TRPM7參與誘發(fā)心肌纖維化作用及藥物干預

周 陽，雷 荃，郭 巧，劉勇慧，王欣偉，湯依群

(中國藥科大學 臨床藥學教研室，江蘇 南京 210009)

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TRPM7參與誘發(fā)心肌纖維化作用及藥物干預

周 陽，雷 荃，郭 巧，劉勇慧，王欣偉，湯依群*

(中國藥科大學 臨床藥學教研室，江蘇 南京 210009)

目的：研究脂多糖(LPS)引起的成纖維細胞上TRPM7通道的上調(diào)和細胞增殖間的關(guān)系，并利用黃芪甲苷進行干預。方法：分離大鼠乳鼠心臟成纖維細胞，分成7組，正常組、模型組(LPS 0.1μg·mL-1、1μg·mL-1)、TRPM7通道阻斷劑組(carvacrol 500μmoL·L-1、2-APB 100μmoL·L-1)、黃芪甲苷(ASG Ⅳ)組(1μmoL·L-1、10μmoL·L-1)，后4組在加入 1μg· mL-1LPS的同時，分別給予500μmoL·L-1carvacrol、100μmoL·L-12-APB、1μmoL·L-1ASG Ⅳ、10μmoL·L-1ASG Ⅳ，孵育72h，通過全細胞膜片鉗技術(shù)檢測TRPM7電流的變化，利用RT-PCR和Western Blot方法分別測定TRPM7通道的基因和蛋白的表達，利用MTT方法測定成纖維細胞的增殖能力。結(jié)果：與正常組相比,LPS兩個組的TRPM7電流大小及基因、蛋白表達明顯升高(P<0.01);與模型組相比,carvacrol、2-APB通道阻斷劑組的電流大小、基因和蛋白表達顯著降低(P<0.01);此外,ASG Ⅳ 對電流、基因和蛋白表達也有不同程度的抑制作用(P<0.05)。模型組的成纖維細胞增殖能力明顯強于其他組(P<0.01)，通道阻斷劑組及黃芪甲苷組均能不同程度抑制細胞的異常增殖(P<0.01)。結(jié)論：脂多糖(LPS)能夠使成纖維細胞上TRPM7電流大小及通道表達上調(diào)，且該上調(diào)能增強細胞增殖能力，而ASG Ⅳ能通過下調(diào)TRPM7表達抑制成纖維細胞的增殖。

LPS；成纖維細胞；TRPM7；黃芪甲苷

心肌成纖維細胞(cardiac fibroblasts)的異常增殖是心肌纖維化的重要病理基礎(chǔ)。成纖維細胞(cardiac fibroblasts)是心臟中數(shù)量最多的細胞類型，生理狀態(tài)下主要起心臟結(jié)構(gòu)支撐的作用；以往的研究忽視了其在病理狀態(tài)下的作用，事實上，在氧化應激、炎癥刺激、細胞因子、機械牽拉等多種病理狀態(tài)的刺激下，成纖維細胞會轉(zhuǎn)化成具有更強增殖、分泌、遷移功能的肌成纖維細胞(cardiac myofibroblasts)，該細胞是纖維化病理過程的重要參與者。TRPM7是瞬時受體電位通道(transient receptor potential channel TRP)家族的成員之一，其具有調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡等作用[1]。文獻報道稱，炎癥性心肌病發(fā)生時常伴隨著心肌纖維化，而由TRPM7通道介導,炎性介質(zhì)影響細胞增殖的現(xiàn)象多見于其他組織和細胞類型[2-4]，影響心肌成纖維細胞增殖的相關(guān)報道較少。黃芪甲苷(Lipopolysaccharide LPS)是具有調(diào)節(jié)免疫功能、抗細胞凋亡、抗炎、抗氧化、保護心肌細胞、抑制細胞異常增殖等多重作用的中藥活性成分[5-6]。有研究顯示，黃芪甲苷可抑制心肌纖維化的進程[7]，從而起到預防和治療心肌肥厚、心力衰竭等心臟疾病的作用，但其抑制纖維化的內(nèi)在機制仍不清楚。

脂多糖是致炎因子，常見于誘導炎癥病理模型。本實驗通過脂多糖對成纖維細胞進行體外誘導，想進一步證明脂多糖是否能夠引起心臟成纖維細胞的異常增生，同時探討該異常增生是否由TRPM7的通道上調(diào)所引起，以及黃芪甲苷對該過程的抑制作用。

1 材料與試劑

1.1 藥品

脂多糖(美國Sigma公司)；黃芪甲苷(南京澤瑯公司)；2-APB(美國Sigma 公司)；Carvacrol(美國Sigma 公司)；TRPM7蛋白一抗(美國ABCAM公司)；兔抗GAPDH一抗(Bioworld公司)；HRP標記羊抗兔二抗(美國Santa Cruz公司)；熒光定量PCR擴增試劑盒(Thermo Scientific公司)，其余試劑為市售分析純。

1.2 溶液配置

細胞外液：葡萄糖10mmoL·L-1;NaCl 140mmoL·L-1；CsCl 5mmoL·L-1；HEPES 10mmoL·L-1；CaCl21.8mmoL·L-1；MgCl21 mmoL·L-1，調(diào)節(jié)pH到7.3～7.4。

電極內(nèi)液:Cs-SO3CH3115mmoL·L-1；NaCl 8mmoL·L-1；HEPES 10mmoL·L-1；EGTA-Cs 10mmoL·L-1；用CsOH調(diào)節(jié)pH至7.2左右。

1.3 儀器

二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientifica公司)； EPC-10型膜片鉗放大器(德國Heka公司)；實時熒光定量PCR儀(德國eppendorf公司)；分子酶標儀(美國Thermo Fisher公司)；DYCP-40C電泳槽( 北京市六一儀器廠)。

1.4 實驗動物

出生時間為1～3天的SD大鼠乳鼠10只，雌雄不限，由上海杰思捷實驗動物有限公司提供，動物合格證號：SCXK(滬)2013-0006。

2 方法

2.1 乳鼠成纖維細胞的分離與培養(yǎng)

乳鼠處死后浸入75%乙醇溶液中消毒，取心臟，放入預冷的 D-Hanks 液沖洗掉多余的血，換至0.08%的胰酶中，剪成0.5～1.0mm3大小的碎塊，加新的胰酶在37℃中反復消化，收集每次的消化液，離心重懸后過200目不銹鋼網(wǎng)篩，將該細胞懸液加入培養(yǎng)瓶，放入培養(yǎng)箱差速貼壁培養(yǎng)90 min，貼壁的細胞即為成纖維細胞，待細胞長滿傳代時，再次利用差速貼壁法，得到純度為95%以上的成纖維細胞，用第二代成纖維細胞進行實驗。

2.2 細胞分組及給藥

將第二代的成纖維細胞分為7組：正常組、LPS 0.1μg·mL-1組、LPS 1μg·mL-1組、LPS 1μg·mL-1+carvacrol 500μmoL·L-1組、LPS 1μg·mL-1+2-APB 100μmoL·L-1組、LPS 1μg·mL-1+黃芪甲苷(ASG Ⅳ)1μmoL·L-1組、LPS 1μg·mL-1+黃芪甲苷(ASG Ⅳ)10μmoL·L-1組，后4組在加入 1μg·mL-1LPS的同時，分別給予500μmoL·L-1carvacrol、100μmoL·L-12-APB、1μmoL·L-1ASG Ⅳ、10μmoL·L-1ASG Ⅳ，孵育72h后進行各項實驗。

2.3 膜片鉗實驗

玻璃電極兩步拉制法拉制，拋光后灌充以電極內(nèi)液，用入水后電阻值為2～5MΩ的電極進行實驗。封接和破膜后，補償慢電容和串聯(lián)電阻，消除電容瞬跡，進行全細胞模式的紀錄。Pulse軟件進行數(shù)據(jù)的采集。所有實驗均在室溫(23～25℃)下進行。

2.4 Western Blot實驗

用蛋白裂解液分別提取每組細胞的總蛋白，測定濃度并分裝，取總蛋白40g與5×SDS上樣緩沖液混合，經(jīng)8% SDS-PAGE分離膠電泳，隨后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5% 脫脂奶粉的封閉液室溫封閉2h，用TRPM7一抗(1∶500)4℃孵育過夜，用HRP標記的羊抗兔二抗(1∶1 500)室溫孵2h，ECL法顯影，GAPDH作為內(nèi)參。Image J 軟件進行分析，以目的蛋白與GAPDH蛋白灰度值的比值計算目的蛋白的表達水平，重復3次。

2.5 實時熒光定量PCR基因檢測

各組細胞用PBS洗兩遍后，加入Trizol試劑，按照試劑盒說明書提取RNA，通過在260nm處的吸光度值來確定RNA純度，2μg總RNA按照第一鏈cDNA合成試劑盒(first Strand cDNA Synthesis Kit，AMV)說明書用于逆轉(zhuǎn)錄，取1μL的cDNA產(chǎn)物用于每個PCR反應，用擴增試劑盒(Maxima SYBR Green Qpcr MM，ROX)，按照說明書進行實時熒光定量PCR檢測。選GAPDH基因作內(nèi)參基因。通過2^-ΔΔCt方法處理，基因序列由上海生工有限公司設計合成。

表1 用于實時熒光定量PCR的引物寡核苷酸序列

2.6 MTT測細胞增殖實驗

用含10%胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔越10 000個細胞接種到96孔板，每孔體積200μL。根據(jù)實驗分組，換不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)72h。每孔加MTT溶液(5mg·mL-1用PBS配制，pH=7.4)20μL，繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，吸棄上清，每孔加150μL DMSO，搖床振蕩10min，使結(jié)晶物充分融解。選擇570nm波長，在酶標儀上測定吸光度值，記錄結(jié)果。

2.7 數(shù)據(jù)處理

全細胞膜片鉗所有數(shù)據(jù)均使用Pulse軟件進行紀錄，采用Graphypad prism 5.0和sigmaplot10.0來分析數(shù)據(jù)和曲線擬合。實驗所得數(shù)據(jù)用mean±SD表示，組間均數(shù)比較采用雙側(cè)t檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 脂多糖促細胞增殖及藥物干預作用

低劑量(0.1μg·mL-1、1μg·mL-1)的LPS能增強成纖維細胞的增殖能力 (P<0.01)，給予TRPM7通道阻斷劑的兩組細胞增殖能力有明顯下調(diào)(P<0.05)，結(jié)果顯示黃芪甲苷也有不錯的抑制異常增殖的能力(P<0.01)，且高濃度(10μmoL·L-1)的黃芪甲苷具有更好的抑制作用(見表1)。

表1 各組成纖維細胞增殖能力比較 (n=3)

注：與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與LPS 1μg·mL-1組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 成纖維細胞的TRPM7基因和蛋白表達量的變化

RT-PCR結(jié)果和western blot的結(jié)果均顯示，與正常組相比，脂多糖(LPS)兩個組(0.1μg· mL-1、1.0μg· mL-1)的TRPM7 mRNA量有顯著升高，且高濃度組(1μg· mL-1)上調(diào)更明顯(P<0.01)。而LPS+carvacrol組和 LPS+2-APB組的TRPM7基因和蛋白表達量低于模型組(P<0.01)，略高于正常組。黃芪甲苷的兩組(1μmoL·L-1、10μmoL·L-1)對TRPM7的表達均有抑制作用(P<0.01)，且具有一定程度的濃度依賴性(見圖1)。

3.3 成纖維細胞的TRPM7通道電流變化

在0mV的鉗制電壓下給予從-100mV至+120mV的階躍為20mV的一系列去極化刺激，經(jīng)分析處理得到電流密度圖(n=7)，與正常組相比，LPS組的TRPM7電流密度曲線隨電壓絕對值的增大有顯著升高(圖2-A)。而與模型組相比，LPS+carvacrol組和LPS+2-APB組的電流密度曲線隨著電壓絕對值的增加有明顯減小(圖2-B)。黃芪甲苷組對電流也有明顯抑制作用，且高濃度組更顯著(圖2-C)。

4 討論

纖維化的主要表征是細胞外膠原的過度沉積和細胞外基質(zhì)(ECM)的增多，而成纖維細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞后，其分泌膠原和細胞外基質(zhì)的能力增強，該過程是纖維化病理過程中的重要一環(huán)。在心臟纖維化過程中有多重因素的參與，如炎癥、氧化應激、高壓等，脂多糖是常用的炎癥誘導因子，能引起炎癥反應和氧化應激反應，許多實驗結(jié)果顯示，脂多糖能在肺部、肝部、腎部引起成纖維細胞的異常增殖，但不同組織的成纖維細胞反應及機制不同[8-10]。

圖1 不同組TRPM7的mRNA和蛋白表達量的變化(n=3)

注：與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與LPS 1μg·mL-1組比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖2 不同組TRPM7電流變化的電流密度曲線(n=7)

注：與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與LPS 1μg·mL-1組比較，*P<0.05，**P<0.01。

本文通過脂多糖炎癥模型，研究炎癥對成纖維細胞增殖的影響，且通過TRPM7通道的相關(guān)研究，進一步說明TRPM7通道參與調(diào)控成纖維細胞的增殖作用。TRPM7是一個分布廣泛且對多種陽離子具有通透性的非電壓依賴性離子通道。該通道的活性受多種因素調(diào)節(jié)。目前研究發(fā)現(xiàn)，TRPM7參與多種生理活動和疾病的發(fā)生發(fā)展，如胚胎細胞的發(fā)育與增殖、腫瘤的增殖與遷移、神經(jīng)細胞的凋亡與損傷、平滑肌細胞和成纖維細胞的增殖等。因此，心臟纖維化的發(fā)生發(fā)展也可能與TRPM7通道的表達功能的調(diào)控相關(guān)。

本實驗結(jié)果顯示，心臟的成纖維細胞在低濃度脂多糖(0.1 μg·mL-1、1μg·mL-1)的誘導下有明顯的異常增殖現(xiàn)象，給予TRPM7通道阻斷劑2-APB和carvacrol，均能使該增殖受到明顯抑制，同時我們發(fā)現(xiàn)脂多糖模型組的TRPM7基因和蛋白表達量、電流大小均有不同程度顯著升高，且高濃度的上調(diào)變化更明顯(1μg·mL-1)，這種同向變化的現(xiàn)象說明，脂多糖引起的成纖維細胞異常增殖可能與TRPM7的表達上調(diào)相關(guān)。

黃芪甲苷是常見的抗炎中藥提取物，本實驗采用高低兩個劑量，發(fā)現(xiàn)與脂多糖組(1μg·mL-1)相比黃芪甲苷確能在一定程度上抑制成纖維細胞的異常增殖，且具有濃度依賴性；同時，根據(jù)PCR和蛋白電泳結(jié)果，黃芪甲苷對TRPM7基因和蛋白的表達量均有不同程度的下調(diào)作用，膜片鉗實驗結(jié)果也顯示黃芪甲苷能抑制TRPM7電流的增大，此外，黃芪甲苷對脂多糖誘導的成纖維細胞的異常增殖也有顯著的抑制作用。綜上實驗結(jié)果可以說明，黃芪甲苷對脂多糖引起的成纖維細胞增殖具有抑制作用，該作用可能與下調(diào)TRPM7有關(guān)。

黃芪甲苷[11]是常見中藥活性成分，近年來研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷具有多種藥理活性，其中抗炎、抗氧化應激、抗病毒等作用明顯，有相關(guān)研究顯示，黃芪甲苷能抑制成纖維細胞的異常增殖，在其他組織和器官的抑制纖維化作用也十分明顯[12-13]，但其抑制心肌成纖維細胞增殖的作用報道較少見。本實驗結(jié)果初步證明了黃芪甲苷能抑制心肌成纖維細胞的異常增殖，且該增殖是由TRPM7通道調(diào)控的。其中的機制可能與黃芪甲苷抑制自由基生成和抑制炎性因子作用相關(guān)，通過調(diào)節(jié)TRPM7通道的上游調(diào)控因子，影響TRPM7通道的表達及功能，進而參與成纖維細胞的分化、增殖的調(diào)控，但具體藥理機制需要后續(xù)的實驗來深入探討。

由于心臟纖維化發(fā)病機制的復雜性，導致很多藥物的治療效果欠佳。而中藥提取物具有多環(huán)節(jié)、多靶點發(fā)揮作用的特點，在治療心血管疾病方面具有更大優(yōu)勢。本實驗選擇黃芪甲苷作為治療藥物，是由于其在抑制纖維化的同時具有保護心肌細胞[14]、抑制心肌凋亡、抗心肌肥厚[15]的作用，在臨床上具有更全面的治療心臟纖維化發(fā)展的作用。黃芪甲苷抑制由TRPM7介導的成纖維細胞增殖的作用會為將來黃芪甲苷的抗纖維化藥理作用機制及臨床治療心臟纖維化提供新的思路和理論依據(jù)。但由于本實驗為體外實驗，未來還需要體內(nèi)實驗對TRPM7參與纖維化的作用做進一步研究。

近年來關(guān)于TRPM7通道的研究越來越多，其調(diào)節(jié)細胞周期、鎂平衡等重要生理功能也逐漸被認識，相信未來關(guān)于TRPM7通道的研究勢必會成為熱點，為多種疾病的臨床治療提供更多的幫助和啟示。

[1] CLAPHAM D E,RUNNELS L W.The TRP ion channel family[J].Nat Rev Neurosci ,2001(2):387-396.

[2] CESAR ECHEVERRIA,IGNACIO MONTORFANOL.Tamara Hermosilla.Endotoxin Induces fibrosis in vascular endothelial cells through a mechanism dependent on transient receptor rprotein melastatin 7 activity[J].Plos one,2014,9 (4):94146.

[3] ECHEVERRIA C,MONTORFANO I,SARMIENTO D,et al.Lipopolysaccharide induces a fibrotic-like phenotype in endothelial cells[J].Cell Mol Med ,2013,17(6):800-814.

[4] 楊勇，肖尚志，葛亞坤，等.黃芪甲苷Ⅳ對大鼠主動脈平滑肌細胞增殖的抑制作用[J].航天醫(yī)學與醫(yī)學工程，2011,24(2)：79-84.

[5] DANIELA SARMIENTOA,IGNACIO.Montorfanoa,Monica Caceres,Endotoxin-induced vascular endothelial cell migration is dependent on TLR4/NF-β pathway NADPH oxidase activaton and transient receptor potential melastatin 7 calcium channel activity[J].Int J Biochem Cell Biol,2014(55):11-23.

[6] MINGZHE YU,CHENG HUANG.Inhibition of TRPM7 channels prevents proliferation and differentiation of human lung fibroblasts[J].Inflamm.Res，2013(62):961-970.

[7] 張海嘯,史載祥.中西醫(yī)結(jié)合防治心肌纖維化的研究進展[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006,9(26):860-863.

[8] ZHENGYU HE,YUAN GAO,YUXIAO DENG.Lipopolysaccharide induces lung fibroblast proliferation through Toll-like receptor 4 signaling and the phosphoinositide3-kinase-Akt pathway[J].Plos one，2012,7(4):35926.

[9] XIAO-JUN C,MIN F,LIANG C,et al.Expression and role of adiponectin receptor 1 in lipopolysaccharide-induced proliferation of cultured rat adventitial fibroblasts[J].Cell Biol,2010,34(2):163-169.

[10] GUTIERREZVENEGAS G,KAWASAKICARDENAS P,ARROYOCRUZ SR.Luteolin inhibits lipopolysaccharide actions on human gingival fibroblasts[J].Eur J Pharmacol，2006,541(12):95-105.

[11] 段立軍,孫博航.黃芪甲苷的研究進展[J].沈陽藥科大學學報，2011,128(15):411-414.

[12] 陳晶,張博華.黃芪大黃的抗腎纖維化作用研究進展[J].中醫(yī)藥學報,2011,39(6):101-104.

[13] 王永生,徐小雅,楊波.黃芪甲苷對博萊霉素誘導的大鼠肺纖維化的治療作用研究[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學,2012,39(12):3090-3092.

[14] 汪明輝,李雙杰.黃芪甲苷抗氧化機制對病毒性心肌炎保護作用的研究[J].臨床兒科雜志,2007,25(10):825-827.

[15] 許曉樂,季暉,谷舒怡,等.黃芪甲苷對異丙腎上腺素所致小鼠心肌肥厚的保護作用[J].中國藥科大學學報,2007,28(5):451-455.

(責任編輯：余 婷)

Effects of TRPM7 on Cardiac Fibrosis and Drug Intervention

Zhou Yang,Lei Quan,Guo Qiao,Liu Yonghui,Wang Xinwei,Tang Yiqun*

(Department of Clinical Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China)

Objective:To investigate the effects of Lipopolysaccharide(LPS) and the inhibitory effects of astragaloside Ⅳ(ASG Ⅳ) on the proliferation of cardiac fibroblasts through TRPM7 channel.Methods:Cardiac fibroblasts obtained from neonatal SD rats were cultured in vitro divided into 7 groups,control group,model groups(LPS 0.1μg·mL-1,1μg·mL-1),TRPM7 channel blocker groups(carvacrol 500 μmoL·L-1,2-APB 100 μmoL·L-1),ASG Ⅳ treatment groups(1μmoL·L-1,10μmoL·L-1).The treatment groups were administered with 1 μg·mL-1LPS and treated respectively with 500μmoL·L-1carvacrol,100μmoL·L-12-APB,1μmoL·L-1ASG Ⅳ,10μmoL·L-1ASG Ⅳ.Each group was incubated for 72 hours.The changes of gene and protein expression,channel current,cell proliferation before and after administration were measured respectively by RT-PCR,western blot,whole cell patch clamp and MTT.Results:RT-PCR and western blot results showed that LPS had significantly upregulated the gene and protein expression of TRPM7(P<0.01) and carvacrol,2-APB,ASG Ⅳ inhibited the increase on different levels.Patch clamp data revealed that there was a decrease of TRPM7 current in LPS +carvacrol group,LPS+2-APB group and LPS+ASG Ⅳgroup compared with model group.Furthermore,ASG Ⅳ markly prevented the proliferation of cardiac fibroblasts induced by LPS(P<0.01).Conclusion:We demonstrate that TRPM7 channels contributed to LPS induced cardiac fibroblasts proliferation and suggest that this contribution may be suppressed by ASG Ⅳ through inbibition of TRPM7 channel.

LPS ；Cardiac Fibroblasts；TRPM7；ASG Ⅳ

2015-08-05

國家重大新藥創(chuàng)制科技重大專項課題(2011ZX09401-021)

周陽(1990-)，女，中國藥科大學碩士研究生，研究方向為心血管藥理。

湯依群(1967-),女，中國藥科大學副教授，研究方向為心血管藥理。

R285

A

1673-2197(2015)23-0001-04

10.11954/ytctyy.201523001