參七黃抗結(jié)腸癌細胞株SW620作用篩選研究

劉 敬，王 瓊，謝彩玲，謝文瓊，趙 斌*

(1.中山火炬職業(yè)技術(shù)學院 生物醫(yī)藥系，廣東 中山 528436；2.國家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心中山健康產(chǎn)品分中心，廣東 中山 528436)

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參七黃抗結(jié)腸癌細胞株SW620作用篩選研究

劉 敬1,2，王 瓊1，謝彩玲1，謝文瓊1，趙 斌1*

(1.中山火炬職業(yè)技術(shù)學院 生物醫(yī)藥系，廣東 中山 528436；2.國家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心中山健康產(chǎn)品分中心，廣東 中山 528436)

目的：對參七黃中的苦參堿等9種組分進行抗結(jié)腸癌活性的體外初步篩選。方法：應(yīng)用MTT法測定各組分對SW620細胞株增殖活性的影響，檢測其抑制SW620的劑量效應(yīng)關(guān)系；應(yīng)用光學顯微鏡、熒光顯微鏡進行細胞形態(tài)學觀察。結(jié)果：蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、人參皂苷Rh2、槐定堿、苦參堿各濃度均顯示出抑制SW620結(jié)腸癌細胞增殖的作用，且量效關(guān)系明顯。結(jié)論：此6個單體成分可組成新配伍進行抗癌活性研究，為研發(fā)中藥治療結(jié)腸癌的靶向新藥提供實驗依據(jù)。

參七黃；結(jié)腸癌；SW620；組分篩選

近年來，隨著人們生活水平的提高和生活習慣的改變，結(jié)腸癌在我國發(fā)病率呈不斷上升趨勢，在消化道腫瘤中位居第二。中醫(yī)藥對結(jié)腸癌病因病機具有獨特的認識，并對結(jié)腸癌的治療取得了一定成果，發(fā)揮著越來越大的作用。參七黃是由苦參、三七、大黃等組成的中藥復(fù)方制劑，其針對結(jié)腸癌患者結(jié)腸局部的關(guān)鍵病機“毒”與“瘀”，以清熱燥濕、瀉火解毒、活血化瘀為治法，從根本上去除導致結(jié)腸癌之病理因素，改善結(jié)腸癌變組織的病理生理環(huán)境，發(fā)揮抗癌、預(yù)防復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、控制并發(fā)癥的獨特療效。本研究在現(xiàn)有文獻研究報道[1-4]基礎(chǔ)上，對參七黃中主要活性單體進行抗結(jié)腸癌活性的體外篩選研究，為其組分配伍的抗腫瘤活性研究提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑

苦參堿(XC071201)、氧化苦參堿(XC071212)購自西安小草生物技術(shù)有限公司；槐定堿(MUST-11060901)、大黃素(MUST-11042601)、大黃酸(MUST-11032801)、蘆薈大黃素(MUST-10112301)、三七皂苷R1(MUST-10092301)、人參皂苷Rh2(MUST-09071501)、人參皂苷Rg1(MUST-11041201)購自成都曼思特生物科技有限公司，均用培養(yǎng)基溶解成不同濃度備用。DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclon公司)、胰蛋白酶(購自GIBCO公司)，MTT、谷氨酸(均購自Sigma公司)，胎牛血清(PAA)，HEPES(Amresco 分裝)，其余均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

倒置相差顯微鏡(Olympus IX70，Japan)，CO2孵箱(Thermo 3111)，超凈工作臺(SW-CJ-2FD，蘇州凈化公司，中國)，超純水儀(Millipore)，酶標儀(Multiskan MK3)，LDZ5-2 型低速自動平衡離心機(北京醫(yī)用離心機廠)。

1.3 細胞株

結(jié)腸腺癌細胞株SW620(購自中國科學院細胞庫)。

2 方法

2.1 細胞接種培養(yǎng)

從液氮罐中取出細胞株，迅速置于37℃的水浴缸中解凍，用吸管吸凈管中細胞懸浮液，轉(zhuǎn)移至10mL離心管中。1 000r·min-1離心5min，棄上清液，加入約4mL生理鹽水，吹打混勻，1 000r·min-1離心5min，棄上清液，再加入2mL含胎牛血清10% RPMI 1640培養(yǎng)液或DMEM培養(yǎng)液，吹打混勻后置入細胞培養(yǎng)瓶中，放入37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

2.2 MTT法測定各成分腫瘤抑制率[5]

取對數(shù)生長期細胞，消化后用吸管吹打使之分散均勻制成單細胞懸液，按每1mL含1×105個細胞，每孔100μL接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h后，分別加入相同體積的受試藥液，同時加入適量完全培養(yǎng)液(900mL·L-1DMEM培養(yǎng)基，100mL·L-1胎牛血清，青霉素1×105U·L-1，鏈霉素1×105U·L-1)補足，使每孔200μL終體積(每組6個復(fù)孔)，同時設(shè)空白對照組，繼續(xù)培養(yǎng)。待藥物作用20h后，加入MTT液繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸取上清液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150μL，充分振蕩，室溫靜置10min，用酶標儀于492nm波長處測定吸收值，并計算細胞生長抑制率(%)=(1-用藥組平均OD值/對照組平均OD值)×100%。期間每天于倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。

2.3 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 形態(tài)學觀察

顯微鏡下可見細胞培養(yǎng)約2h開始貼壁，貼壁后的細胞呈圓形。12～24h細胞開始伸出長短不等的細小突起，細胞多呈梭形(圖1A、1B)，48h后對照組梭形細胞明顯，細胞數(shù)明顯增加(圖1C)，給藥組細胞生長狀態(tài)變差，且細胞數(shù)目增加不明顯(圖1D)，MTT作用4h后，可見給藥組細胞形成結(jié)晶數(shù)較對照組明顯減少(圖1E、圖1F)。

3.2 各組分對細胞體外存活的影響

測定參七黃復(fù)方中蘆薈大黃素等9種單體組分對體外培養(yǎng)的細胞吸收值(其大小能反映活細胞數(shù)量)的影響，并按公式計算細胞生長抑制率，統(tǒng)計結(jié)果見表1至表7。

表1 苦參堿對SW620結(jié)腸癌細胞存活的影響

組別藥品濃度(mg·mL-1)吸收值抑制率(%)空白對照-0.905±0.09802.50.598±0.037**33.8苦參堿20.686±0.055**24.11.50.716±0.043**20.810.761±0.023**15.7

注：與空白對照組比較*P<0.05，**P<0.01。

圖1 細胞形態(tài)學觀察

組別藥品濃度(mg·mL-1)吸收值抑制率(%)空白對照--0.905±0.098050.702±0.032**22.4氧化苦參堿40.723±0.070**20.130.741±0.023**18.020.738±0.040**18.3

注：與空白對照組比較*P<0.05，**P<0.01。

表3 槐定堿對SW620結(jié)腸癌細胞存活的影響

組別藥品濃度(mg·mL-1)吸收值抑制率(%)空白對照--0.801±0.038020.293±0.035**63.4槐定堿10.544±0.048**31.90.50.706±0.041**11.60.250.797±0.0400.4

注：與空白對照組比較*P<0.05，**P<0.01。

表4 人參皂苷Rg1、Rh2對SW620結(jié)腸癌細胞存活的影響

組別藥品濃度(μg·mL-1)吸收值抑制率(%)空白對照--0.799±0.02801000.503±0.056**37.1人參皂苷Rh2500.562±0.036**29.7250.599±0.047**25.112.50.611±0.019**23.61000.611±0.033**23.7人參皂苷Rg1500.619±0.038**22.6250.593±0.019**25.812.50.595±0.030**25.6

注：與空白對照組比較*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

參七黃復(fù)方單體成分中蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、人參皂苷Rh2、槐定堿、苦參堿各濃度均顯示出抑制SW620結(jié)腸癌細胞增殖的作用，且隨濃度增加，抑制癌細胞增殖作用增強，量效關(guān)系明顯。

目前臨床能用于治療結(jié)腸癌的中藥制劑不多，《新編國家中成藥》所載5 017種制劑中僅有艾迪注射液、復(fù)方斑蝥膠囊、抗癌平丸、消癌平片及糖漿、柘木糖漿等幾種中成藥有治療結(jié)腸癌的效果，且存在以下共性問題：①藥物均為水、醇粗提物或藥材粉末，制劑水平低，質(zhì)量可控性、穩(wěn)定性差；②采用靜滴注或口服，藥物不能靶向作用于癌組織，全身或消化道不良反應(yīng)明顯；③廣泛用于治療肺癌、肝癌、淋巴癌等，缺乏針對性地治療結(jié)腸癌。本實驗結(jié)果提示參七黃復(fù)方中6個單體成分可以組成配伍新方，深入進行抗結(jié)腸癌活性及機理研究，為進一步開發(fā)針對結(jié)腸癌細胞靶向給藥的現(xiàn)代中藥新制劑提供科學依據(jù)。

小兒清肺八味散等為《衛(wèi)生部藥品標準》 蒙藥分冊[2]品種，系蒙藥中最具有代表性的常用藥品；為了保證以上8種蒙藥制劑的質(zhì)量，按照《中國藥典》2010年版一部微生物限度檢查法的相關(guān)規(guī)定[1]，對8種蒙藥制劑品種建立了微生物限度檢查方法并加以驗證。該法簡便易行、準確可靠，能夠科學有效地控制以上8種蒙藥制劑的質(zhì)量，并可為更好地評價蒙藥制劑的微生物限度檢查法提供科學的實驗依據(jù)。

[1] 楊賓,付強,王亞娟,等.蘆薈大黃素對人結(jié)腸癌細胞SW480增殖周期及凋亡的影響[J].山西中醫(yī),2008,24(6):48-50.

[2] 梁磊,張緒慧,王曉燕,等.槐定堿對人結(jié)腸腺癌細胞株SW620增殖和凋亡的影響[J].中國藥理學通報,2008,24(6):782-787.

[3] 鄒健,冉志華,許琦,等.氧化苦參堿對人結(jié)腸癌細胞株SW1116殺傷作用的實驗研究[J].中華消化雜志,2005,25(4):207-211.

[4] 梁磊,王曉燕,張緒慧,等.苦豆子生物堿抗結(jié)腸腺癌細胞株SW620的作用篩選[J].中藥材,2008,31(6):866-869.

[5] 魏偉,吳希美,李元建.藥理實驗方法學[M].第2版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2010:1568.

(責任編輯：尹晨茹)

Study on Constituents from Shenqihuang against Adenocarcinoma of Colon Cell Line SW620 in vitro

Liu Jing1,2, Wang Qiong1, Xie Cailing1, Xie Wenqiong1, Zhao Bin1*

(1.Department of Biomedicine, Zhongshan Torch Polytechnic, Zhongshan 528436, China; 2.Zhongshan Health Products Center, National Engineering Research Center for Modernization of Traditional Chinese Medicine, Zhongshan 528436, China)

Objective:To study constituents from shenqihuang against adenocarcinoma of colon cell line SW620.Methods:SW620 cell line was treated with Constituents from shenqihuang at various concentrations，The effect on cell Proliferative activity was measured by MTT assay and the effects of alkaloids against cell growth were compared. The changes of cell morphology were observed through optical microscope and fluorescence microscope.Results:Aloe emodin, emodin, rhein, ginsenoside Rh2, Sophoridine matrine were identified to produce growth inhibition against SW620 cells.Conclusion:The 6 constituents from shenqihuang can form a new compatibility. The results of this study provide experimental evidence for targeting new drug research and development of traditional Chinese medicine treatment for colon cancer.

Alkaloid; Sophora Alopecuraides L1; Colorectal Carcinoma; SW620

2015-03-03

中山市科技計劃項目(中科發(fā)[2010]122號)

劉敬，女，博士，中山火炬職業(yè)技術(shù)學院講師，研究方向為中藥藥效及作用機理。

R285.5

A

1673-2197(2015)12-0012-02

10.11954/ytctyy.201512005