箭竹多糖理化分析及對(duì)腫瘤抑制作用研究

黃 偉，張志發(fā)，杜俊峰*，孫超超，魏 衡，唐 超

(1.武漢大學(xué) 藥學(xué)院，湖北 武漢 430071；2.華中科技大學(xué) 同濟(jì)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430030； 3.杭州市中醫(yī)院，浙江 杭州 310007；4.湖北新華醫(yī)院，湖北 武漢 430015； 5.湖北省茶葉精深加工工程技術(shù)研究中心，湖北 宜昌 443100)

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箭竹多糖理化分析及對(duì)腫瘤抑制作用研究

黃 偉1，張志發(fā)2，杜俊峰2*，孫超超3，魏 衡4，唐 超5

(1.武漢大學(xué) 藥學(xué)院，湖北 武漢 430071；2.華中科技大學(xué) 同濟(jì)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430030； 3.杭州市中醫(yī)院，浙江 杭州 310007；4.湖北新華醫(yī)院，湖北 武漢 430015； 5.湖北省茶葉精深加工工程技術(shù)研究中心，湖北 宜昌 443100)

從箭竹中純化制備多糖，獲得純化的箭竹多糖組分FP(fargesia polysaccharides )。FP的總多糖含量為90.77%,蛋白質(zhì)含量為5.81%，分子量180904。IR分析表明FP為典型的碳水化合物；化學(xué)成分分析表明，F(xiàn)P為一種結(jié)合蛋白肽的多糖復(fù)合物。FP對(duì)人白血病細(xì)胞K562和人肝癌細(xì)胞HepG2均具有顯著抑制作用，呈現(xiàn)劑量效應(yīng)，且FP對(duì)HepG2的抑制效果總體上強(qiáng)于K562。FP的高、中、低劑量組對(duì)小鼠S180 肉瘤均具有顯著抑制作用(P<0.01或P<0.05) , 且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)。

箭竹；多糖；腫瘤；抑制作用

竹葉在我國具有悠久的藥、食兩用歷史，我國的竹林資源約占全國森林總面積的3%，占世界竹林總面積的25%[1]。箭竹(fargesia)是我國竹葉的主要品種之一，為多年生地下莖匍匐竹類，主要分布于四川、云南及湖北等地[2]。箭竹林地面積大、資源豐富，但因其稈小，作為傳統(tǒng)竹材加工使用受到限制。箭竹有效成分的提取及利用可為箭竹資源的深入開發(fā)提供新途徑。

竹葉中除含有黃酮類功效成分外，多糖亦是其重要的天然活性物質(zhì)，目前關(guān)于箭竹多糖的研究較少。本工作開展了箭竹多糖的理化特性及抗腫瘤活性研究，為其大規(guī)模生產(chǎn)制備及深加工終端產(chǎn)品的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及主要儀器

箭竹，產(chǎn)自四川涼山。SPF級(jí)昆明種小鼠，雄性，體重18～22g，購自南京生物醫(yī)藥研究院。SHIMADZU UV-2550紫外-可見分光光度計(jì)，Nicolet-170X 紅外光譜儀，Agilent 1200系列高效液相色譜儀(HPLC)，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ALLTECH ELSD 3300)，美國ALLTECH公司；TSK-GEL G3000PWXL，TOSOH公司；Thermo Trace2000氣相色譜儀、毛細(xì)管柱Rtx-5MS (30m×0.32mm i.d.)，美國Thermo Finnigan公司；Thermo Scientific Series 8000細(xì)胞培養(yǎng)箱。 Dextran Standard T系列標(biāo)準(zhǔn)品，Pharmacia公司；bradford法蛋白測(cè)定試劑盒，碧云天公司。其它試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 箭竹多糖純化制備及化學(xué)成分分析

取箭竹葉500g加水4 000mL，機(jī)械攪碎，沸水煎煮,過濾，Saveg法去蛋白質(zhì),活性炭脫色，乙醇沉淀,冷凍干燥, 得6.88g黃色粉末，為箭竹粗多糖CFP(Crude fargesia polysaccharides )。將箭竹粗多糖CFP 溶于水,經(jīng)DEAE-纖維素DE32離子交換柱層析純化，獲得箭竹多糖純化組分，經(jīng)水透析、凍干后得淺黃色絮狀粉末為箭竹多糖FP (fargesia polysaccharides)。

采用蒽酮-硫酸法測(cè)定箭竹多糖FP糖含量[3]；Bradford法測(cè)定FP的蛋白質(zhì)含量[4]；糖腈乙酸酯衍生法測(cè)定FP單糖組成[5]。

1.3 分子量測(cè)定

箭竹多糖的分子量測(cè)定采用高效液相凝膠滲透色譜法(HPGPC)-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)分析，以Dextran Standard T系列葡聚糖T-10，T-40，T-70，T-500和T-2000(分子量分別為:10 000，40 000，70 000，500 000和2 000 000)作為標(biāo)準(zhǔn)品，以標(biāo)準(zhǔn)品重均相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)lgMr與其HPGPC-ELSD色譜的保留時(shí)間tR做標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性回歸方程。

1.4 紅外光譜測(cè)定

取3.0mgFP經(jīng)適量溴化鉀壓片,采用 Nicolet-170X 紅外光譜儀于4 000cm-1～400cm-1區(qū)間掃描。

1.5 FP對(duì)腫瘤細(xì)胞體外抑制作用

K562細(xì)胞和HepG2細(xì)胞分別培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)基含青霉素100IU/mL，鏈霉素100U/mL，10%新生胎牛血清(56℃、30min滅活)，置飽和濕度、37℃和5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的上述腫瘤細(xì)胞分別用胰蛋白酶消化，再接種于96孔板, 實(shí)驗(yàn)組各孔加入終濃度為400、200、100、50μg/mL的FP。陰性對(duì)照每孔加入同體積的RPMI1640培養(yǎng)基,各組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔, 于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后,加入MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4h后測(cè)定A570nm,細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率IR(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組A570nm/對(duì)照組A570nm)×100%。

1.6 對(duì)S180荷瘤小鼠的抑瘤作用

選取體重18～22g昆明種小鼠,雄性，于右腋皮下接種S180細(xì)胞懸液(5.0×107個(gè)/mL)0.18mL/20g, 接種24h后隨機(jī)分組, 每組10只。荷瘤對(duì)照組：給予等量生理鹽水；FP劑量組：分為高、中、低劑量組，各組分別灌胃60、120和240mg/kg·d劑量FP多糖試樣；陽性對(duì)照組：腹腔注射給予5-氟尿嘧啶(5-FU )120mg/kg·d。各組連續(xù)給藥10天，給藥結(jié)束后，次日以頸椎脫臼法處死小鼠,解剖剝?nèi)×鰤K稱重；解剖剝?nèi)⌒叵?、脾臟稱重。分別按下列公式計(jì)算腫瘤抑制率和胸腺、脾臟的臟器指數(shù)。抑瘤率(%)=[(荷瘤對(duì)照組平均瘤重-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重)]/荷瘤對(duì)照組平均瘤重×100%；臟器指數(shù)(mg/g)=臟器重量(mg)/體重(g)，計(jì)算胸腺、脾臟指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 箭竹多糖純化組分FP化學(xué)成分及分子量

蒽酮硫酸法測(cè)得純化組分的FP總多糖含量為90.77%,蛋白質(zhì)含量為5.81%。箭竹多糖為一種結(jié)合蛋白肽的多糖復(fù)合物。GC分析表明箭竹多糖FP的多糖部分由6種單糖組成(見表1)，分別為葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、木糖組成。各單糖組成的摩爾比表明FP以葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖為主，占總糖組成的80%以上。HPGPC-ELSD測(cè)得FP的相對(duì)分子量為180904。

表1 箭竹多糖FP單糖組成及摩爾比

2.2 紅外光譜分析

紅外光譜分析結(jié)果見圖1。FP在3 417、2 924、2 854、1 649、1 419、1 384、1 077、547和471cm-1等具有特征吸收峰。其中3 417cm-1為O-H的伸縮振動(dòng)；2 924cm-1和1 419cm-1分別為C-H伸縮振動(dòng)和彎曲振動(dòng)特征吸收；1 649cm-1左右的大峰是H2O的峰，表明FP易吸水；1 077cm-1處特征吸收由C-O-C伸縮振動(dòng)引起。547cm-1和471cm-1兩個(gè)吸收峰是含有多羥基化合物的締合羥基彎曲振動(dòng)吸收峰。官能團(tuán)的紅外光譜特征吸收分析結(jié)果表明，F(xiàn)P為典型的碳水化合物。

2.3 FP對(duì)K562和HepG2細(xì)胞抑制作用

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，箭竹多糖純化組分FP對(duì)人白血病細(xì)胞K562和人肝癌細(xì)胞HepG2均具有顯著抑制作用，且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)。當(dāng)濃度達(dá)到200μg/mL以上時(shí)，F(xiàn)P對(duì)K562和HepG2的抑制率可達(dá)30%以上；隨著濃度增加1倍，F(xiàn)P對(duì)K562和HepG2的抑制率接近或達(dá)到50%。FP在培養(yǎng)基中的濃度提高到500μg/mL，其對(duì)此兩種細(xì)胞的抑制作用達(dá)到60%左右。FP對(duì)HepG2的抑制效果總體上強(qiáng)于K562。

2.4 FP對(duì)小鼠肉瘤S180抑制作用

與荷瘤組比較，F(xiàn)P高、中、低劑量組對(duì)小鼠S180 肉瘤均具有顯著抑制作用(P<0.01或P<0.05) ,且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)，隨著劑量的加大，F(xiàn)P對(duì)對(duì)荷瘤小鼠S180腫瘤的抑制率由23.55%提高到66%以上。高劑量組的抑瘤率與5-Fu藥物組相當(dāng)，見表3。

圖1 箭竹多糖FP的紅外光譜

組別劑量(μg/mL)抑制率(x±s，%)K562HepG2000FP?50507．32±0．258．45±0．36FP?10010011．31±0．6216．44±0．52FP?20020032．69±0．8830．76±0．48FP?40040047．27±1．2150．83±1．11FP?55050058．91±1．0964．24±2．17

表3 FP對(duì)S180小鼠肉瘤抑制作用

注:與荷瘤對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

2.5 FP對(duì)S180小鼠免疫器官的影響

由表4可知，F(xiàn)P高劑量組的脾指數(shù)是荷瘤對(duì)照組的2.8倍，胸腺指數(shù)是荷瘤對(duì)照組的1.8倍，中、高劑量組與荷瘤對(duì)照組比較均差異顯著(P<0.01)。表明FP對(duì)S180荷瘤小鼠的脾臟和胸腺均具有促生長(zhǎng)作用，且呈劑量效應(yīng)推測(cè)FP對(duì)小鼠免疫增強(qiáng)作用與其抑瘤作用具有相關(guān)性。

3 結(jié)論

本研究表明，箭竹多糖為一種結(jié)合蛋白的雜聚多糖復(fù)合物，所獲得的箭竹多糖組分的分子量為180 904。細(xì)胞和動(dòng)物水平研究均表明，箭竹多糖具有顯著的抑制腫瘤作用，且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)，這與其免疫增強(qiáng)功能相關(guān)。箭竹多糖的功能活性是其開發(fā)利用的基礎(chǔ)，對(duì)其理化特性的系統(tǒng)研究可為批量生產(chǎn)制備提供指導(dǎo)。

表4 FP對(duì)S180荷瘤小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響 (±s)

注:與荷瘤對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

[1] 王文淵.竹葉黃酮的功能研究進(jìn)展[J].中國食物與營(yíng)養(yǎng),2012,18(6):71-74.

[2] 胡毅，向衛(wèi)國，朱克云，等.汪萬江箭竹生長(zhǎng)及開花的氣象條件研究[J].成都?xì)庀髮W(xué)院學(xué)報(bào)，1997,12(3)：225-233。

[3] 張惟杰. 糖復(fù)合物生化研究技術(shù)[M]. 第2版.杭州: 浙江大學(xué)出版社, 1999.

[4] BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein binding[J].Anal Biochem，1976(72)：248-254.

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(責(zé)任編輯：魏 曉)

2014-11-13

黃偉(1981-)，男，武漢大學(xué)碩士研究生，主管藥師，研究方向藥物成分分析及藥理學(xué)。

杜俊峰(1975-)，男，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院醫(yī)師，研究方向?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)與健康。

R285

A

1673-2197(2015)07-0039-03

10.11954/ytctyy.201507018