響應(yīng)面法優(yōu)化山杏核殼總多酚提取工藝及其性質(zhì)研究

萬 山，楊 喆，張喬會(huì)，歐陽杰，王建中

（北京林業(yè)大學(xué)，北京林業(yè)大學(xué)林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100083）

工藝技術(shù)

響應(yīng)面法優(yōu)化山杏核殼總多酚提取工藝及其性質(zhì)研究

萬 山，楊 喆，張喬會(huì)，歐陽杰，王建中*

（北京林業(yè)大學(xué)，北京林業(yè)大學(xué)林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100083）

以山杏核殼為原料，利用閃式提取技術(shù)提取山杏核殼中的多酚類化合物，以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，通過響應(yīng)面分析法對(duì)閃提工藝進(jìn)行優(yōu)化，最終得到修正后的較優(yōu)提取工藝參數(shù)為：乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)63%，提取時(shí)間4.2 min，液料比23∶1，提取溫度61℃。此工藝參數(shù)下山杏核殼總多酚率為736.87 mg（GAE）/100 g。通過對(duì)紅外吸收峰的分析，發(fā)現(xiàn)樣品含有多酚類化合物的典型基團(tuán)。通過綜合熱重分析儀測(cè)定樣品熱穩(wěn)定性，在240℃以內(nèi)穩(wěn)定，在240～580℃范圍內(nèi)發(fā)生熱解。

山杏核殼，多酚，響應(yīng)面法，熱重分析，紅外

山杏（Armeniaca sibirica）是一種生態(tài)型經(jīng)濟(jì)樹種，主要生長于亞洲，我國分布區(qū)域?yàn)閮?nèi)蒙古、吉林、遼寧、甘肅、河北、山西等地，分布廣泛，資源豐富。山杏核殼作為山杏加工過程中的廢料被大量丟棄，造成資源的浪費(fèi)，可利用山杏核殼這一生物資源，人們將山杏殼制備活性炭[1]，制備木醋液[2]等，研究山杏核殼中的黑色素、總黃酮等[3-4]，但從山杏核殼中提取多酚類化合物及其性質(zhì)研究的報(bào)道尚少。多酚類化合物具有多種生物活性，具有延緩機(jī)體衰老及預(yù)防、治療心血管疾病、防癌、抗輻射等，對(duì)人體健康有著積極作用[5]，可用于食品和醫(yī)藥領(lǐng)域[6-7]。植物類多酚的提取方法通常有熱回流法和浸提法[8]，所需時(shí)間較長，得率不穩(wěn)定。閃式提取有溶劑用量小，提取時(shí)間短，效率高等特點(diǎn)，能夠最大限度保留提取物有效成分。本研究以山杏核殼為原料，通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化山杏核殼總多酚閃式提取工藝條件，并通過紅外光譜儀和綜合熱重分析儀，探究其相關(guān)理化性質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山杏核殼 購自北京延慶；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 天津市津科精細(xì)化工研究所；無水乙醇、無水碳酸鈉、福林酚試劑等 均為分析純。

JHBE-50S閃式提取器 北京金鼐科技發(fā)展有限公司；Tensor27型FT-IR紅外光譜儀 德國Bruker公司；TGA60熱重分析儀 日本Shimadzu公司；FA2004電子天平 上海上平儀器有限公司；SHZ-III循環(huán)水式多用真空泵 上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司；T6新世紀(jì)型紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申順生物科技有限公司；TD5A臺(tái)式低速離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司；DZF真空干燥箱 上海龍躍儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密稱取120℃真空干燥至恒重的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，用蒸餾水溶解，定容至100 mL，搖勻，即得濃度為0.1 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密吸取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL分別置于25 mL容量瓶中，分別加入福林酚試劑3 mL，搖勻，靜置30 s，再分別加入10%碳酸鈉溶液6 mL，搖勻，定容至刻度，避光靜置2 h。以第一個(gè)樣品為空白樣，在760 nm波長處測(cè)定其余樣品吸光度A，以濃度C為橫坐標(biāo)，以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[9]。

1.2.2 山杏核殼總多酚得率測(cè)定 將山杏核殼用粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，準(zhǔn)確稱取10.0 g，加入一定量乙醇溶液，在一定條件下進(jìn)行閃式提取，過濾，測(cè)定濾液體積。取1 mL上述濾液于25 mL容量瓶中，以制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，即福林酚-碳酸鈉顯色法顯色，在760 nm處測(cè)定其吸光度，并利用回歸方程確定山杏核殼樣品中總多酚得率，總多酚得率以每100 g干質(zhì)量等同于沒食子酸的毫克數(shù)表示。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以乙醇體積分?jǐn)?shù)、閃提時(shí)間、液料比、提取溫度四個(gè)因素為研究對(duì)象，以山杏核殼中總多酚得率為指標(biāo)，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.1 乙醇的體積分?jǐn)?shù)對(duì)得率的影響 準(zhǔn)確稱取5份處理好的山杏核殼粉，每份10.0 g，分別加入體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，以20∶1的液料比，在50℃的溫度下提取3 min。

1.2.3.2 提取時(shí)間對(duì)得率的影響 準(zhǔn)確稱取5份處理好的山杏核殼粉，每份10.0 g，加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液，以20∶1的液料比，在50℃的溫度下分別提取1、2、3、4、5 min。

1.2.3.3 液料比對(duì)得率的影響 準(zhǔn)確稱取5份處理好的山杏核殼粉，每份10.0 g，加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液，分別以10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1的液料比，在50℃的溫度下提取4 min。

1.2.3.4 提取溫度對(duì)得率的影響 準(zhǔn)確稱取5份處理好的山杏核殼粉，每份10.0 g，加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液，以20∶1的液料比，分別在30、40、50、60、70℃的溫度下提取4 min。

1.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 為分析各影響因素間的交互作用對(duì)山杏核殼總多酚得率的影響，結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，分別選取以乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、液料比、提取溫度為實(shí)驗(yàn)因素，以山杏核殼總多酚得率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理，運(yùn)用Design Expert 7.0軟件進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定最佳實(shí)驗(yàn)條件。實(shí)驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels in single-factor design

1.2.5 山杏核殼總多酚的紅外分析[10-11]取少量樣品置于紅外光譜儀中進(jìn)行測(cè)定，掃描分辨率2 cm-1，掃描范圍為4000～400 cm-1，掃描次數(shù)32次。

1.2.6 山杏核殼總多酚的熱穩(wěn)定性分析[12-13]為考察山杏核殼總多酚的熱穩(wěn)定性，準(zhǔn)確稱取少量的山杏核殼總多酚（3～8 mg），放入綜合熱重分析儀內(nèi)對(duì)其進(jìn)行熱TG/DTG分析測(cè)定。分析條件：掃描溫度為20～600℃，升溫速度為10℃/min，N2流速為40 mL/min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理分別采用Microsoft Excle（Office 2007）、Design Expert 7.0等軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示，得到回歸方程：C= 0.1493A-0.0015（R2=0.9997）。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curves

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總多酚得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction rate of polyphenols

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇 提取溶劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)對(duì)山杏核殼總多酚得率的影響如圖2所示。結(jié)果顯示，山杏核殼總多酚得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而升高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%時(shí)，得率達(dá)到最高，之后隨著提取溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，山杏核殼總多酚得率逐漸下降，乙醇濃度過高不利于水溶性多酚類物質(zhì)的析出，并且會(huì)使蛋白質(zhì)等生物大分子變性沉淀，阻礙多酚類物質(zhì)從組織細(xì)胞向容劑中擴(kuò)散[14]。

2.2.2 閃提時(shí)間的選擇 閃式提取時(shí)間對(duì)山杏核殼總多酚得率的影響如圖3所示。隨著閃提時(shí)間的不斷增加，山杏核殼總多酚得率不斷升高，當(dāng)閃提時(shí)間達(dá)到4 min時(shí)，得率達(dá)到最高，之后繼續(xù)增加提取時(shí)間，山杏核殼總多酚得率略有下降，提取時(shí)間過長，閃式提取器刀頭高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生大量熱，易發(fā)生氧化反應(yīng)，破壞了多酚類物質(zhì)。

圖3 閃提時(shí)間對(duì)總多酚得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of polyphenols

2.2.3 提取溫度的選擇 不同提取溫度對(duì)山杏核殼總多酚得率的影響如圖4所示。隨著提取溫度不斷上升，山杏核殼總多酚得率不斷升高，提取溫度為60℃時(shí)得率達(dá)到最高，隨后溫度的增加，得率略有下降，提取溫度過高，易氧化變質(zhì)，影響多酚類物質(zhì)提取得率[15]。

圖4 溫度對(duì)總多酚得率的影響Fig.4 Effect of temperature on extraction rate of polyphenols

2.2.4 液料比的選擇 不同液料比對(duì)山杏核殼總多酚得率的影響如圖5所示。結(jié)果顯示，山杏核殼總多酚得率隨著液料比的增加而升高，當(dāng)液料比達(dá)到20∶1時(shí)，得率達(dá)到最高，之后繼續(xù)增加液料比，山杏核殼總多酚得率無明顯變化。

圖5 液料比對(duì)總多酚得率的影響Fig.5 Effect of liquid/material ratio on extraction rate of polyphenols

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Program and experimental results of response surface methodology

2.3 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 山杏核殼總多酚閃提工藝回歸模型的建立以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、閃提時(shí)間（B）、液料比（C）、溫度（D）為自變量，以山杏核殼總多酚得率（Y）為響應(yīng)值設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。采用Design Expert 7.0軟件，對(duì)表2中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得出山杏核殼總多酚得率的回歸方程：

Y=715.80+14.00A+26.42B+76.92C+16.67D+ 31.50AB-10.50AC+3.50AD-21.00BC-6.75BD-3.25CD-29.90A2-61.52B2-69.02C2-52.65D2。

2.3.2 山杏核殼總多酚閃提工藝回歸模型方差分析 對(duì)2.3.1中得到的回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。

通過表3可以直觀看到，模型的二次項(xiàng)B2、C2、D2和一次項(xiàng)C達(dá)到極顯著水平，p＜0.0001；二次項(xiàng)A2和一次項(xiàng)B達(dá)到高度顯著水平，p＜0.01；另外D和AB兩項(xiàng)達(dá)到顯著水平，p＜0.05。結(jié)果表明，該模型下響應(yīng)值變化復(fù)雜，各自變量影響因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡單的線性影響。

通過表3還可以看到，模型顯著性檢驗(yàn)為極顯著，p＜0.0001，失擬項(xiàng)p為0.0510＞0.05，無失擬因素存在，因此說明該模型與實(shí)驗(yàn)擬合度良好。該回歸方程相關(guān)系數(shù)R2=0.9523，校正決定系數(shù)R2Adj=0.9046，說明該模型能夠解釋95.23%的變化，因此進(jìn)一步說明該模型具與實(shí)驗(yàn)有較好的擬合度，可通過該回歸方程對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析及預(yù)測(cè)。

圖6 Y=f（A，B）的響應(yīng)曲面圖Fig.6 Responsive surfaces of Y=f（A，B）

圖7 Y=f（A，C）的響應(yīng)曲面圖Fig.7 Responsive surfaces of Y=f（A，C）

通過表3實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，各自變量影響因素對(duì)響應(yīng)值的影響大小順序?yàn)椋阂掖俭w積分?jǐn)?shù)（A）＜提取溫度（D）＜提取時(shí)間（B）＜液料比（C）。

2.3.3 響應(yīng)面分析 響應(yīng)曲面反映的是兩個(gè)不同影響因素之間的交互作用。通過Design Expert 7.0軟件，將乙醇體積分?jǐn)?shù)、閃提時(shí)間、液料比例、閃提溫度四個(gè)因素分別進(jìn)行兩兩比較分析，圖6～圖11為各因素間交互作用的響應(yīng)曲面圖及相應(yīng)等高線圖。乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間之間的交互作用及乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比之間的交互作用，對(duì)山杏核殼總多酚得率的影響非常大；乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取溫度之間的交互作用對(duì)山杏核殼總多酚得率影響最大且顯著，其它因素間交互作用對(duì)山杏核殼總多酚得率有一定影響但均不顯著。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Variance analysis of mathematical regression model

2.3.4 最佳閃提工藝條件的確定 通過Design Expert 7.0軟件對(duì)山杏核殼總多酚的閃式提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步得到較優(yōu)工藝參數(shù)為：提取溶劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)為62.52%，閃提時(shí)間為4.19 min，液料比為22.53∶1，提取溫度為61.40℃，此條件下，山杏核殼總多酚得率的預(yù)測(cè)值為740.64（mg（GAE）/100g）。為便于實(shí)驗(yàn)操作，在實(shí)際操作中將以上工藝參數(shù)修正為：提取溶劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)為63%，閃提時(shí)間為4.2 min，液料比為23∶1，提取溫度為61℃，并在此工藝參數(shù)條件下進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得山杏核殼總多酚提取得率平均約為736.87（mg（GAE）/100g），與預(yù)測(cè)值相差很小，說明該模型與實(shí)際擬合度良好，用于預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較可靠，可用于山杏核殼總多酚提取工藝的優(yōu)化。

圖9 Y=f（B，C）的響應(yīng)曲面圖Fig.9 Responsive surfaces of Y=f（B，C）

圖10 Y=f（B，D）的響應(yīng)曲面圖Fig.10 Responsive surfaces of Y=f（B，D）

圖11 Y=f（C，D）的響應(yīng)曲面圖Fig.11 Responsive surfaces of Y=f（C，D）

2.4 山杏核殼總多酚紅外結(jié)果分析

山杏核殼提取樣品的紅外光譜圖如圖12所示，樣品圖譜中在3368.97 cm-1處有較寬的吸收峰，是-OH伸縮振動(dòng)峰，說明樣品化學(xué)結(jié)構(gòu)中存在羥基；2936.52 cm-1處有較弱的C-H伸縮振動(dòng)峰，說明飽和碳上的氫較少；1660.02 cm-1處的吸收峰是羰基伸縮振動(dòng)造成的，推測(cè)其為酮羰基；1510.45、1455.99 cm-1兩處的吸收峰是苯環(huán)中C=C的伸縮振動(dòng)峰；1000～800 cm-1處的吸收峰可能是苯環(huán)上取代基引起的。綜上所述，樣品的化學(xué)結(jié)構(gòu)含有典型的酚類化合物基團(tuán)，吸收峰位置基本吻合，因此能夠證明樣品為山杏核殼總多酚。

圖12 山杏核殼總多酚紅外光譜圖Fig.12 IR spectrum of polyphenols from shell of wild apricot

2.5 山杏核殼總多酚熱穩(wěn)定性結(jié)果分析

多酚標(biāo)準(zhǔn)品與山杏核殼總多酚的熱重分析結(jié)果如圖13所示。從TGA曲線可以看出多酚標(biāo)準(zhǔn)品有兩個(gè)明顯的失重峰，其中第一個(gè)失重峰出現(xiàn)在80℃左右，失重率為8.91%，這可能是由于標(biāo)準(zhǔn)品中含有一定的水分，加熱失水造成的失重；多酚標(biāo)準(zhǔn)品失重主要發(fā)生在第二個(gè)失重峰階段，溫度在240～380℃之間，失重率為62.48%，說明酚類化合物在該溫度范圍內(nèi)不穩(wěn)定。從山杏核殼總多酚樣品的TGA曲線可以看出，與多酚標(biāo)準(zhǔn)品的失重曲線基本一致，240℃之前較為穩(wěn)定，主要失重階段位于240～390℃之間，失重率為32.22%；同時(shí)，在390～580℃之間還存在一個(gè)失重峰，失重率為18.75%，這可能是由于山杏核殼總多酚樣品中存在雜質(zhì)，溫度達(dá)到390℃之后雜質(zhì)開始失重，進(jìn)而出現(xiàn)第二個(gè)失重峰。樣品反應(yīng)結(jié)束后總失重率約為59.78%，剩余物質(zhì)質(zhì)量略高于標(biāo)準(zhǔn)品，這可能是由于樣品存在雜質(zhì)，當(dāng)溫度升高至600℃時(shí)仍未達(dá)到雜質(zhì)的熱解溫度，從而使雜質(zhì)殘留下來，導(dǎo)致剩余物質(zhì)質(zhì)量增加。

3 結(jié)論

3.1 采用閃式提取法對(duì)山杏核殼中的多酚類物質(zhì)進(jìn)行提取，通過Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理建立提取工藝優(yōu)化回歸方程模型。經(jīng)方差分析該模型擬合度良好，經(jīng)修正后得到較優(yōu)提取工藝參數(shù)為：提取溶劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)為63%，閃提時(shí)間為4.2 min，液料比為23∶1，提取溫度為61℃，此時(shí)，山杏核殼總多酚提取平均得率為736.87 mg（GAE）/100 g。

圖13 山杏核殼總多酚失重圖（氮?dú)獗Ｗo(hù)）Fig.13 TGA analysis of polyphenols from shell of wild apricot（under N2condition）

3.2 樣品的紅外吸收峰圖譜顯示，樣品含有多酚類化合物的典型基團(tuán)，吸收峰位置基本吻合，因此可說明，本實(shí)驗(yàn)所提取得到的物質(zhì)為山杏核殼中的多酚類化合物。熱重力分析結(jié)果顯示，山杏核殼總多酚在240℃之前較為穩(wěn)定，加熱至240℃之后發(fā)生熱解，主要失重峰位于240～390℃之間，與多酚標(biāo)準(zhǔn)品基本一致。

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Study on optimization of extraction of polyphenols from shell of wild apricot by response burface methodology and its characterization

WAN Shan，YANG Zhe，ZHANG Qiao-hui，OUYANG Jie，WANG Jian-zhong*
（Beijing Key Laboratory of Forest Food Processing and Safety，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China）

The shell of wild apricot were used as the raw material to extract polyphenols by flash-extraction，based on single factor experiments，extraction condition was optimized by response surface methodology.The results showed that the optimum conditions of extraction of the polyphenols from shell of wild apricot were as follows：63%ethanol concentration，4.2 min extraction time，23∶1 liquid/material ratio and 61℃ extraction temperature.Under this condition，the maximal content of polyphenols was up to 736.87 mg（GAE）/100 g.The results showed that the extracts contained the typical groups of polyphenols and it was stable under 240℃and occured of pyrolysis reaction in the temperature range of 240～580℃.

shell of wild apricot；polyphenols；response surface methodology；thermal gravity analysis；infrared radiation

TS201.1

B

1002-0306（2015）22-0221-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.038

2015－03－31

萬山（1989-），女，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物研究，E-mail：m15311935803@163.com。

*通訊作者：王建中（1951-），男，碩士，教授，研究方向：林產(chǎn)品加工利用，E-mail：m15311935803@163.com。

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201004081）。