用于水酶法提取中碳鏈油脂菌株的篩選與鑒定

肖彥駿，曾 誠，馬毛毛，曾哲靈，3，*，余 平，3，鐘衛(wèi)民

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047；2.南昌大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江西南昌330031；3.南昌大學(xué)資源環(huán)境與化工學(xué)院，江西南昌330031；4.撫州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江西撫州344106）

用于水酶法提取中碳鏈油脂菌株的篩選與鑒定

肖彥駿1，曾 誠2，馬毛毛1，曾哲靈1，3，*，余 平1，3，鐘衛(wèi)民4

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047；2.南昌大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江西南昌330031；3.南昌大學(xué)資源環(huán)境與化工學(xué)院，江西南昌330031；4.撫州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江西撫州344106）

篩選和應(yīng)用產(chǎn)中性蛋白酶能力強(qiáng)、產(chǎn)脂肪酶能力很弱的耐中碳鏈脂肪酸型菌株，是提高水酶法提取樟樹籽仁油產(chǎn)品得率及質(zhì)量的關(guān)鍵。使用樟樹籽仁粕粉平板富集，脫脂奶平板法、油脂平板法初篩，福林酚法、樟樹籽仁培養(yǎng)基搖瓶復(fù)篩等方法，自樟樹籽仁油生產(chǎn)廢渣中篩選出產(chǎn)中性蛋白酶活力達(dá)4536.5 U/mL、產(chǎn)脂肪酶活力只有0.088 U/mL、適用于水酶法提取樟樹籽仁油等中碳鏈油脂的菌株Z16。經(jīng)過形態(tài)學(xué)、生理生化特征及16S rDNA分子生物學(xué)鑒定，確定菌株Z16為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。解淀粉芽孢桿菌Z16所產(chǎn)中性蛋白酶在50℃溫度下的酶活力最高，Mn2＋對其有明顯的激活作用，其適宜酶解溫度為40～45℃、適宜酶解pH為7.0。

菌株，篩選，鑒定，中碳鏈油脂，水酶法提取

樟樹籽仁油的中碳鏈脂肪酸甘油酯含量高于94%，為天然中碳鏈油脂，具有減少體內(nèi)脂肪沉積、降低血脂和血糖水平等作用，既是保健作用顯著的功能食用油，也是生產(chǎn)新一代腸外營養(yǎng)劑——結(jié)構(gòu)脂質(zhì)（Structure Lipids，SLs）的優(yōu)良原料[1-3]。水酶法提取植物油脂技術(shù)，不僅提取條件溫和、能耗低、過程安全、油脂得率較高（大于90%），而且能同時(shí)能獲得高品質(zhì)的植物油脂和植物蛋白，體現(xiàn)了油脂研發(fā)與生產(chǎn)領(lǐng)域的發(fā)展方向[4-5]。水酶法提取植物油脂中使用的中性蛋白酶基本上為枯草芽孢桿菌AS1.398、棲土曲霉3942、放線菌166等菌株所生產(chǎn)的。研究發(fā)現(xiàn)，采用這些菌株所產(chǎn)的中性蛋白酶液進(jìn)行水酶法提取樟樹籽仁油，樟樹籽仁油的得率小于83%、酸價(jià)大于5 mg KOH/g。造成樟樹籽仁油得率低、酸價(jià)高的原因是樟樹籽仁油中的中碳鏈脂肪酸及其甘油酯對枯草芽孢桿菌AS1.398等革蘭氏陽性菌、霉菌及生物酶具有較強(qiáng)的抑制作用[6-9]。因此篩選及應(yīng)用可在樟樹籽仁油等中碳鏈油脂培養(yǎng)基中生長、產(chǎn)中性蛋白酶能力強(qiáng)而基本不產(chǎn)脂肪酶的菌株，是提高水酶法提取樟樹籽仁油等中碳鏈油脂產(chǎn)品得率及質(zhì)量的關(guān)鍵。但國內(nèi)外至今還未見有關(guān)成功篩選出產(chǎn)蛋白酶能力強(qiáng)而產(chǎn)脂肪酶能力很弱的耐中碳鏈脂肪酸型菌株的文獻(xiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樟樹籽仁油生產(chǎn)廢渣 南昌香樟林高科技有限公司；餐飲廢水 南昌大學(xué)學(xué)生食堂；腐乳胚料 南昌久鴻食品有限公司；樟樹籽、玉米粉、麩皮、豆粕、脫脂奶粉 均為市售；Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、Na2CO3、NaCl、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、瓊脂、干酪素、福林酚、三氯乙酸 均為分析純。

FA1604型電子天平 德國賽多利斯有限公司；XMT1-8112型電熱恒溫水浴鍋、TQZ-312型臺式全溫振蕩器、全自動(dòng)高壓滅菌鍋、SKP-02420型電熱恒溫培養(yǎng)箱 均來自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；超凈工作臺 吳江市凈化設(shè)備總廠；HS-2F型pH儀 上海精密科學(xué)儀器有限公司雷磁儀器廠；TGL-16G型高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；XSZ-4G型中級生物顯微鏡、WFZ765PC型紫外可見分光度計(jì) 重慶光電儀器有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 樟樹籽仁粉的制備 將樟樹籽脫皮、脫殼，稱取一定量樟樹籽仁，以料液比1∶2與水混合，加入到膠體磨中濕法粉碎乳化4 min，得到的白色乳狀液，噴霧干燥得到樟樹籽仁粉（含油量57.96%）。

1.2.2 樟樹籽仁培養(yǎng)基A 樟樹籽仁粉2%，葡萄糖0.7%，KH2PO40.03%，Na2HPO4·12H2O 0.4%，瓊脂2%，pH7.0±0.2，115℃滅菌25 min。

1.2.3 樟樹籽仁培養(yǎng)基B 樟樹籽仁粉5%，葡萄糖0.7%，酵母粉0.3%，KH2PO40.03%，Na2HPO4·12H2O 0.4%，pH7.0±0.2，115℃滅菌25 min。

1.2.4 肉湯培養(yǎng)基 蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，pH7.0±0.2，121℃滅菌20 min。

1.2.5 脫脂奶培養(yǎng)基 在普通肉湯固體培養(yǎng)基中添加終質(zhì)量比為1.5%脫脂奶粉。脫脂奶粉用水溶解后單獨(dú)滅菌，115℃滅菌25 min，鋪平板前再與加熱融化了的肉湯固體培養(yǎng)基混合。

1.2.6 樟樹籽仁油培養(yǎng)基 蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，NaCl 0.5%，樟樹籽仁油1.2%，1.6%中性紅水溶液0.1%，瓊脂2%，pH7.0±0.2，121℃滅菌20 min[10]。

1.2.7 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基 玉米粉4%，麩皮2.5%，豆粕3%，KH2PO40.03%，Na2HPO4·12H2O 0.4%，pH7.0± 0.2，121℃滅菌20 min[11]。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株初篩

1.3.1.1 耐中碳鏈脂肪酸型菌株富集 稱取1 g左右分離源樣品，用無菌生理鹽水和10倍稀釋法，制備不同稀釋度（10-1～10-7）的稀釋液，從三個(gè)合適稀釋度中吸取100 μL稀釋液均勻涂布到樟樹籽仁培養(yǎng)基A平板上，每個(gè)稀釋度做四個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。37℃恒溫培養(yǎng)24 h，選取長有10個(gè)左右菌落的平板備用。

1.3.1.2 高產(chǎn)蛋白酶菌株初篩 采用點(diǎn)種法，用無菌牙簽沾取上一步驟中得到的菌落點(diǎn)種到脫脂奶培養(yǎng)基平板上，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，根據(jù)培養(yǎng)基中菌落透明圈直徑與菌落直徑比（H/C）大小進(jìn)行產(chǎn)蛋白酶菌株初篩，選取H/C較大的菌株備用。

1.3.1.3 低產(chǎn)脂肪酶菌株初篩 采用點(diǎn)種法，將上一步驟中H/C較大的菌株點(diǎn)種到樟樹籽仁油培養(yǎng)基平板上，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌落周圍是否產(chǎn)生紅色水解圈。選取無紅色油脂水解圈的菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩。

1.3.2 高產(chǎn)中性蛋白酶、低產(chǎn)脂肪酶菌株復(fù)篩 將初篩得到的菌株接種到肉湯培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min搖瓶培養(yǎng)24 h，制成種子液。以4%的接種量將種子液加入到基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中。37℃、220 r/min搖瓶培養(yǎng)48 h，取發(fā)酵液，8000 r/min離心分離10 min，上清液即為粗酶液。采用國標(biāo)GB/T 23527-2009《蛋白酶制劑酶活力測定方法》中規(guī)定的福林酚法，測定粗酶液中性蛋白酶活力，并測定中性蛋白酶活力超過1500 U/mL粗酶液的脂肪酶活力，脂肪酶活力采用國標(biāo)GB/T 23535-2009《脂肪酶制劑酶活測定方法》中規(guī)定的酸堿滴定法測定。選取產(chǎn)蛋白酶活力高、脂肪酶活力低的菌株。

1.3.3 用于水酶法提取中碳鏈油脂的菌株篩選 將上一步驟中復(fù)篩得到的菌株接種到肉湯培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min搖瓶培養(yǎng)24 h，制成種子液。以4%的接種量將種子液加入到樟樹籽仁培養(yǎng)基B中，37℃、220 r/min搖瓶培養(yǎng)48 h后，90℃保溫10 min滅活，膠體磨濕法粉碎乳化4 min，將得到的白色乳狀液4000 r/min離心分離25 min，收集底層渣相，干燥后得到樟樹籽仁殘?jiān)?，稱重并采用索氏提取法測定其含油量[12]?？瞻捉M中加入滅活的種子液，其他步驟同實(shí)驗(yàn)組。選取最能使樟樹籽仁殘?jiān)可?、含油量低的菌株?/p>

1.3.4 菌種鑒定

1.3.4.1 菌株形態(tài)鑒定 將菌株稀釋后涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)皿培養(yǎng)24 h后，肉眼觀察菌落形狀、顏色、大小和突起等特征。對菌株進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察菌株的細(xì)胞形態(tài)。

1.3.4.2 菌株的生理生化特征鑒定 參照文獻(xiàn)[13]。

1.3.4.3 菌株16S rDNA分子生物學(xué)鑒定 參照文獻(xiàn)[14]。使用上海生工生物工程股份有限公司提供的Ezpu柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取菌株基因組DNA。以提取的DNA為模版，采用細(xì)菌16SrRNA基因通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：上下游引物各0.5 μL，DNA模版0.5 μL，Taq Mix 3.7 μL，加ddH2O至25.0 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72℃延伸修復(fù)10 min。擴(kuò)增完成后的PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。切膠回收后用SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，并送至上海生工生物工程有限公司測序。

1.3.5 菌株所產(chǎn)蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)測定 在不同pH（分別為5、6、7、8、9、10、11）條件下分別測定菌株所產(chǎn)蛋白酶活力，確定其最適作用pH；在不同溫度（分別為35、40、45、50、55、60、65、70℃）條件下分別測定菌株所產(chǎn)蛋白酶活力，確定其最適作用溫度；在不同溫度（分別為40、45、50、55℃）保溫不同時(shí)間（10、30、60、90 min）后測定菌株所產(chǎn)蛋白酶活力，確定其熱穩(wěn)定性能；在菌株所產(chǎn)粗酶液中添加0.02 moL/mL不同的金屬離子后檢測菌株所產(chǎn)蛋白酶活力，確定不同金屬離子對其激活作用[15]。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)表示采用六次測試所獲的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。通過使用統(tǒng)計(jì)程序軟件（SPSS 19.0）方差分析法（ANOVA分析）與隨后的單獨(dú)樣品抽樣t檢測用來進(jìn)行比較。如果p＜0.05，則差異被認(rèn)為是系統(tǒng)上顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種篩選

菌株篩選結(jié)果列于表1中。由表1可知，經(jīng)過耐中碳鏈脂肪酸富集、高產(chǎn)蛋白酶菌株初篩及低產(chǎn)脂肪酶菌株初篩，從樟樹籽仁油生產(chǎn)廢渣篩選出耐中碳鏈脂肪酸、H/C值大于3.5、無油脂水解圈的菌株17株，從食堂廢水篩選出耐中碳鏈脂肪酸、H/C值大于2.0、無油脂水解圈的菌株3株，從腐乳胚料中篩選出耐中碳鏈脂肪酸、H/C值大于2.0、無油脂水解圈的菌株3株。經(jīng)過高產(chǎn)中性蛋白酶、低產(chǎn)脂肪酶菌株復(fù)篩，從來初篩菌株中復(fù)篩出高產(chǎn)中性蛋白酶（＞2500.0 U/mL）、低產(chǎn)脂肪酶（＜0.150 U/mL）的菌株3株（Z9、Z16、Z17），這3株菌株皆來源于樟樹籽仁油生產(chǎn)廢渣。

從Z9、Z16和Z17三株菌株中，篩選可用于水酶法提取樟樹籽仁油的菌株，其結(jié)果列于表2中。由表2可知，在水酶法提取樟樹籽仁油中，菌株Z16最能降低樟樹籽仁殘?jiān)牧考捌浜土浚簿驼f明該菌株提高樟樹籽仁油得率的效果最佳，適用于水酶法提取樟樹籽仁油。

2.2 菌種鑒定

菌株Z16在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，菌落呈圓形，直徑5.0～10.0 mm，厚度約2.0 mm，表面為淺黃色，有不規(guī)則波狀突起，邊緣平滑。革蘭氏染色為陽性，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)為桿狀，長度0.7～0.9 μm，直徑3.0～5.0 μm，內(nèi)生芽孢，無伴孢晶體，芽孢常見于細(xì)胞中部，孢子囊無明顯膨脹。

表1 耐中碳鏈脂肪酸、高產(chǎn)蛋白酶、低產(chǎn)脂肪酶菌株篩選結(jié)果Table 1 Results of high neutral protease-producing and low lipase-producing strain screening

表2 水酶法提取樟樹籽仁油用菌株復(fù)篩結(jié)果Table 2 Results of strain screening for camphor tree seed kernel oil extracted by aqueous enzymatic extraction

菌株Z16的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表3中。

菌株Z16的16S rDNA瓊脂糖凝膠電泳圖繪于圖5中。

菌株Z16的16S rDNA基因序列為：

GGTGCTATAATGCAAGTCGAGCGGACAGATG GGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTG AGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGA TAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTT GTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCT TCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGAC GATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACA CTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAG GCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGT CTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTT TCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAA GTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACC TAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAG CCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGA ATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTT AAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGA GGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAG AGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGC GTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCG ACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAA GCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAG TCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGG GGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAA GCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAA ACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGG TGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGA ACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAG AGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAG GTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGAT GTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGA TCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGT GACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCT ACACACGTGCTACAATGGGCAGAACAAAGGGCAG CGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTG TTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCG TGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCAT GCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACAC CGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAA GTCGGTGAGGTAACCTTTTTGGAGCCAGCCGCCGA AGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGAACAA GTTGT

圖1 菌株Z16蛋白酶水解圈形態(tài)Fig.1 Protease hydrolysis circle shape of strain Z16

圖2 菌株Z16菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of strain Z16

圖3 菌株Z16細(xì)胞形態(tài)Fig.3 Cell morphology of strain Z16

圖4 菌株Z16革蘭氏染色結(jié)果Fig.4 Gram staining results of strain Z16

表3 菌株Z16的生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain Z16

圖5 菌株Z16的16S rDNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.5 The 16S rDNA agarose gel electrophoresis pattern of Z16

將菌株Z16的16S rDNA基因序列與NCBI中的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因序列同源性Blast比對，結(jié)果顯示菌株Z16與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）的同源性達(dá)99%。綜合分析菌落形態(tài)、菌株細(xì)胞形態(tài)、生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果、基因序列對比結(jié)果，確定菌 株 Z16為一株解 淀粉芽 孢桿 菌（Bacillus amyloliquefaciens），并命名為解淀粉芽孢桿菌Z16（Bacillus amyloliquefaciens Z16）。

淀粉芽孢桿菌Z16的產(chǎn)中性蛋白酶能力，比近幾年文獻(xiàn)報(bào)道的枯草芽孢桿菌N19（產(chǎn)中性蛋白酶活力為158 U/mL）[16]、枯草芽孢桿菌Bx-4（產(chǎn)中性蛋白酶活力為2519.4 U/mL）[11]的產(chǎn)蛋白酶能力高很多，也高于國內(nèi)常用于生產(chǎn)中性蛋白酶制劑的出發(fā)菌株——枯草芽孢桿菌AS1.398（產(chǎn)中性蛋白酶能力2000 U/mL左右）、棲土曲霉3942（產(chǎn)中性蛋白酶能力為3000 U/mL左右）、放線菌166（產(chǎn)中性蛋白酶能力4000 U/mL）的產(chǎn)蛋白酶能力[17-18]。而解淀粉芽孢桿菌Z16的產(chǎn)脂肪酶活力大幅低于國內(nèi)常用于生產(chǎn)中性蛋白酶制劑的出發(fā)菌株的產(chǎn)脂肪酶能力（大于30 U/mL）。因此，解淀粉芽孢桿菌Z16適用于水酶法提取樟樹籽仁油等中碳鏈油脂。

2.3 解淀粉芽孢桿菌Z16所產(chǎn)蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 pH對解淀粉芽孢桿菌Z16所產(chǎn)蛋白酶活力的影響 如圖6所示，當(dāng)pH為7時(shí)，菌株所產(chǎn)蛋白酶活力最高。該酶的適宜pH為6.5～7.5，最佳pH為7，屬于中性蛋白酶，適宜水酶法提取植物油脂的pH環(huán)境。

圖6 pH對解淀粉芽孢桿菌Z16所產(chǎn)蛋白酶活力影響Fig.6 The effect of pH on protease produced by Bacillus amyloliquefaciens Z16

2.3.2 溫度對解淀粉芽孢桿菌Z16所產(chǎn)蛋白酶活力的影響 溫度對解淀粉芽孢桿菌Z16所產(chǎn)蛋白酶活力的影響如圖7所示，當(dāng)溫度低于50℃時(shí)，菌株所產(chǎn)蛋白酶活力隨溫度的升高而增高，50℃時(shí)菌株所產(chǎn)蛋白酶活力最高，為40℃時(shí)的179.6%；當(dāng)溫度超過55℃，菌株所產(chǎn)蛋白酶活力隨溫度升高而迅速降低。這是因?yàn)?，蛋白酶既是一種催化劑也是一種蛋白質(zhì)，在某一溫度范圍內(nèi)，酶的催化活力會(huì)隨著溫度的升高而升高，溫度過高將導(dǎo)致蛋白酶變性而喪失催化活性。

圖7 溫度對解淀粉芽孢桿菌Z16所產(chǎn)蛋白酶活力影響Fig.7 The effect of temperature on protease produced by Bacillus amyloliquefaciens Z16

2.3.3 解淀粉芽孢桿菌Z16所產(chǎn)蛋白酶的熱穩(wěn)定性解淀粉芽孢桿菌Z16所產(chǎn)蛋白酶的熱穩(wěn)定性如圖8所示，當(dāng)溫度分別為40℃和45℃時(shí)，保溫90 min后，菌株所產(chǎn)蛋白酶的活力分別為初始酶活力的87.9%和55.7%，當(dāng)溫度達(dá)到50℃及以上時(shí)，菌株所產(chǎn)蛋白酶活力隨時(shí)間的延長而快速降低。結(jié)合圖7可確定，解淀粉芽孢桿菌Z16所產(chǎn)蛋白酶的最適宜作用溫度為40～45℃。

圖8 解淀粉芽孢桿菌Z16所產(chǎn)中性蛋白酶的熱穩(wěn)定性Fig.8 The thermostability of protease produced by Bacillus amyloliquefaciens Z16

2.3.4 金屬離子對解淀粉芽孢桿菌Z16所產(chǎn)蛋白酶活力的影響 金屬離子對解淀粉芽孢桿菌Z16所產(chǎn)蛋白酶活力的影響如圖9所示，Mn2＋可以顯著提高菌株所產(chǎn)蛋白酶活力（較空白組提高46.5%）。這是因?yàn)榇蠖鄶?shù)微生物所產(chǎn)中性蛋白酶都是金屬蛋白酶，其活性中心常含有一個(gè)金屬離子如Zn2＋、Mn2＋、Mg2＋、Co2＋、Fe3＋、Cu2＋等。金屬蛋白酶中的金屬離子可被透析或者金屬螯合物所螯合而失活，而這一過程通常是可逆的，可通過重新加入金屬離子恢復(fù)部分或者全部蛋白酶活力[17]。

圖9 金屬離子對解淀粉芽孢桿菌Z16所產(chǎn)中性蛋白酶活力的影響Fig.9 The effect of metal icons on protease produced by Bacillus amyloliquefaciens Z16

3 結(jié)論

從三種分離源中初篩出23株H/C值較大、無油脂水解圈的菌株，并從中復(fù)篩出高產(chǎn)中性蛋白酶（＞2500.0 U/mL）、低產(chǎn)脂肪酶（＜0.150 U/mL）且耐中碳鏈脂肪酸的菌株3株（Z9、Z16、Z17），這3株菌株皆來源于樟樹籽仁油生產(chǎn)廢渣。其中，菌株Z16產(chǎn)中性蛋白酶活力最高，達(dá)到4536.5 U/mL，產(chǎn)脂肪酶活力很低，只有0.088 U/mL。通過形態(tài)學(xué)、生理生化特征及16S rDNA分子生物學(xué)鑒定，確定菌株Z16為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。解淀粉芽孢桿菌Z16所產(chǎn)蛋白酶為金屬蛋白酶、中性蛋白酶，Mn2＋為其激活劑，在50℃下的酶活力最高，其最適作用溫度為40～45℃、最適作用pH為7.0。

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Screening and identification of strains for aqueous enzymatic extraction of medium-chain triglycerides

XIAO Yan-jun1，ZENG Chen2，MA Mao-mao1，ZENG Zhe-ling1，3，*，YU Ping1，3，ZHONG Wei-min4
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China；2.School of Medicine，The First Medical College，Nanchang University，Nanchang 330031，China；3.School of Environmental and Chemical Engineering，Nanchang University，Nanchang 330031，China；4.Fuzhou Vocational Technical College，F(xiàn)uzhou 344106，China）

Strains which had ability of higher neutral protease and lower lipase production，resistance to mediumchain fatty acids，was the key to improve yield and quality of camphor tree seed kernel oil by aqueous enzymatic extraction technology.Strain Z16 was isolated from waste residue in camphor tree seed kernel oil by screening methods（camphor tree seed kernel plate for enrichment，skim milk and oil medium plate for primary screening，F(xiàn)olin phenol and camphor tree seed kernel oil medium shaking for re-screening）.The results showed that neutral protease and lipase production capability of Z16 were 4536.5 U/mL and 0.088 U/mL，respectively. Z16 was identified as Bacillus amyloliquefaciens by morphological，physiological and 16S rDNA.Bacillus amyloliquefaciens had maximum neutral protease activity at 50℃，and was activated by Mn2+.The optimum temperature and pH for neutral protease were 40～45℃and 7.0，respectively.

strains；screening；identification；medium-chain triglycerides；aqueous enzymatic extraction

TS201.3

A

1002-0306（2015）22-0173-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.028

2015－04－17

肖彥駿（1990-），男，在讀研究生，研究方向：應(yīng)用微生物學(xué)，E-mail：thinkreed@126.com。

*通訊作者：曾哲靈（1965-），男，博士，教授，研究方向：食物資源開發(fā)與生物質(zhì)轉(zhuǎn)化，E-mail：zlzhengjx@163.com。

國家國際科技合作專項(xiàng)項(xiàng)目（2011DFA32770）；江西省國際科技合作項(xiàng)目（20112BDH80004，20123BDH80011）；南昌市對外科技合作項(xiàng)目（211-DWHZ-SWYY-001）；江西省科技支持計(jì)劃重大項(xiàng)目（20143ACG70015）；江西省高等學(xué)校科技落地計(jì)劃項(xiàng)目（KJLD12012）；江西省教育廳產(chǎn)學(xué)研合作項(xiàng)目（GJJ11003）；江西省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（GJJ11003）。