酶改性大豆分離蛋白起泡性能的研究

計(jì)曉曼，馬傳國(guó)，王化林

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州450001）

酶改性大豆分離蛋白起泡性能的研究

計(jì)曉曼，馬傳國(guó)*，王化林

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州450001）

使用堿性蛋白酶對(duì)大豆分離蛋白進(jìn)行改性，以改善蛋白質(zhì)的起泡性能。探討酶水解過(guò)程中的酶解時(shí)間、酶解溫度、底物濃度、加酶量、pH對(duì)蛋白起泡能力和泡沫穩(wěn)定性的影響，在此基礎(chǔ)上通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定了堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白提高起泡能力的最優(yōu)水解條件：時(shí)間40 min、溫度50℃、底物濃度8%、加酶量0.04%、pH8，提高泡沫穩(wěn)定性最佳水解條件：時(shí)間30 min、溫度40℃、底物濃度6%、加酶量0.04%、pH9。測(cè)定上述條件下大豆分離蛋白的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性分別為217.50%和93.10%。改性前后蛋白質(zhì)起泡能力和泡沫穩(wěn)定性均有所改善，與未改性蛋白相比起泡能力和泡沫穩(wěn)定性分別提高了61.11%和20.38%。

堿性蛋白酶，大豆分離蛋白，起泡能力，泡沫穩(wěn)定性

大豆蛋白質(zhì)是人們常用的植物性蛋白，具有人體所需的8種必須氨基酸，同時(shí)能降低人體膽固醇含量[1]，是為數(shù)不多的可取代動(dòng)物性蛋白的大宗植物性蛋白[2]。近年來(lái)，大豆加工技術(shù)和水平不斷提高，良好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能性促進(jìn)了大豆蛋白的消費(fèi)[3]。大豆蛋白質(zhì)分子中含有兩親基團(tuán)，蛋白質(zhì)分散液在受到攪打時(shí)，大量氣體混入，蛋白質(zhì)分子能在水相中吸附至氣-液界面，降低表面張力，形成氣泡，使大豆蛋白具有起泡性能[4]。大豆蛋白的起泡性能包括起泡能力（foaming capacity）和泡沫穩(wěn)定性（foaming stability）。大豆蛋白質(zhì)的起泡性在食品的各個(gè)領(lǐng)域得到應(yīng)用，但仍存在一些缺陷不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)[5]。

改善蛋白質(zhì)起泡性能的方法有很多，最常用的是物理改性（加熱、高壓等）、化學(xué)改性（磷酸化、酯化等）和酶改性[6]。酶改性因其污染少、效率高得到廣泛應(yīng)用[7]。酶改性是利用蛋白酶的水解作用將蛋白質(zhì)分子內(nèi)切或外切成較小分子，增加蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間的交聯(lián)或特殊基團(tuán)的功能，從而改變蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)[8]。酶改性過(guò)程中蛋白質(zhì)被水解，能有效提高蛋白質(zhì)吸附至液面的能力[9]。

目前很多有關(guān)蛋白質(zhì)改性研究，但多數(shù)研究綜合考慮蛋白質(zhì)起泡能力和泡沫穩(wěn)定性，而對(duì)某些特定產(chǎn)品往往需要最佳的起泡能力或泡沫穩(wěn)定性，同時(shí)起泡能力和泡沫穩(wěn)定性之間通常是相反的，兩者受不同分子性質(zhì)影響[10]，同時(shí)考慮需要兩者的折中，不能最優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)對(duì)蛋白質(zhì)的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性分別進(jìn)行研究，通過(guò)堿性蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改性，分析改善蛋白質(zhì)起泡性的最優(yōu)方案，以期為食品工業(yè)利用高起泡性或高泡沫穩(wěn)定性改性蛋白質(zhì)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆分離蛋白 谷神生物科技集團(tuán)有限公司，蛋白含量89.8%；堿性蛋白酶 200000 U/g，西亞試劑；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 分析純。

FA-25高剪切分散乳化機(jī) 上海弗魯克有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白質(zhì)酶解反應(yīng) 稱取蛋白質(zhì)配成一定濃度，加入緩沖鹽調(diào)節(jié)一定pH，在80℃下預(yù)熱10 min，加入一定蛋白酶在一定溫度下反應(yīng)一定時(shí)間，反應(yīng)結(jié)束沸水浴滅活10 min，冷卻至室溫。

1.2.2 起泡性能測(cè)定 采用攪打后溶液泡沫體積衡量大豆蛋白的起泡性能。具體測(cè)定方法如下：將酶解液定容至1%（w/v），4000 r/min離心20 min。取酶解上清液20 mL于100 mL小燒杯中，攪打2 min，立即移入100 mL量筒中，分別記錄攪打停止時(shí)液面高度V1和30 min后液面高度V2。未水解蛋白質(zhì)直接制成1%溶液，測(cè)定方法同上[11]。

起泡能力（Foaming Capacity，F(xiàn)C）和泡沫穩(wěn)定性（Foaming Stability，F(xiàn)S）按如下公式計(jì)算：

1.2.3 酶解單因素考察 取不同酶解時(shí)間、酶解溫度、底物濃度、加酶量、pH為考察因素，以起泡能力、泡沫穩(wěn)定性為指標(biāo)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

酶解時(shí)間：選擇時(shí)間為20、30、40、50、60、70 min，在溫度60℃、底物濃度6%、加酶量0.16%、pH8條件下進(jìn)行酶解。

酶解溫度：選擇溫度為30、35、40、45、50、55、60、65℃，在時(shí)間30 min、底物濃度6%、加酶量0.16%、pH8條件下進(jìn)行酶解。

酶解底物濃度：選擇底物濃度為2%、4%、6%、8%、10%，在時(shí)間30 min、溫度45℃、加酶量0.16%、pH8條件下進(jìn)行酶解。

酶添加量：選擇酶添加量為0%、0.04%、0.08%、0.12%、0.16%、0.20%（w/v），在時(shí)間30min、溫度45℃、底物濃度6%、pH8條件下進(jìn)行酶解。

酶解pH：選擇pH6、7、8、9、10，在時(shí)間30 min、溫度45℃、底物濃度6%、加酶量0.08%條件下進(jìn)行酶解。

在單因素基礎(chǔ)上考察不同因素對(duì)起泡能力和泡沫穩(wěn)定性的影響，分別選取相對(duì)應(yīng)的影響趨勢(shì)較明顯的四個(gè)因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 酶解條件優(yōu)化

1.2.4.1 起泡能力的優(yōu)化 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)變化趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)pH對(duì)起泡能力影響趨勢(shì)最弱，以起泡能力為指標(biāo)，固定pH8，對(duì)酶解時(shí)間（A）、酶解溫度（B）、底物濃度（C）、酶添加量（D）進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)（表1）。

1.2.4.2 泡沫穩(wěn)定性的優(yōu)化 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)得到底物濃度對(duì)泡沫穩(wěn)定性影響趨勢(shì)最弱，選擇底物濃度為6%，對(duì)酶解時(shí)間（A）、酶解溫度（B）、酶添加量（C）、pH（D）進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)泡沫穩(wěn)定性進(jìn)行優(yōu)化（表2）。

表1 起泡能力正交實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 The factors and levels of foaming capacity orthogonal experimental design

表2 泡沫穩(wěn)定性正交實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 2 The factors and levels of foaming stability orthogonal experimental design

2 結(jié)果與討論

2.1 未酶解蛋白質(zhì)起泡性能測(cè)定

對(duì)原料蛋白質(zhì)溶液的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定，分別為135.00%、77.34%。

2.2 酶解時(shí)間對(duì)起泡性能的影響

圖1 酶解時(shí)間對(duì)起泡性能的影響Fig.1 Effect of time on foaming property

由圖1可知，隨著酶解時(shí)間增加，蛋白質(zhì)的起泡性能有所改變。起泡能力在20～40 min內(nèi)變化較明顯，之后趨于平緩，在30 min時(shí)達(dá)到最大，說(shuō)明在30 min時(shí)蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的小分子肽能迅速在界面展開(kāi)。泡沫穩(wěn)定性在前30～50 min內(nèi)變化明顯，在40 min達(dá)到最大，說(shuō)明在此區(qū)域水解產(chǎn)生的蛋白肽分子量最為適宜[12]。

2.3 酶解溫度對(duì)起泡性能的影響

由圖2可知，蛋白質(zhì)的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性均在45℃左右達(dá)到最大。這可能由于溫度過(guò)高時(shí)不利于酶的水解，而一定程度的水解使蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露，增加其吸附至界面的能力。同時(shí)45℃酶解液產(chǎn)生的泡沫時(shí)，粘度較其他酶解液大，這對(duì)泡沫穩(wěn)定性有利[13]。

2.4 底物濃度對(duì)起泡性能的影響

由圖3可知，隨著底物濃度的增加，蛋白質(zhì)的起泡能力變化較明顯，而泡沫穩(wěn)定性在6%以后趨于平緩。這可能與蛋白質(zhì)與酶結(jié)合存在最佳比例有關(guān)，一定范圍內(nèi)增加底物濃度能促進(jìn)酶解，當(dāng)兩者充分結(jié)合后，底物濃度繼續(xù)增加反而不利于水解。一定濃度蛋白質(zhì)能增加界面張力，同時(shí)分子間形成膠束防止聚集沉淀，增加起泡性能[11]。

圖2 酶解溫度對(duì)起泡性能的影響Fig.2 Effect of temperature on foaming property

圖3 底物濃度對(duì)起泡性能的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on foaming property

2.5 加酶量對(duì)起泡性能的影響

圖4 加酶量對(duì)起泡性能的影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on foaming property

由圖4可知，蛋白質(zhì)的起泡能力隨加酶量增加先增加后平緩，泡沫穩(wěn)定性先增加后降低。隨著加酶量增加，更有利于生成促進(jìn)起泡性能的小分子量產(chǎn)物，但加酶量超過(guò)一定限度會(huì)造成過(guò)度水解?？梢?jiàn)加酶量在0.08%時(shí)，產(chǎn)生的分子量大小最適宜。

2.6 pH對(duì)起泡性能的影響

由圖5可知，隨著pH增加蛋白質(zhì)的起泡能力變化不大，而泡沫穩(wěn)定性在pH7～9之間增加顯著。這主要與酶的最適pH有關(guān)，pH變化影響分子構(gòu)象和酶、底物的解離狀態(tài)，一方面影響兩者的相互作用，一方面改變蛋白質(zhì)分子的柔性，從而對(duì)蛋白質(zhì)的起泡性能造成影響。還可能是在pH9環(huán)境下水解產(chǎn)物更不易聚集沉降，從而增大了泡沫穩(wěn)定性[14]。

圖5 pH對(duì)起泡性能的影響Fig.5 Effect of pH on foaming property

2.7 正交實(shí)驗(yàn)

2.7.1 起泡能力的優(yōu)化 結(jié)果見(jiàn)表3。根據(jù)R值可知，對(duì)蛋白質(zhì)起泡能力影響大小排序?yàn)锽溫度＞C底物濃度=D加酶量＞A時(shí)間。由k值可得最優(yōu)組合為A2B3C3D1或者A3B3C3D1，因A2A3的起泡能力相差甚小，且從經(jīng)濟(jì)角度出發(fā)，最終確定為A2B3C3D1，即時(shí)間40 min，溫度50℃，底物濃度8%，加酶量0.04%，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明大豆分離蛋白的起泡能力可達(dá)217.50%。

表3 起泡能力正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of foaming capacity orthogonal experiment

2.7.2 泡沫穩(wěn)定性的優(yōu)化 由表4可知，對(duì)蛋白質(zhì)起泡能力影響大小排序?yàn)锽溫度＞A時(shí)間＞D pH＞C加酶量，最優(yōu)組合為：A1B1C1D3，即時(shí)間30 min，溫度40℃，加酶量0.04%，pH9，測(cè)定此條件下大豆分離蛋白的泡沫穩(wěn)定性為93.1%。

3 結(jié)論

本文使用堿性蛋白酶對(duì)大豆分離蛋白進(jìn)行水解，單因素實(shí)驗(yàn)顯示通過(guò)水解其起泡能力和泡沫穩(wěn)定性均得到改善。在單因素基礎(chǔ)上，選取對(duì)起泡能力、泡沫穩(wěn)定性影響明顯的四個(gè)因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，得到起泡能力在時(shí)間40 min、溫度50℃、底物濃度8%、加酶量0.04%、pH8條件下達(dá)到最優(yōu)，而泡沫穩(wěn)定性在時(shí)間30 min、溫度40℃、底物濃度6%、加酶量0.04%、pH9條件下達(dá)到最優(yōu)。改性前大豆蛋白的起泡能力為135.00%，泡沫穩(wěn)定性為77.34%；改性后大豆蛋白的起泡能力為217.50%，泡沫穩(wěn)定性為93.10%。

表4 泡沫穩(wěn)定性正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 The results of foaming stability orthogonal experiment

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Study on foaming property of enzyme modified soy protein isolated

JI Xiao-man，MA Chuan-guo*，WANG Hua-lin
（College of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China）

In this paper，the effect of the foaming property of soybean protein isolated was improved by using the alkali protease to hydrolysis protein.And several influencing factors were discussed in this paper，such as reaction time，temperature，substrate concentration，enzyme dosage，and pH value.Then by the orthogonal design method the optimal conditions of alkali protease hydrolysis soybean protein isolated to improve foaming property was：time 40 min，temperature 50℃，substrate concentration 8%，enzyme dosage 0.04%（w/v），pH8. The optimal hydrolysis conditions to improve the foaming stability was：time 30 min，temperature 40℃，substrate concentration 12%，enzyme dosage 0.04%（w/v），pH9.The foaming capacity（217.50%）and foaming stability（93.10%）of modified soybean protein isolated was improved in this study.The foaming capacity and the stability was increased by 61.11%and 20.38%respectively than the raw material of soybean protein.

alcalase；soybean protein isolated；foaming capacity；foaming stability

TS252

A

1002-0306（2015）22-0164-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.026

2015－02－02

計(jì)曉曼（1990-），女，碩士，研究方向：油脂蛋白品質(zhì)分析，E-mail：jixiaoman0222@163.com。

*通訊作者：馬傳國(guó)（1966-），男，博士，教授，研究方向：脂質(zhì)化學(xué)品質(zhì)研究，E-mail：mcg66@163.com。

國(guó)家863項(xiàng)目（2013AA102208）。