杏鮑菇乙醇提取物的抗氧化活性及成分分離鑒定

姜萬舟，高 平，楊明德，王 勤，張新宇，闞 娟，劉 俊，金昌海，*

（1.揚州大學食品科學與工程學院，江蘇揚州225127；2.浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，浙江杭州310058）

杏鮑菇乙醇提取物的抗氧化活性及成分分離鑒定

姜萬舟1，2，高 平1，楊明德1，王 勤1，張新宇1，闞 娟1，劉 俊1，金昌海1，*

（1.揚州大學食品科學與工程學院，江蘇揚州225127；2.浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，浙江杭州310058）

以杏鮑菇為原料，通過70%乙醇提取可溶性物質，通過體外抗氧化實驗研究其乙醇提取物的抗氧化活性，通過高效液相色譜質譜聯用技術（LC-MS）分析乙醇提取物的一些生物活性成分。對杏鮑菇乙醇提取物的成分分析表明，杏鮑菇乙醇提取物中蛋白質含量為2.41 mg/g（DW），總糖含量為25.46 mg/g（DW），多酚含量為12.03 mg/g（DW），黃酮含量為1.53 mg/g（DW）。體外抗氧化實驗表明，杏鮑菇乙醇提取物對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·）、羥自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-）都具有一定的清除能力。結果表明隨著杏鮑菇乙醇提取物的濃度增大，抗氧化活性也增加。杏鮑菇乙醇提取物清除自由基能力的大小順序為：·OH＞DPPH·＞O2-，而且杏鮑菇乙醇提取物對脂質過氧化具有明顯的抑制作用。利用HPLC對多酚類物質進行了分析，其中含有原兒茶酸和黃岑素，利用LC-MS進一步對多酚類物質進行分析，證實其中含有：奎寧酸、沒食子酸、原兒茶素、香豆酸和肉桂酸。

杏鮑菇，乙醇提取物，抗氧化活性，酚類化合物

杏鮑菇（Pleurotus eryngii）又名刺芹側耳，屬口蘑科側耳屬，具有菌肉肥厚、營養(yǎng)豐富、質地脆嫩、口感極佳的特點，其子實體色澤雪白，質地脆嫩，是集食用、藥用、食療于一體的食用菌新品種，被譽為“菇中之王”。據文獻報道[1]，杏鮑菇富含蛋白質、總糖、膳食纖維，而且還含有銅、鐵、錳、鋅、鈣等大量對人體有益的礦物質及微量元素。對杏鮑菇藥用功效的研究表明，杏鮑菇具有降血脂、降膽固醇、增強機體免疫力、抗氧化和抗腫瘤的作用。另外，國內外對杏鮑菇研究主要集中于多糖、胞外酶等[2]，而對于杏鮑菇乙醇提取物的抗氧化性研究未見報道。隨著對食品安全性意識的增高，人們越來越重視天然抗氧化劑。而且，我國杏鮑菇的產量非常大，大部分用于國內外的直接銷售，對杏鮑菇的深加工的研究較少。因此，本實驗以杏鮑菇為原料，從中提取乙醇提取物，對其成分進行分離鑒定，用HPLC及LC-MS法對多酚類物質進行鑒定，并進行體外抗氧化實驗。為我國杏鮑菇產業(yè)的發(fā)展和其在抗氧化功能性食品方面的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杏鮑菇 購買于揚州市超市；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸（TCA）、三氯化鐵、抗壞血酸、氫氧化鈉、硫代巴比妥酸（TBA）、鄰苯三酚、Tris、鹽酸、無水乙醇、硝酸鋁、1，1-二苯基-2-苦味肼基自由基（DPPH） 均為分析純；磷酸、葡萄糖、濃硫酸、苯酚、冰乙酸、牛血清蛋白 生工生物工程（上海）有限公司，均為分析純；甲醇、甲酸、沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、綠原酸、對羥基苯甲酸、咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、肉桂酸、黃岑素 上海源葉生物科技有限公司，均為色譜純。

ULT1386-3-V型超低溫冰箱 美國REVCO公司；HH-6型數顯恒溫水浴 國華電器有限公司；RE-5299型旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司；BS210S型電子天平 北京賽多利斯天平有限公司；ALPHA 1-2LD PLUS凍干機 德國Marin Christ公司；UV-7504紫外可見分光光度計 上海欣亮儀器有限公司；LC-20AT型高效液相色譜儀 日本島津公司；質譜儀（LCQ Deca Xp MAX） 美國Thermo Fisher公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料預處理 剔除損傷個體，然后洗凈切碎，用液氮冷凍，放在-75℃的冰箱中備用。之后用冷凍干燥機將杏鮑菇冷凍干燥，然后用萬能粉碎機將杏鮑菇磨成粉末，放入裝樣瓶中，放在干燥器中備用。

1.2.2 杏鮑菇乙醇提取物的制備 參照Liu等[3]方法，稱取杏鮑菇干粉5 g，加入400 mL 70%乙醇，充入氮氣，迅速密封，在60℃水浴鍋中避光磁力攪拌提取4 h，抽濾，35℃、90 r/min旋轉蒸發(fā)，至溶液體積為20 mL左右為止，冷卻至室溫后放入-75℃超低溫冰箱中預凍，冷凍干燥得杏鮑菇乙醇提取物。

1.2.3 杏鮑菇乙醇提取物各成分分析

1.2.3.1 蛋白質含量的測定 蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍法，參照Bradford[4]的方法。

1.2.3.2 總糖含量的測定 總糖含量的測定采用苯酚-硫酸法，參照Dubois等[5]的方法。

1.2.3.3 總酚含量測定 總酚含量測定采用Folin-Ciocalteu比色法，參照Prior[6]的實驗方法。

1.2.3.4 總黃酮含量的測定 總黃酮含量的測定采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法，參照郭亞建[7]的方法。

1.2.4 杏鮑菇乙醇提取物體外抗氧化活性的研究

1.2.4.1 DPPH自由基清除率的測定 測定參考Begona[8]方法。以VC作為對照。實驗重復三次。按照下式計算DPPH·自由基的清除率。

清除率（%）=[l-（Ai-Aj）/Ac]×100

式中：Ai為DPPH·乙醇溶液和試樣液混合后測定的吸光度；Aj為試樣液和無水乙醇混合后測定的吸光度；Ac為DPPH·乙醇溶液和無水乙醇混合后測定的吸光度。

1.2.4.2 還原力的測定 還原力的測定參照Oyaizu等[9]的方法。以VC作為對照。實驗重復三次。

1.2.4.3 超氧陰離子自由基清除率的測定 測定參照陳靈然等[10]方法。以VC作為對照，實驗重復三次。按照下式計算超氧陰離子自由基的清除率。

清除率（%）=[A0－（A1－A2）]/A0×100

式中：A0為蒸餾水代替受試物，在325 nm下測定的吸光度；A1為實驗組在325 nm下測定的吸光度；A2為蒸餾水代替鄰苯三酚作為空白組，在325 nm測定的吸光度。

1.2.4.4 羥基自由基清除率的測定 測定參照Smirnoff等[11]水楊酸法。以VC作為對照，實驗重復三次。按照下式計算不同濃度受試物對羥基自由基的清除率。

清除率=[A0-（A1-A2）]/A0×100

式中：A0為蒸餾水代替受試物，在510 nm下測定的吸光度；A1為實驗組在510 nm下測定的吸光度；A2為蒸餾水代替過氧化氫作為空白組，在510 nm測定的吸光度。

1.2.4.5 脂質過氧化抑制率的測定 抗脂質過氧化的測定主要參考Halliwell等[12]的方法。以VC作為對照，實驗重復三次。根據以下公式計算受試物對脂質過氧化的抑制率。

抑制率（%）=[1－（A1－A2）/A0]×100

式中：A0為以蒸餾水代替受試物，在532 nm處測定的吸光度；A1為實驗組在532 nm下測定的吸光度；A2為以蒸餾水代替TBA溶液，在532 nm處測定的吸光度。

1.2.5 杏鮑菇乙醇提取物中多酚類物質HPLC和LC-MS的分離鑒定

1.2.5.1 HPLC分離鑒定杏鮑菇提取物中多酚類物質

參照Palacios等[13]方法改進。高效液相色譜的條件：色譜柱：Inertsil ODS-SP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），檢測器：SPD-20A UV-Vis紫外檢測器，流動相：A：0.1%甲酸；B：甲醇。洗脫梯度：0～2 min，15%B；2～10 min，30%B；10～11 min，50%B；11～15 min，50% B；15～16 min，70%B；16～25 min，70%B；25～26 min，80%B；26～30 min，80%B；30～35 min，100%B。柱溫：30℃，進樣體積：10 μL，流速：1 mL/min，檢測波長：280 nm。

1.2.5.2 LC-MS分離鑒定杏鮑菇乙醇提取物中多酚類物質 質譜條件：離子源：ESI＋安捷倫噴射，氣體溫度：300℃，氣體流速：10 L/min，噴霧器：15 psi，外殼氣體溫度：250℃，外殼氣體流速：7 L/min，毛細管電壓：4000 V，噴霧電壓：500 V。

2 結果與分析

2.1 杏鮑菇乙醇提取物中營養(yǎng)成分含量

圖1 杏鮑菇乙醇提取物中各活性物質的含量Fig.1 The content of various active substances in ethanol extract of Pleurotus eryngii

由圖1可知，杏鮑菇乙醇提取物中蛋白質、總糖、多酚和黃酮的含量分別為2.41、25.46、12.03、1.53 mg/g（DW），占杏鮑菇干重比例分別為：0.06%、0.61%、0.29%和0.04%。且由圖1可知，杏鮑菇乙醇提取物中總糖和多酚的含量較高。

2.2 杏鮑菇乙醇提取物對DPPH自由基清除率的影響

圖2 杏鮑菇乙醇提取物對DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effect of ethanol extract of Pleurotus eryngii on DPPH scavenging

杏鮑菇乙醇提取物對DPPH自由基清除率測定結果如圖2所示，由圖2可知，隨著提取物濃度的升高，其對DPPH自由基清除能力也升高，不同濃度之間存在顯著性差異（p＜0.05）。當提取物的濃度低于0.5 mg/mL時，杏鮑菇提取物清除DPPH自由基的能力比較低。濃度為4.0 mg/mL時，提取物對DPPH自由基的清除率為63%。結果表明，杏鮑菇乙醇提取物對DPPH自由基具有一定的清除能力。Prasad等[14]和Zhao等[15]研究表明酚類物質和黃酮類物質能減少DPPH自由基，這與其供氫能力有關。本研究中杏鮑菇乙醇提取物對DPPH自由基的清除能力與酚類物質密切相關。

2.3 杏鮑菇乙醇提取物對還原力的影響

圖3 不同濃度杏鮑菇乙醇提取物還原力大小Fig.3 Effect of ethanol extract of Pleurotus eryngii on reducing power

鐵氰化鉀（K3Fe（CN）6）與抗氧化劑反應，被還原成亞鐵氰化鉀（Fe4（CN）6），Fe3＋與亞鐵氰化鉀發(fā)生反應，生成普魯士藍，該物質在700 nm處有強吸收峰，從而通過吸光值測定其還原力。還原力與抗氧化能力成正比，吸光度值越大，說明抗氧化劑的還原力越強。杏鮑菇乙醇提取物還原力測定結果如圖3所示，由圖3可知，隨著提取物濃度的增大，還原力增加。尤其當提取物的濃度小于1.0 mg/mL時，提取物還原力較小，當濃度為1.0 mg/mL時，其還原力有所增加，濃度為4.0 mg/mL時，其還原力顯著（p＜0.05）增加。表明隨著提取物濃度增加，其抗氧化能力增加。

2.4 杏鮑菇乙醇提取物對超氧陰離子清除率的影響

圖4 不同濃度杏鮑菇乙醇提取物對超氧陰離子自由基清除率的影響Fig.4 Effect of ethanol extract of Pleurotus eryngii on O2-·scavenging

乙醇提取物對超氧陰離子清除率測定結果如圖4所示，由圖4可知，隨著濃度的增加，清除超氧陰離子的能力增加。當杏鮑菇提取物的濃度為0.5 mg/mL時，其清除超氧陰離子能力在25.33%，當濃度為2.0 mg/mL時，清除率為36.21%，當濃度為4.0 mg/mL時，清除率為45.01%。杏鮑菇乙醇提取物對超氧陰離子具有一定的清除能力。這與乙醇提取物中抗氧化成分密切相關。

2.5 杏鮑菇乙醇提取物對羥基自由基（·OH）清除率的影響

圖5 杏鮑菇乙醇提取物對羥基自由基清除率的影響Fig.5 Effect of ethanol extract of Pleurotus eryngii on ·OH scavenging

·OH是目前發(fā)現的活性最高的自由基團，可以跟大部分生物大分子發(fā)生反應，破壞細胞內代謝平衡。清除·OH能夠有效的減少機體損傷。乙醇提取物對羥基自由基清除率測定結果如圖5所示，由圖5可知，隨著杏鮑菇乙醇提取物濃度的增加，清除羥基自由基的能力也隨之增加。當濃度為0.25 mg/mL時，羥基自由基的清除率為32.67%，隨著濃度的增加，清除率明顯增加，差異性顯著。當杏鮑菇提取物濃度大于2.0 mg/mL時，對羥基自由基（·OH）清除率與VC相接近。表明杏鮑菇乙醇提取物對·OH具有很強的清除作用，這與馬齒莧70%的乙醇提取物[16]、蛇鞭菊乙醇提取物[17]、穿心蓮乙醇提取物[18]都具有相似的抗氧化活性，對羥基自由基具有一定清除能力結果相一致。

2.6 杏鮑菇乙醇提取物對脂質過氧化抑制率的影響

圖6 不同濃度的杏鮑菇乙醇提取物對脂質過氧化抑制率的影響Fig.6 Effect of ethanol extract of Pleurotus eryngii on lipid peroxidation inhibition ratio

乙醇提取物對脂質過氧化抑制率測定結果如圖6所示，當杏鮑菇提取物的濃度為0.25 mg/mL時，脂質過氧化抑制率僅為8.01%，抑制率較低，但隨著濃度的增加，其對脂質過氧化的抑制率明顯增加，且不同濃度間差異性顯著（p＜0.05）。

2.7 杏鮑菇乙醇提取物的高效液相色譜法分離鑒定

混合標準品的高效液相色譜圖如圖7，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11所對應的峰分別是沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、綠原酸、對羥基苯甲酸、咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、奎寧酸、肉桂酸和黃岑素。

圖7 酚類物質混合標準品的高效液相色譜圖Fig.7 High-performance liquid chromatogram of the mixed standard samples

圖8 杏鮑菇多酚的高效液相色譜圖Fig.8 High-performance liquid chromatogram of Pleurotus eryngii polyphenols

杏鮑菇多酚的高效液相色譜圖如圖8所示，a、b對應的峰分別是原兒茶酸和肉桂酸。

2.8 杏鮑菇乙醇提取物的LC-MS法分離鑒定

圖9 酚類物質混合標準品的質譜圖Fig.9 The mass spectrum of the mixed standard samples

混合標準品的質譜分析結果如圖9所示，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11對應的峰分別是奎寧酸、沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、綠原酸、對羥基苯甲酸、咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、肉桂酸和黃岑素。

杏鮑菇多酚的質譜分析結果如圖10所示，a、b、c、d和e對應的峰分別是奎寧酸、沒食子酸、原兒茶酸、對香豆酸和肉桂酸。

3 結論

判定抗氧化活性需要多體系評價。本實驗中測定了還原力、DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率、超氧陰離子清除率和脂質過氧化抑制率評價杏鮑菇乙醇提取物的抗氧化活性。在體外抗氧化實驗中，杏鮑菇乙醇提取物具有很強的抗氧化活性，對DPPH·、·OH、O2-·都具有一定的清除能力，且杏鮑菇乙醇提取物對自由基清除能力的大小依次為：·OH＞DPPH·＞O2-·。而且杏鮑菇乙醇提取物具有一定的還原能力和抗脂質過氧化的能力，但杏鮑菇乙醇提取物的還原力不強，而對脂質過氧化抑制率較強。另外，隨著杏鮑菇乙醇提取物的濃度的增加，其抗氧化的能力也逐漸增加。用HPLC法分離鑒定對乙醇提取物中多酚進行測定，其中可能含有原兒茶酸和肉桂酸，用LC-MS法對杏鮑菇乙醇提取物多酚進一步證實其中含有奎寧酸、沒食子酸、原兒茶素、對香豆酸和肉桂酸。

圖10 杏鮑菇多酚的質譜圖Fig.10 The mass spectrum of the Pleurotus eryngii polyphenols

本研究中杏鮑菇70%乙醇提取物中多酚含量為12.03 mg/g（DW）。國內外學者對植物中抗氧化活性與總酚之間的關系進行大量的研究，結果表明，大多數植物提取物中抗氧化活性跟酚物質含量有關[18-19]。植物多酚能抑制各種酶反應產生的超氧陰離子自由基[20]，同時植物中多酚的含量也代表其具有抗氧化活性的大小[21]。本研究證實杏鮑菇乙醇提取物在較高濃度下具有較強的抗氧化活性，且杏鮑菇乙醇提取物抗氧化活性與多酚密切相關，具有替代抗氧化劑的潛質。

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Antioxidant activity and component identification of ethanol extract of Pleurotus eryngii

JIANG Wan-zhou1，2，GAO Ping1，YANG Ming-de1，WANG Qin1，ZHANG Xin-yu1，KAN Juan1，LIU Jun1，JIN Chang-hai1，*
（1.College of Food Science and Engineering，Yangzhou University，Yangzhou 225127，China；2.Zhejiang University，College of Biosystems Engineering and Food Science，Hangzhou 310058，China）

The antioxidant activities of ethanolic extract from Pleurotus eryngii were evaluated by various methods in vitro.Some bioactive components of ethanolic extract were analysed by high performance liquid chromatography mass spectrometry（LC-MS）.In the ethanol extract of Pleurotus eryngii，the protein content was 2.41 mg/g（DW），the polysaccharide content was 25.46 mg/g（DW），polyphenol content was 12.03 mg/g（DW）and the flavonoids content was 1.53 mg/g（DW）.In antioxidant assays in vitro，ethanolic extract of Pleurotus eryngii was found to have strong reducing power，superoxide radical，hydroxyl radical and 2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical scavenging activity.The results also showed that with the concentration of ethanol extract of Pleurotus eryngii increased，the antioxidant activity also increased.Free radical scavenging capacity of ethanolic extracts from Pleurotus eryngii was：·OH＞DPPH·＞O2-，and the ethanol extract of Pleurotus eryngii had a certain ability of reducing ability and anti lipid peroxidation.The main phenolic compounds in ethanolic extract analyzed by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry were quinic acid，gallic acid，catechin，and p-coumaric acid and cinnamic acid.

Pleurotus eryngii；ethanol extract；antioxidant acitivity；phenolic compound

TS255.1

A

1002-0306（2015）22-0087-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.009

2015－04－14

姜萬舟（1991-），男，在讀碩士研究生，研究方向：現代調理食品的研究與開發(fā)，E-mial：1245156981@qq.com。

*通訊作者：金昌海（1963-），男，博士，教授，研究方向：農產品加工與貯藏，E-mial：chjin@yzu.edu.cn。

江蘇省科技計劃項目（BC2013408）；教育部大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201311117021）；江蘇省大學生實踐創(chuàng)新訓練計劃立項項目（201311117021Z）。