上氣道咳嗽綜合征大鼠模型的建立與評(píng)價(jià)*

★ 曹治山史鎖芳（1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 南京210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 南京210046）

基于已發(fā)表文獻(xiàn)中的造模方法均為單一的鼻竇炎模型或咽喉炎模型，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)合國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，選擇國(guó)內(nèi)常用的SD大鼠，在傳統(tǒng)模型制作方法基礎(chǔ)上進(jìn)行適當(dāng)改良摸索出一種新的上氣道咳嗽綜合征模型建立方法，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠20只，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2008-0010）。將大鼠按體重采用隨機(jī)區(qū)組法分為2組，每組10只。分別為：（1）對(duì)照組（170.81±6.17）g；（2）模型組（170.65±5.44）g；具有可比性。

1.2 材料與儀器（1）材料：膨脹海綿：由惠州華揚(yáng)醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)。批號(hào)：20101102。紅梅香煙：由紅塔煙草（集團(tuán)）有限公司生產(chǎn)，煙氣煙堿量：0.9mg，焦油量：11mg，煙氣一氧化碳：12mg。自制風(fēng)箱大小約40cm×50cm×60cm。大鼠IL-8試劑盒，美國(guó)RB公司生產(chǎn)，編號(hào)：BPE30583，批號(hào)：20140506BN；大鼠TNF-a試劑盒，美國(guó)RB公司生產(chǎn)，編號(hào)：BPE30635，批號(hào)：20140510FV。

（2）主要儀器：萊卡切片機(jī)（德國(guó)Leica公司，型號(hào)：RM2128）；熒光顯微鏡（日本制造，OLYMPUS型號(hào)：BX51）；照相機(jī)（日本制造，型號(hào)：OLYMPUS C-35AD-2）等。

1.3 造模方法 采用膨脹海綿鼻腔填塞（鼻竇炎）聯(lián)合香煙霧化（增加氣道炎癥）的方法[1-2］。先將大鼠腹腔注射麻醉后取膨脹明膠海綿片（3 mm×5 mm）置入大鼠左側(cè)鼻腔，距離前鼻孔約15 mm，位于竇口鼻道復(fù)合體處。后用1ml注射器抽取0.5mL金黃色葡萄球菌懸濁液緩慢小心注入左側(cè)鼻腔內(nèi)，海綿滯留4周后，模型組大鼠，每天被動(dòng)吸煙2h，連續(xù)20d。具體方法為：每天上午、下午將大鼠置于自制的風(fēng)箱內(nèi)，每次同時(shí)點(diǎn)燃3支香煙，持續(xù)約20min后，再點(diǎn)燃3支香煙，共自然燃燒9支香煙。6h后重復(fù)第2次吸煙。對(duì)照組以自由活動(dòng)為主。采取記分法記錄抓鼻、咳嗽、噴嚏、咯痰樣次數(shù)評(píng)估鼻竇及咽喉不適程度。方法如下：（1）抓鼻、噴嚏：輕度抓鼻1分；頻繁抓鼻2分；抓鼻不止3分。（2）咳嗽：2個(gè)以內(nèi)1分，3～5個(gè)2分；5個(gè)以上3分。（3）清喉：輕度咯痰樣1分；中度咯痰樣2分；咯痰樣不止3分。自香煙霧化結(jié)束后開(kāi)始觀察30min，采用疊加法記分，總分超過(guò)5分視為動(dòng)物造模成功。

待出現(xiàn)癥狀后，隨機(jī)從正常組和模型組各取2只作病理切片，模型組較正常組鼻竇組織黏膜明顯充血水腫、鼻竇、咽喉大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等典型的鼻竇部病變及上氣道炎癥，視為造模成功。

1.4 一般狀況觀測(cè) 觀察實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠的呼吸頻率、精神、飲食、活動(dòng)、毛發(fā)、大小便等。

1.5 標(biāo)本采集與觀測(cè)

1.5.1 大鼠血樣采集 常規(guī)方法采血后用于血清各指標(biāo)的檢測(cè)。

1.5.2 鼻竇部標(biāo)本采集 大鼠麻醉處死后，完整切取頭部：部分直接取鼻竇部標(biāo)本凍存；部分用中性甲醛固定，取鼻竇部標(biāo)本石蠟包埋，行HE染色。

1.5.3 咽喉壁標(biāo)本采集 大鼠麻醉處死后，沿著大鼠舌根部位，依據(jù)解剖位置固定咽喉部位，完整切取咽喉壁組織：用中性甲醛固定，取咽喉壁標(biāo)本石蠟包埋，行HE染色。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，所有數(shù)據(jù)用x-±s表示，各組間比較作t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 對(duì)照組大鼠反應(yīng)正常。模型組經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間鼻腔填塞及香煙霧吸后，出現(xiàn)抓鼻，鼻部不適，打噴嚏，發(fā)作性咳嗽，清嗓子，咯痰樣，易激惹，飲水量明顯增多，精神亢奮，食量減少，活動(dòng)明顯增加或煩躁不安等表現(xiàn)。造模后，造模各組大鼠鼻竇-咽部炎癥狀累計(jì)積分平均達(dá)到5分以上，與正常對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.2 血清中炎性介質(zhì)IL-8、TNF-a水平 大鼠模型組炎性介質(zhì)IL-8、TNF-a水平明顯升高，與對(duì)照組比較，P<0.03，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 組織病理形態(tài)學(xué)的變化（HE染色）對(duì)照組鼻竇黏膜及咽喉壁粘膜上皮完整，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組：鼻竇粘膜上皮細(xì)胞中度變性（++），纖毛變性壞死脫落（++），粘膜下層大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)（+++）；咽后壁粘膜層上皮細(xì)胞中度變性、壞死、脫落（++），粘膜層及下層大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)（+++）。

2.3.1 鼻竇黏膜組織（上鼻竇為主）（已切片，HE×40）

2.3.2 咽后壁（已切片，HE×10）

對(duì)照組 模型組

3 討論

上氣道咳嗽綜合征（UACS），過(guò)去稱(chēng)鼻后滴漏綜合征（PNDS），是慢性咳嗽最常見(jiàn)的原因之一，占持續(xù)咳嗽病因的40%~87%。隸屬于中醫(yī)學(xué)“風(fēng)咳”、“久咳”范疇。眾多醫(yī)家從“風(fēng)、痰、瘀、虛”等角度論治本病，但由于國(guó)內(nèi)外缺乏本病動(dòng)物模型的制造方法，因而中藥制劑或單味藥如何起效難以解釋。歐洲呼吸學(xué)會(huì)（ERS）將其發(fā)病原因歸咎于慢性鼻炎和鼻竇炎。而英國(guó)胸科學(xué)會(huì)（BTS）將這類(lèi)導(dǎo)致慢性咳嗽的病因總結(jié)為“上氣道疾病”。依據(jù)2009版的《咳嗽的診斷與治療指南》[3］中對(duì)UACS/PNDS達(dá)成的共識(shí)，目前公認(rèn)本病發(fā)病機(jī)制與鼻炎、鼻竇炎及氣道炎癥、氣道敏感性等因素密切相關(guān)。本次造模的方法具備下列特點(diǎn)：

3.1 干預(yù)因素符合本病的特點(diǎn) 當(dāng)慢性咳嗽的患者，有鼻炎、鼻竇炎病史或者咳嗽常伴有鼻竇部位或咽喉不適癥狀，應(yīng)考慮UACS的可能。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，使用膨脹海綿填塞大鼠，而避開(kāi)致敏的方法，使大鼠患上鼻竇炎，并且膨脹海綿長(zhǎng)期滯留有利于鼻竇部位病分泌物倒流。同時(shí)觀察到大鼠有明顯抓鼻、間斷咳嗽的情況。張羅等[4］詳細(xì)闡述了導(dǎo)致UACS的鼻腔鼻竇疾病。亦有學(xué)者[5-6］對(duì)慢性咳嗽與鼻竇炎之間的相關(guān)性進(jìn)行了探討。得出了鼻竇炎是引起慢性咳嗽的主要原因之一。其次，氣道炎癥，是引起咳嗽的重要病理基礎(chǔ)。短時(shí)間的煙霧刺激只是為增加氣道炎癥，而有別于與慢支、肺氣腫的造模方法。時(shí)翠芹等[7］測(cè)定了氣道炎癥在UACS中的作用，結(jié)果提示氣道炎癥可能通過(guò)增加咳嗽敏感性而在慢性咳嗽的發(fā)生中起重要作用，下呼吸道黏膜肥大細(xì)胞激活可能是連接氣道炎癥和咳嗽的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。張巧等[8］對(duì)92例慢性咳嗽并同時(shí)有咽部癥狀和體征的患者進(jìn)行病因?qū)W分析，得出“慢性咽炎”在慢性咳嗽中的重要性不應(yīng)被忽視。亦有學(xué)者[9-10］通過(guò)痰誘導(dǎo)的方式，得出不同病因慢性咳嗽患者存在不同氣道炎癥，其中鼻后滴漏綜合征表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞為主的氣道炎癥。

表1 造模前后大鼠鼻炎癥狀積分比較（x-±s，n=10）

表2 造模前后大鼠炎性介質(zhì)IL-8、TNF-a水平（x-±s，n=10）

對(duì)照組 模型組

3.2 血清檢測(cè)指標(biāo)及病理染色符合本病的特點(diǎn) 既往研究發(fā)現(xiàn)[11］，在非過(guò)敏性慢性咳嗽（鼻后滴漏綜合征、胃食管反流及特發(fā)性咳嗽）中，是以中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主的氣道炎癥并伴有IL-8的表達(dá)增加。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。IL-8對(duì)中性粒細(xì)胞具有強(qiáng)烈的趨化作用，亦能促使中性粒細(xì)胞釋放超氧化物、脫顆粒，并刺激花生四烯酸代謝產(chǎn)物的生成，從而導(dǎo)致機(jī)體局部炎癥反應(yīng)，達(dá)到殺菌和細(xì)胞損傷的能力；而腫瘤壞死因子-a在鼻粘膜損傷后，主要是局部的巨噬細(xì)胞釋放TNF-a，使其濃度升高，它通過(guò)對(duì)早期炎癥滲出、炎細(xì)胞的遷移、趨化、聚集與活化等起重要作用。因而，白細(xì)胞介素-8、腫瘤壞死因子-a的監(jiān)測(cè)對(duì)鼻炎、鼻竇炎及氣道炎癥反應(yīng)等有重要的意義[12-13］。

3.3 造模方面的不足 合格的動(dòng)物模型研制是研究開(kāi)發(fā)UACS新方法新制劑的基礎(chǔ)和必要條件，為此我們進(jìn)行了初步嘗試。此次造模有機(jī)的將鼻竇病變、氣道炎癥等因素結(jié)合起來(lái)，符合上氣道咳嗽綜合征發(fā)病特點(diǎn)?？梢猿醪秸J(rèn)為此模型制作方法是有一定的推廣價(jià)值的。但我們應(yīng)當(dāng)看到，咳嗽致病因素非常復(fù)雜，造模過(guò)程必須排除其他導(dǎo)致咳嗽的可能因素；大鼠的模型和人是有差別的，大鼠難以形象的表達(dá)出其不適癥狀。本病的干預(yù)因素及研究方法有待進(jìn)一步研究和深入。

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