桑白皮化學拆分工藝及互不交叉性研究

2015-04-25 08:34:15王小蘭張艷麗張明輝匡海學馮衛(wèi)生鄭曉珂

世界中醫(yī)藥 2015年12期

關鍵詞：桑白皮組分乙醇

王小蘭王紳趙威張艷麗張明輝匡海學馮衛(wèi)生鄭曉珂

(1 河南中醫(yī)學院，鄭州，450046；2 呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省創(chuàng)新中心，鄭州，450046；3 黑龍江中醫(yī)藥大學，哈爾濱，150040)

桑白皮化學拆分工藝及互不交叉性研究

王小蘭1,2王紳1,2趙威1,2張艷麗1,2張明輝1,2匡海學3馮衛(wèi)生1,2鄭曉珂1,2

(1 河南中醫(yī)學院，鄭州，450046；2 呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省創(chuàng)新中心，鄭州，450046；3 黑龍江中醫(yī)藥大學，哈爾濱，150040)

目的:建立桑白皮全成分的拆分工藝，并對各拆分組分進行互不交叉性研究與工藝穩(wěn)定性考察。方法：首先采用水煎、萃取、醇沉、大孔吸附樹脂等技術建立桑白皮化學組分的拆分方法；然后運用HPLC-PDA、HPLC-ELSD色譜法與ChemPattern化學計量學軟件相結合，采用主成分分析法與聚類分析法探討各拆分組分是否有交叉。結果：桑白皮的全成分拆分為5個組分，將不同檢測器的HPLC色譜數據結合化學計量學分析，結果顯示各拆分組分互不交叉，該工藝所得10批次各拆分組分，通過HPLC-PDA特征圖譜研究，進行相似度評價，工藝穩(wěn)定。結論：本研究建立了穩(wěn)定的桑白皮化學組分拆分工藝，該工藝穩(wěn)定、重現(xiàn)性良好，各個拆分組分基本無化學成分交叉。

桑白皮化學拆分工藝；HPLC-PDA；HPLC-ELS；互不交叉性分析；化學計量學分析

中藥性味理論是中藥藥性理論的核心，是幾千年來中醫(yī)臨床用藥的重要依據，近年來，隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究發(fā)展，有關中藥藥性研究也日益增多，本研究首席科學家匡海學教授提出來“一藥X味Y性(Y≤X)。中藥性味的物質基礎是可拆分性、可組合性”的中藥性味理論研究新假說，遵循這一理論，本研究以桑白皮為研究對象，采用中藥性味可拆分性的研究模式[1]，結合現(xiàn)代儀器分析技術，對桑白皮化學組分拆分工藝進行研究，并且應用ChemPattern軟件對各拆分組分進行化學計量學分析，探討各拆分組分互不交叉性與工藝的穩(wěn)定性，為進行桑白皮性味藥理評價奠定基礎。

1 材料

1.1 藥材所用桑白皮購自鄭州市中藥材市場，由河南中醫(yī)學院陳隨清教授鑒定為?？浦参锷orusalbaL.的干燥根皮。

1.2 設備與試劑 Waters2695高效液相色譜儀，2998PDA檢測器，Waters 2424ELSD檢測器；BIOMATE3S型紫外分光光度計(美國熱電)；Empower色譜數據工作站；ChemPattern化學計量學系統(tǒng)解決方案軟件(科邁恩科技有限公司)；BT-25S型十萬分之一電子天平(賽多利斯)；Arium 611 VF超級組合型超純水器(SARTORIUS)，Q-250A3粉碎機；流水式抽氣機(上海愛朗儀器有限公司)；SK2200H型超聲波清洗器(上?？茖С晝x器有限公司)；DZKW-4電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；SB-1000型旋轉蒸發(fā)器(上海愛朗儀器有限公司)；迪馬PLATISIL(TM)ODS C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；DiaionHP-20大孔吸附樹脂(日本三菱公司)，甲醇(美國天地公司，色譜醇)；乙腈(美國天地公司，色譜醇)；95%乙醇(北京化工廠，分析純)；水(超純水)。

2 方法與結果

2.1 桑白皮各化學組分拆分工藝的研究桑白皮水煎液提取方法考察：影響傳統(tǒng)中藥湯劑質量的主要因素包括加水量、煎煮次數及煎煮時間等。因此本研究采用L9(33)正交實驗考察上述3因素對桑白皮水煎煮提取率的影響，確定工藝為：10倍量水煎煮3次，每次1 h。

桑白皮全成分提取工藝建立：桑白皮1000 g，10倍量水煎煮3次，每次1 h，紗布過濾，合并濾液，濃縮干燥得桑白皮水煎液，提取率為17%。

桑白皮全成分拆分工藝建立：桑白皮水煎液減壓濃縮，加其2倍量的石油醚萃取，上清液濃縮回收溶劑后真空干燥6 h，得石油醚組分(該組分為脂肪油拆分組分)，提取率為3.10%，其余水提液上DiaionHP-20柱，依次用水、30%乙醇、50%乙醇、80%乙醇洗脫，得到桑白皮30%、50%、80%乙醇拆分組分，提取率分別為5.8%、0.31%、0.25%，其中，水洗脫部分經過醇沉得到多糖拆分組分，提取率分別為4.4%。

2.2 供試品溶液的制備精密稱取桑白皮25 g，10倍量的水提取3次，提取時間為1 h，提取液經減壓濃縮、離心、過濾，將所得濾液濃縮至干，加入流動相超聲溶解，定容于50 mL容量瓶中，經0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3 桑白皮水煎液色譜條件建立[2-5]色譜柱為迪馬PLATISIL(TM)ODS C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);以流動相甲醇(A)-0.1%磷酸水(B)梯度洗脫，洗脫程序見表1，流速：1.0 mL/min，檢測波長：280 nm。

2.4 方法學考察方法學考察中進行了精密度、穩(wěn)定性的研究，結果表明儀器精密度符合要求，標準品在24 h內穩(wěn)定，樣品處理操作重現(xiàn)性良好，保證了實驗結果的準確、可靠。

表1 桑白皮水煎液HPLC梯度洗脫條件

2.4.1 精密度試驗取同一批桑白皮藥材，按“2.2”項制備供試品溶液，按上述色譜條件各拆分組分分別連續(xù)進樣6次，以考察儀器重現(xiàn)性。色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，計算保留時間及峰面積的RSD值。其RSD值均小于3%，表明色譜系統(tǒng)精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗取同一批桑白皮藥材，按“2.2”項制備供試品溶液，分別在0 h、4 h、8 h、16 h、24 h測定HPLC色譜圖，以考察24 h內的穩(wěn)定性。色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，計算保留時間及峰面積的RSD值。RSD小于3%，表明樣品在24 h內性質穩(wěn)定。

2.5 桑白皮化學拆分組分互不交叉性研究根據2.1中拆分工藝得到的5個拆分組分，在建立了桑白皮水煎液HPLC色譜條件的基礎上，本實驗對各拆分組分的互不交叉性進行研究，在桑白皮的5個拆分組分中脂肪油組分、揮發(fā)油組分以及醇沉組分，因沸點與分子量差異較大，不存在與其他組分交叉，故本實驗采用HPLC-PDA色譜法主要對桑白皮的30%乙醇、50%乙醇以及80%乙醇洗脫組分進行了初步互不交叉研究，為下一步深入研究奠定基礎。

2.5.1 桑白皮水煎液HPLC-PDA色譜條件下的結果將“2.1”項下制備的各拆分組分樣品，按確定的桑白皮水煎液HPLC色譜條件進行測定，并將各圖譜進行疊加。根據出峰情況，可以看出，各拆分組分與水煎煮總提物相比基本上未出現(xiàn)成分缺失，基本實現(xiàn)了全成分拆分。從保留時間上可以觀察到：30%乙醇洗脫組分集中在0—45 min，50%乙醇洗脫組分集中在35—65 min，80%乙醇洗脫組分集中在60 min以后。各拆分組分且峰值較高的成分從保留時間來看，基本上無重疊，提示個拆分組分成分基本無交叉，結果見圖1。

2.5.2 采用不同流動相及檢測器進一步確認各組分的互不交叉性中藥成分非常復雜，為了進一步確認結果的準確與可靠，全面檢測各拆分組分化學成分之間的互不交叉性，最終驗證拆分工藝的成功，本研究首先分別建立了30%乙醇、50%乙醇以及80%乙醇洗脫組分的HPLC色譜條件，進而分別采用三種不同的色譜條件，在HPLC-PDA與HPLC-ELSD的檢測器下，驗證各拆分組分的互不交叉性。

圖1 HPLC疊加圖

注：A.水煎總提物，B.30%乙醇洗脫組分，C.50%乙醇洗脫組分，D.80%乙醇洗脫組分

2.5.2.1 桑白皮各拆分組分HPLC色譜條件的建立 1)HPLC-PDA色譜條件：色譜柱：PLATISIL(TM)ODS C185 μm，250 mm×4.6 mm；流動相梯度洗脫條件見表2；流速：1.0 mL/min，柱溫：30 ℃；檢測波長：280 nm。

2)蒸發(fā)光檢測器(ELSD)：色譜柱：菲羅門Synergi Fusion-RP色譜柱(250 mm×4.6 mm，4 μm)；流動相梯度洗脫程序見表2；流速：1 mL/min,；柱溫：30 ℃；增益：10；數據率：10；漂移管溫度：60 ℃；氣體壓力：40 psi；噴霧器模式為加熱，其動力水平為36%。

表2 各拆分組分HPLC流動相梯度洗脫程序

2.5.2.2 采用HPLC-PDA色譜法對桑白皮各拆分組分互不交叉性研究分別以30%，50%，80%乙醇洗脫組分HPLC色譜條件驗證各拆分組分的互不交叉性(見表2)。采用30%乙醇洗脫條件時，50%、80%乙醇洗脫組分在0—65 min之間基本無相應的色譜峰出現(xiàn)；在50%乙醇洗脫條件下分析，30%、80%乙醇洗脫組分在45—75 min之間基本無相應的色譜峰出現(xiàn)；采用80%乙醇洗脫條件時，30%、50%乙醇洗脫組分在34—65 min之間基本無相應的色譜峰出現(xiàn)。結果顯示，采用PDA檢測器，在不同的流動相下對3種拆分組分反復比對，結果顯示采用不同的流動相各拆分組分保留時間基本無交叉，見圖2-圖4。