程中各變量對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性用F檢驗(yàn)判定，P值(概率)越小，則響應(yīng)變量的顯著程度越高，P<0.05表示顯著影響，P<0.01表示影響極顯著?；貧w分析結(jié)果見表3。

表3 回歸分析結(jié)果

分析結(jié)果顯示，模型回歸P為0.004 0，說明模型顯著可靠。液固比 X1、X1的平方項(xiàng)、X2的平方項(xiàng)、X3的平方項(xiàng)對(duì)總黃酮轉(zhuǎn)移率影響極顯著(P<0.01)；乙醇濃度 X2對(duì)總黃酮轉(zhuǎn)移率影響顯著(P<0.05)。模型的回歸系數(shù)R2=0.964 6，說明總黃酮轉(zhuǎn)移率變化的96.46%來自所選因變量，即液固比、乙醇濃度、超聲時(shí)間的值。各因素對(duì)總黃酮轉(zhuǎn)移率影響的順序是：液固比(X1)﹥乙醇濃度(X2)﹥超聲時(shí)間(X3)。

2.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化和預(yù)測(cè) 利用Design Expert7.0軟件，通過多元回歸方程作出對(duì)總黃酮轉(zhuǎn)移率影響顯著的兩個(gè)因素的響應(yīng)面圖和等值線圖，響應(yīng)面圖的曲面頂端為最優(yōu)值，結(jié)果見圖 1。由回歸方程解得實(shí)驗(yàn)最優(yōu)工藝條件為：液固比33.46∶1，乙醇濃度59%，超聲時(shí)間31.21min。在此條件下，鐵莧菜總黃酮轉(zhuǎn)移率理論值預(yù)測(cè)可達(dá)4.63mg/g。

圖1 Y=f(X1,X2)的響應(yīng)面圖和等高線圖

2.3.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為便于實(shí)際操作，將CCD-RSM求得的最優(yōu)條件下整理為：液固比33∶1，乙醇濃度60%，超聲時(shí)間31min。按此條件對(duì)鐵莧菜總黃酮平行提取5份，結(jié)果見表4。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=5)

3 討論

目前鐵莧菜總黃酮的提取工藝均采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)選[5-6]，此設(shè)計(jì)方法是基于影響因素與總黃酮轉(zhuǎn)移率呈線性模型的設(shè)計(jì)，即研究因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系，忽視了在最佳試驗(yàn)條件附近影響因素間的非線性變化，即因子與

因子之間的相互關(guān)系，因此預(yù)測(cè)性較差。CCD-RSM是采用多元二次回歸方法作為函數(shù)估計(jì)的工具，研究因子與響應(yīng)值之間、因子與因子之間的相互關(guān)系，通過對(duì)回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計(jì)方法，具有良好的直觀性、方便性及預(yù)測(cè)性，可用于藥學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的相關(guān)研究[7-10]。

驗(yàn)證試驗(yàn)表明，按整合后的工藝進(jìn)行提取，實(shí)際轉(zhuǎn)移率與理論轉(zhuǎn)移率相對(duì)誤差為1.30%，RSD值為0.28%，說明此工藝是科學(xué)、合理的。本試驗(yàn)在單因素考察的基礎(chǔ)上，對(duì)同批次樣本開展了正交試驗(yàn)優(yōu)選，結(jié)果顯示總黃酮平均轉(zhuǎn)移率為4.16mg/g，較CCD-RSM法試驗(yàn)結(jié)果4.57mg/g低，此結(jié)果驗(yàn)證兩種方法間確實(shí)存在一定差異性。

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(責(zé)任編輯：魏 曉)

Optimization on Extraction of Total Flavonoids from Acalypha Astralis L. in Guizhou with Ultrasonic Wave by Central Composite Design-Response Surface Methodology

Meng Huitong，Li Xueying， Zhao Hong-bin，Wei Xuejun*
(Qiannan Medical College for Nationalities, Duyun 558000 China)

Objective:To study the optimum condition of extraction for the total flavonoids in Acalypha Astralis by central composite design-response surface methodology.Methods:Based on the single factor test，we study the effluence of liquid-solid ratio，ethanol concentration and ultrasonic time also with its interaction on the transfer rate of total flavonoids which was the response value.Results:The content of extraction conditions was 70% ethanol，ultrasound 33 min for 2 times，and 31 times the amount of solvent.Conclusion:In this study，the preferred extraction process is stable and feasible.

Acalyphaastralis；Total Flavonoids；Central Composite Design；Response Surface Methodology；Extraction Process

2015-03-17

貴州省教育廳自然科學(xué)研究基金項(xiàng)目(20090119)

蒙慧彤(1987-)，女，黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校助教，研究方向?yàn)樘烊凰幬镩_發(fā)應(yīng)用。

魏學(xué)軍(1972-)，男，黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校副教授，研究方向?yàn)橹兴幣c民族藥質(zhì)量控制研究。E-mail：qndywxj@163.com

R284

A

1673-2197(2015)15-0026-03

10.11954/ytctyy.201515010