高效降解展青霉素乳酸菌的分離鑒定及去除機理研究

龔 雪，田豐偉，翟齊嘯，王 剛，張秋香，張 灝，陳 衛(wèi)，2，*

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫214122）

高效降解展青霉素乳酸菌的分離鑒定及去除機理研究

龔 雪1，田豐偉1，翟齊嘯1，王 剛1，張秋香1，張 灝1，陳 衛(wèi)1，2，*

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫214122）

目的：從發(fā)酵食品材料中篩選出對展青霉素（PAT）有去除作用的乳酸菌。方法：將從傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜中分離得到的乳酸菌與展青霉素共培養(yǎng)，利用高效液相色譜法（HPLC）測定共培養(yǎng)體系中PAT毒素的減少量，篩選出一株高效去除PAT毒素的乳酸菌菌株。通過微生物形態(tài)學(xué)、16S rDNA測序鑒定，確定該菌的系統(tǒng)分類學(xué)地位。通過比較不同致死方式對實驗菌株去除展青霉素效能的影響，并研究細胞壁和胞內(nèi)物質(zhì)對PAT的去除效果，初步探索乳酸菌去除展青霉素的機理。最后研究不同因素處理對實驗菌株去除PAT毒素的影響。結(jié)果：從發(fā)酵食品材料中篩選出一株高效去除PAT的菌株LB-11，經(jīng)初步鑒定該菌株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。致死菌和細胞壁的去除效率顯著低于有活性的完整菌體，推測乳酸菌去除展青霉素主要機理為生物降解作用。在溫度為20～30℃和pH為3～7的條件下實驗菌株對PAT均有較高的去除效率。結(jié)論：LB-11對PAT具有較高的去除效率，在合適的條件下，在24 h內(nèi)對PAT的去除率達到了98.34%，是一株極具應(yīng)用價值的益生菌。

乳酸菌，展青霉素（PAT），菌種鑒定，去除率

展青霉素（Patulin，簡寫為PAT）又稱棒曲霉素，是青霉屬、曲霉屬、絲衣霉屬等多種真菌的次生代謝產(chǎn)物[1]。動物展青霉素中毒急性癥狀包括肌肉震顫、對外界刺激敏感、肌肉痙攣、胃腸潰瘍等癥狀[2]。慢性毒性表現(xiàn)為神經(jīng)毒性、免疫毒性及基因毒性[3]。它主要存在于蘋果和蘋果制品以及梨、葡萄、甜椒和胡蘿卜等水果和蔬菜中[4]，給人類帶來食品安全風(fēng)險。國際上建議人類食用的蘋果產(chǎn)品中的棒曲霉素殘留量應(yīng)小于50 μg/kg[5]。固體蘋果產(chǎn)品中最大限量為25 μg/kg，兒童用蘋果汁和嬰兒食品中最大限量為10 μg/kg[6]。

目前，控制展青霉素的方法主要有物理方法和化學(xué)方法。物理方法如原料清洗、樹脂吸附等容易使展青霉素進入清洗用水或富集到吸附材料中，對環(huán)境構(gòu)成潛在的威脅；化學(xué)方法如臭氧降解、添加化學(xué)添加劑等由于成本昂貴或者安全性尚不明確，多停留在實驗階段，還未見實際應(yīng)用[7]。生物法由于成本低，操作簡單，安全性高而成為近年來的研究熱點。對展青霉素有較好去除作用的微生物主要為酵母菌[8]，而目前國內(nèi)外對乳酸菌的研究較少，且去除效率較低。乳酸菌作為益生菌能在動物體內(nèi)定殖發(fā)揮其多種有益于健康的功效，探索乳酸菌在去除食品或飼料中展青霉素的應(yīng)用具有重大的實用價值。

本研究將從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選獲得能夠高效去除展青霉素的乳酸菌菌株，并對其進行菌種鑒定。同時考察不同溫度、pH、展青霉素濃度等對實驗菌株去除展青霉素效果的影響。最后比較不同致死方式對實驗菌株去除展青霉素效能的影響，并用超聲波破碎細胞，分離出細胞壁和胞內(nèi)物質(zhì)，研究其對PAT的去除效果，初步探索乳酸菌去除展青霉素的機理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本實驗所用到的12株菌株 分離自自然發(fā)酵蔬菜中；蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、大豆蛋白胨、葡萄糖、磷酸氫二鉀、乙酸鈉、檸檬酸氫二銨、硫酸鎂、硫酸錳、吐溫-80、氯化鈉、磷酸二氫鉀 由中國醫(yī)藥集團上海化學(xué)試劑公司提供；甲醇（色譜純和）乙腈（色譜純） 購自江蘇漢邦科技有限公司；展青霉素標準品（PAT） 購自北京泰樂琪科技有限公司。

Waters 1525高效液相色譜儀（HPLC） Waters公司；5424R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；VCX150PB超聲波破碎儀 美國索尼克斯公司；SX-300高壓蒸汽滅菌鍋 日本TOMY公司；ZHJHC1109C超凈工作臺 上海智誠分析儀器制造有限公司；GRP-9160恒溫培養(yǎng)箱 一恒科技有限公司；Centrifuge 5415R冷凍離心機、Centrifuge 5804R冷凍離心機 德國Eppendorf公司；Milli-Q Reference超純水系統(tǒng) 德國Millipore公司；ZHWY-100H恒溫搖床 上海智誠分析儀器制造有限公司。

1.2 主要試劑的配制

1.2.1 MRS培養(yǎng)基 參照《微生物學(xué)實驗技術(shù)》課本的配方并略作調(diào)整[9]，主要配方如下：蛋白胨10 g，牛肉浸膏10 g，酵母提取物5 g，葡萄糖20 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸氫二銨2 g，磷酸氫二鉀2 g，七水合硫酸鎂0.58 g，四水合硫酸錳0.19 g，吐溫-80 1 mL；將上述內(nèi)容物以1000 mL蒸餾水溶解后，用1 mol/L鹽酸或1 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH至6.2～6.4，115℃濕熱滅菌20 min；MRS固體培養(yǎng)基是在MRS液體培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上，添加1.5%～2.0%的瓊脂，115℃濕熱滅菌20 min。

1.2.2 展青霉素

1.2.2.1 PAT貯備液 準確稱取5 mg的展青霉素標準溶液，溶于50 mL乙酸乙酯中，充分混勻溶解，并使用0.22 μm微孔濾膜進行過濾除菌后貯存于-20℃，得到濃度為100 mg/L的展青霉素貯備液[10]。

1.2.2.2 PAT工作液 根據(jù)需要，準確量取一定體積的展青霉素標準品母液，用氮氣吹干后溶于pH4.0水中，并定容至100 mL，配制成不同濃度的展青霉素工作液。

1.3 實驗方法

1.3.1 去除PAT菌株的篩選 參照張茜等[11]的方法篩選食品樣品中的乳酸菌并略作調(diào)整，具體方法為：取1 mL拍打均勻發(fā)酵蔬菜勻漿加入到30 mL MRS培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)20 h。梯度稀釋涂布于添加0.02%溴甲酚紫的MRS平板上。挑取變色圈明顯的單菌落，反復(fù)劃線得到純化的單菌落，挑選菌落直徑在1～3 mm之間，圓形隆起，表面光滑或稍粗糙，乳白、灰白或暗黃色等符合乳酸菌菌落特征的菌株，進行革蘭氏染色，挑選革蘭氏陽性、無芽孢菌株。

以2%接種量將菌株傳代兩次后，離心10 min（5000 r/min，4℃）收集菌體，再用磷酸鹽緩沖液（pH7.2）洗滌離心2次。將獲得的菌體重懸于1 mL含PAT濃度為1000 μg/L的生理鹽水中（pH4.0），調(diào)整菌濃度在1010CFU/mL左右，置于轉(zhuǎn)速為150 r/min的搖床中37℃培養(yǎng)24 h后取樣，離心10 min（12 000 r/min，4℃），取上清液使用0.22 μm微孔濾膜進行過濾后用高效液相色譜儀檢測PAT殘存濃度，同時設(shè)未加入菌體的同濃度PAT溶液作為陰性對照。檢測條件：色譜柱Unitary C18，150 mm×4.6 mm×5 μm；流動相為乙腈∶水=10∶90，流速1 mL/min，檢測器為紫外檢測器，檢測波長276 nm，上樣量為20 μL，展青霉素的出峰時間為8.1～10.1 min[12]。

1.3.2 菌株鑒定 將菌種接種于10 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)20 h，收集菌體，采用上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司DNA抽提試劑盒提取基因組DNA。以提取出的基因組DNA為模板，使用上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司的細菌16S rDNA通用引物（27F：5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′）和1492R：5′AAGGAGGTGATCCAGCCGCA3′）進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序并利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 菌體活性對實驗菌株去除PAT的影響 現(xiàn)有的研究報道提出乳酸菌能夠通過物理吸附包括黃曲霉毒素、重金屬離子在內(nèi)的多種毒素[13-14]。本研究通過比較活菌與致死處理后菌株對PAT去除率的差異，初步確定實驗菌株對PAT的作用類型。分別采用熱致死（121℃，20 min）、酸致死（2 mol/L，1 h）、甲醛致死（37℃，2 h）處理使菌失活，研究菌體活性對實驗菌株去除展青霉素的影響[14]。

1.3.4 菌株去除PAT機制初探 為了進一步確定實驗菌株是通過非特異性與展青霉素結(jié)合還是分泌某種酶來降解展青霉素，設(shè)計了以下實驗：收集實驗菌株菌體，懸浮于磷酸鹽緩沖液（pH7.2），調(diào)整其濃度為1010CFU/mL，超聲波破碎（400 W，工作時間5 s停頓時間5 s）30 min[15]，破碎后離心（14000×g，4℃）10 min，取上清液得到菌株胞內(nèi)物質(zhì)，沉淀為菌株細胞壁。分別取1010CFU完整活細胞菌體，菌株細胞壁和胞內(nèi)物質(zhì)和一定濃度展青霉素溶液共培養(yǎng)，于25℃轉(zhuǎn)速為150 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h后離心取上清，使用HPLC檢測展青霉素殘留濃度，同時設(shè)未加入菌體的同濃度PAT溶液作為空白對照。

1.3.5 溫度、PAT濃度、pH等對實驗菌株去除PAT的影響 將菌種按2%接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)，待菌株生長到對數(shù)中后期時，離心收集菌體，再用磷酸鹽緩沖液（pH7.2）洗滌離心2次。

研究溫度對實驗菌株去除PAT的影響，分別在溫度為15、20、25、30、37、45℃下，使1010CFU菌體與1 mL濃度為1000 μg/mL的PAT在轉(zhuǎn)速為150 r/min搖床中共培養(yǎng)24 h后離心10 min（12000 r/min，4℃）取上清，用HPLC檢測上清中PAT殘存濃度。每個樣品做三個平行，同時設(shè)未加入菌體的同濃度PAT溶液作為陰性對照。

選擇最優(yōu)培養(yǎng)溫度，PAT濃度對實驗菌株去除展青霉素的影響選用500、1000、1500、2000 μg/L四種毒素濃度；pH的影響選用pH分別為2、3、4、5、6和7共6個pH梯度；研究菌體濃度對去除效果的影響時，選用濃度分別為1×1010、5×109、2.5×109CFU/mL的菌體，研究其在不同時間間隔（0.5、4、8、12、24 h）對展青霉素的去除情況。研究以上因素對PAT去除率的影響時，均選擇最佳去除溫度，另外除了這些因素變量外，其他條件均與研究溫度對PAT去除率的影響時的條件一致。

1.3.6 去除率的計算

PAT去除率（%）=（陰性對照PAT濃度-菌液樣品上清PAT濃度）/陰性對照PAT濃度×100

1.3.7 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析 本文的數(shù)據(jù)采用Excel軟件進行處理，使用SPASS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，以O(shè)ne-way ANOVA兩兩比較中的Tukey法進行顯著性分析，以p＜0.05時為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選結(jié)果

采用添加0.02%溴甲酚紫的MRS平板稀釋分離泡菜中的乳酸菌，根據(jù)MRS平板顏色變化及菌落形態(tài)對乳酸菌進行初步篩選，將初選到的菌落進行革蘭氏染色，取革蘭氏陽性、無芽孢符合乳酸菌特性的菌落進行展青霉素去除實驗，一共分理出12株類似乳酸菌菌株分別標號為LB-1～LB-12將這12株菌進行PAT去除實驗，結(jié)果如表1所示。從表1中可以看出，菌株LB-11顯示出最高的展青霉素去除能力，PAT初始濃度為1000 μg/L時，菌體和PAT毒素在37℃轉(zhuǎn)速為150 r/min的搖床中共培養(yǎng)24 h后，該菌株對展青霉素的去除率達到了90.78%，顯著高于Shaimaa等[16]的研究結(jié)果。Shaimaa等[16]研究了5株不同的乳酸菌株對展青霉素的去除作用，發(fā)現(xiàn)的兩株乳酸菌對展青霉素具有一定的去除能力，但使用1010CFU的乳酸菌對濃度為1000 μg/L的PAT在24 h內(nèi)的最高去除率僅為52.9%，明顯低于本研究中的LB-11。

表1 12株菌株的PAT去除能力Table 1 PAT removal capacity of twelve strains

2.2 實驗菌株的初步鑒定

2.2.1 實驗菌株形態(tài)特征觀察 實驗菌株LB-11菌落形態(tài)：37℃培養(yǎng)48 h，在MRS固體培養(yǎng)基上生長良好，如圖1（A）所示，菌落直徑約2 mm，菌落表面光滑、有光澤，圓形，邊緣整齊，中央略微隆起，呈乳白色。

實驗菌株LB-11個體形態(tài)：如圖1（B）所示，細胞形態(tài)為桿狀，革蘭氏陽性，無鞭毛和芽孢。

圖1 菌株LB-11菌落形態(tài)和細胞形態(tài)Fig.1 The colonial morphology and cell individual characteristic of LB-11

2.2.2 16S rDNA序列測定 將菌株LB-11 16S rRNA基因經(jīng)PCR擴增并測序后得到長度為1448 bp的基因序列，上傳序列至GenBank得到菌株登錄號為KM389621，與GenBank內(nèi)已知基因序列進行同源比對分析，建立系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其發(fā)育關(guān)系，結(jié)果如圖2所示。從圖2中可以看出該實驗菌株與Lactobacillus plantarum 1-3的可信度達100%，可確定該實驗菌株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

2.3 菌體活性對實驗菌株去除PAT的影響

如圖3所示，當(dāng)對實驗菌株分別采用不同的致死方式致死后，死細胞對展青霉素也具有一定的去除作用，但去除效果顯著低于活菌。這表明菌株活性是影響展青霉素去除率的一個重要因素，初步推斷實驗菌株對展青霉素的去除作用與菌體的代謝活性有很大的相關(guān)性。而致死菌株對展青霉素也有一定的去除能力，可能與菌株細胞表面的吸附作用相關(guān)。Haskard等[17]研究發(fā)現(xiàn)失活的乳酸菌能夠有效地去除黃曲霉毒素，主要是由于菌株細胞壁對黃曲霉毒素的物理吸附作用。由此可判斷菌株對展青霉素的去除是物理吸附和生物降解的雙重作用，而物理吸附對菌株去除展青霉素的影響有限，生物降解起主導(dǎo)作用。由于外界溫度、pH等均會通過影響細胞的代謝活性來影響去除效果，因此對外界環(huán)境的控制對乳酸菌去除展青霉素尤為重要。

圖2 菌株LB-11 16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The phylogenetic tree of LB-11

圖3 菌體活性對植物乳桿菌去除PAT的影響Fig.3 Influence of bacterial activity on removal of PAT

2.4 實驗菌株去除PAT機制初探

由圖4可知，無論是細胞壁還是細胞超聲破碎后的上清對展青霉素的去除效率都遠低于完整植物乳桿菌細胞的去除率，這進一步排除了細胞壁對展青霉素的表面吸附作用也并非單一是由細胞內(nèi)的酶起到去除展青霉素的作用，而是依賴于具有活性的完整細胞。細胞通過代謝產(chǎn)生的酶類產(chǎn)物對展青霉素的去除起到了主要作用。

2.5 實驗菌株去除PAT的影響因素研究

2.5.1 溫度對展青霉素去除效果的影響 由圖5可知，實驗菌株LB-11去除展青霉素的最適溫度范圍為20～30℃，其中在25℃時的去除效率最高，實驗菌株與1000 μg/L的PAT在25℃共培養(yǎng)24 h后，去除率達到98.34%。超出這個范圍去除率隨著溫度的升高或降低呈現(xiàn)出下降的趨勢。推測溫度主要是影響菌株代謝酶活性來影響菌株的去除效率，在20～30℃時，去除展青霉素的相關(guān)酶系代謝活性較高，因而在這個溫度范圍內(nèi)菌株對展青霉素具有較好的去除效果。

圖4 植物乳桿菌胞內(nèi)提取物與細胞壁對PAT去除結(jié)果的HPLC圖譜Fig.4 The HPLC picture of Pat removal ability of both cell wall and Intracellular extract

2.5.2 PAT初始濃度對去除率的影響 由圖6可知，隨著PAT初始濃度的增加，實驗菌株對展青霉素的去除效果不斷降低，但去除率都達到了90%以上。

2.5.3 pH對實驗菌株去除PAT的影響 環(huán)境pH對微生物的生命活動有很大的影響，從而影響酶的活性。由圖7可知，實驗菌株在一定的pH范圍內(nèi)都能維持較高的展青霉素去除率，但當(dāng)pH較低時，細胞代謝活性受到影響[10]，對展青霉素的去除效果顯著降低。當(dāng)pH為2時，實驗菌株對展青霉素的去除率僅為22.49%。

圖5 溫度對植物乳桿菌去除PAT的影響Fig.5 Influence of temperature on removal of PAT

圖6 PAT初始濃度對植物乳桿菌去除PAT的影響Fig.6 Influence of initial toxin concentrations on removal of PAT

圖7 pH對植物乳桿菌去除PAT的影響Fig.7 Influence of pH on removal of PAT

圖8 菌體濃度對植物乳桿菌去除PAT的影響Fig.8 Influence of bacterial concentration on removal of PAT

2.5.4 菌體濃度對實驗菌株去除PAT的影響 如圖8所示，菌體濃度對實驗菌株去除展青霉素的效果也有影響，菌體濃度增加，可以增加菌株代謝酶的濃度，進而提高展青霉素去除率。當(dāng)菌體濃度為1010CFU/mL時，對展青霉素的去除率隨著時間迅速上升，在4 h時實驗菌株對展青霉素的去除率已達到84.67%，8 h后可達90%以上，12 h后對展青霉素的去除效果沒有明顯的變化，24 h時的去除率為98.34%。當(dāng)菌體濃度為2.5×109CFU/mL時，與1000 μg/L的展青霉素共培養(yǎng)24 h后，去除率僅達到52.75%。

3 結(jié)論

通過PAT去除菌的篩選，從泡菜中分離篩選出一株能高效去除展青霉素的菌株LB-11，經(jīng)鑒定該菌株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。通過比較不同致死方式對實驗菌株去除展青霉素效能的影響，并用超聲波破碎細胞，分離出細胞壁和胞內(nèi)物質(zhì)，研究其對PAT的去除效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)致死菌株對PAT的去除效果顯著降低，并且細胞壁對PAT的去除效果也較差，推測該植物乳桿菌對展青霉素的去除作用主要是由生物降解引起的。在pH為4濃度為1000 μg/L的展青霉素溶液中加入濃度為1010CFU/mL的該植物乳桿菌在溫度為25℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min的搖床中共培養(yǎng)24 h，可將展青霉素的濃度由1000 μg/L降至16.6 μg/L，去除效率達98.34%。說明該菌株有較強的展青霉素去除能力。同時該菌株對展青霉素去除適應(yīng)的溫度和pH范圍較廣，在20～30℃和pH為3～7的條件下對展青霉素均有較高的去除效率，可廣泛應(yīng)用到食品與飼料中，具有很高的應(yīng)用價值。

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Isolation and identification of lactic acid bacteria with efficient patulin degradation ability and its degrading characteristics

GONG Xue1，TIAN Feng-wei1，ZHAI Qi-xiao1，WANG Gang1，ZHANG Qiu-xiang1，ZHANG Hao1，CHEN Wei1，2，*
（1.Academy of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Objective：To screen and identify a lactic acid bacteria（LAB）strain with patulin（PAT）detoxification ability from fermented food.Methods：LAB strains isolated from fermented vegetables were co-cultured with PAT.Then the HPLC method was executed to determine the PAT residue after co-culture and one LAB strain with high PAT-degrading ability was selected for further study.The PAT removal efficiency of viable cells and dead cells，as well as different cell components including cell pellets，cell walls and cell extracts were compared，and the factors that impact the capability of PAT degradation of this strain were studied.Moreover，the strain’s taxonomy was confirmed based on morphology characteristics and 16S rDNA gene sequence analysis.Results：A LAB strain with high PAT-removing ability was screened out and identified as a Lactobacillus plantarum.The PAT removal efficiency of dead cells and cell wall were much lower than cell pellets，indicating that the removal mechanism may be attributed to biodegradation.This L.plantarum strain had high PAT-removing ability at temperature of 20～30℃and pH of 3～7.Conclusion：The L.plantarum strain LB-11 had a high removal ability of PAT.The removal efficiency of PAT could reach 98.34%under appropriate conditions within 24 h.This strain could be regarded as a probiotic with potential application on PAT removal.

lactic acid bacteria；patulin（PAT）；identification；removal rate

TS201.1

A

1002-0306（2015）22-0179-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.029

2015－03－04

龔雪（1990-），女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：quchenyuan1@163.com。

*通訊作者：陳衛(wèi)（1966-），男，教授，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：chenwei66@jiangnan.edu.cn。

國家科技支撐計劃（2013BAD18B01）；國家自然科學(xué)基金（31371721）。