SPE-UPLC法測(cè)定豆芽中6-芐基腺嘌呤含量及其殘留動(dòng)態(tài)

劉雨思，王 波，閆 衡，劉倩倩，王彥淳，周 圍，*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)中心，甘肅蘭州730020）

SPE-UPLC法測(cè)定豆芽中6-芐基腺嘌呤含量及其殘留動(dòng)態(tài)

劉雨思1，王 波2，閆 衡1，劉倩倩2，王彥淳1，周 圍2，*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)中心，甘肅蘭州730020）

采用固相萃取超高效液相色譜法，建立豆芽中生長(zhǎng)激素6-芐基腺嘌呤（6-BA）殘留量的檢測(cè)方法，并對(duì)不同貯存條件及貯存時(shí)間下豆芽中6-BA含量的變化進(jìn)行動(dòng)態(tài)研究。選用DIONEX Acclaim C16（4.6 mm×150 mm，3 μm）色譜柱，流動(dòng)相采用甲醇、乙酸銨水溶液，流速為1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm。結(jié)果表明，該方法回收率為87.4%～90.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.46%～0.60%，方法檢出限為0.01 mg·kg-1，6-BA的線性范圍為0.05～50 mg·kg-1。該方法簡(jiǎn)單、快速，可實(shí)現(xiàn)對(duì)植物生長(zhǎng)激素6-BA的準(zhǔn)確定量。動(dòng)態(tài)研究結(jié)果表明，豆芽中6-BA的含量會(huì)隨時(shí)間的增加而降低，凍藏和冷藏方式下，最小半衰期分別為1.642 d和3.108 d。

超高效液相色譜，6-BA，豆芽，殘留動(dòng)態(tài)

豆芽因其富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、鈣、維生素且口感極佳，為廣大消費(fèi)者所喜愛，市場(chǎng)需求量極大[1]。6-芐基腺嘌呤（6-henzylaminopurine，6-BA）是一種人工合成的植物生長(zhǎng)激素[2]，具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育的作用[3]，能夠明顯提高果品及葉片的品質(zhì)[4]，因此被廣泛應(yīng)用于蔬菜生產(chǎn)中。但是，6-BA作為一種生長(zhǎng)激素，具有一定毒性，人體過多攝入會(huì)刺激皮膚、黏膜，造成食道、胃黏膜損傷，出現(xiàn)惡心、嘔吐等現(xiàn)象[5-6]。

目前，豆芽因沒有相關(guān)的國(guó)家檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，所以關(guān)于6-BA在豆芽生產(chǎn)中的使用存在爭(zhēng)議。此前，6-BA被認(rèn)為是非法添加物，不得在食品生產(chǎn)加工添加使用[7]。但是，對(duì)6-BA的進(jìn)一步研究結(jié)果表明，低劑量6-BA的攝入對(duì)人體不會(huì)造成任何危害[8]。故而2014年11月6日，《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)-豆芽》（草稿）明確將6-BA定性為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，允許其在豆芽生產(chǎn)中使用，限定含量為不得超過0.2 mg·kg-1[9-14]。然而，對(duì)6-BA的檢測(cè)存在眾多難點(diǎn)。由于6-BA在植物中會(huì)發(fā)生降解現(xiàn)象，殘留的6-BA含量較少，且豆芽中含有大量雜質(zhì)干擾目標(biāo)物[15]，使檢測(cè)及準(zhǔn)確定量其殘留量增加了難度，極易造成誤判甚至錯(cuò)判，為豆芽帶來安全隱患，而目前相關(guān)的研究較少。目前，檢測(cè)6-BA含量的方法主要有HPLC法[16-18]、GC/MS法[19-20]和液質(zhì)聯(lián)用法[21-26]，但因其靈敏度低、準(zhǔn)確度差、分析時(shí)間長(zhǎng)，難以滿足大批量的檢測(cè)要求。

本實(shí)驗(yàn)選用Waters Oasis HLB小柱進(jìn)行固相萃取[27-28]，對(duì)6-BA進(jìn)行富集凈化，采用UPLC法對(duì)6-BA在豆芽中的降解情況進(jìn)行研究，并通過LC-MS進(jìn)行定性分析。為6-BA的檢測(cè)提供了一種快速有效的方法，并為相關(guān)機(jī)構(gòu)制定豆芽中6-BA殘留限量標(biāo)準(zhǔn)提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

6-芐基腺嘌呤 純度98%，購(gòu)自美國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；乙酸銨 色譜純，購(gòu)自德國(guó)CNW Technologies公司；甲醇 色譜純，購(gòu)自德國(guó)Mreck公司；蒸餾水 購(gòu)自中國(guó)廣州屈臣氏食品飲料有限公司；所用的豆芽空白樣品 綠豆芽，扁豆芽，黃豆芽，均來自實(shí)驗(yàn)室自發(fā)豆芽；檢測(cè)豆芽 購(gòu)買于蘭州各地蔬菜市場(chǎng)及大型超市。

ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)安捷倫公司；Oasis HLB固相萃取柱 美國(guó)Waters公司；Sartorius BL610電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；3K30高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)SIGMA公司；T25BASIC均質(zhì)機(jī) 德國(guó)IKA公司；移液槍 美國(guó)Thermo Electron公司；50 mL聚乙烯管。

1.2 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)貯備液配制：精確稱取0.01 g（精確至0.0001 g）6-BA標(biāo)準(zhǔn)品，置于500 mL容量瓶中，用甲醇∶水（V/V=9∶1）混合液溶解后，充分搖勻，定容至刻度線，配制成20 mg·L-1的6-BA標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4℃冷藏保存待用。

標(biāo)準(zhǔn)工作儲(chǔ)備液配制：準(zhǔn)確轉(zhuǎn)移25、5、0.5、0.25、0.1、0.05、0.025 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別稀釋為50、10、1、0.5、0.2、0.1、0.05 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液，4℃冷藏待用。

1.3 檢測(cè)步驟

1.3.1 樣品提取 稱取搗碎混勻的豆芽樣品5.00 g（精確至0.01 g）于50 mL聚乙烯離心管中，加入15 mL甲醇水溶液（v/v=7∶3），用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)3 min，然后以13000 r·min-1離心10 min，取全部上清液并用蒸餾水定容至30 mL，待凈化[29]。

1.3.2 樣品凈化 固相萃取柱Oasis HLB（6 cc/200 mg，Waters，美國(guó)）按以下方法對(duì)樣品進(jìn)行富集凈化，過程如下：

活化：分別用5 mL甲醇，5 mL水活化固相萃取柱；上樣：提取液全部上柱，上樣流速控制在1 mL·min-1以內(nèi)；淋洗：5 mL水、5 mL甲醇水（v/v=1∶1）；洗脫：5 mL甲醇[30-32]。

將上述洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，準(zhǔn)確加入1 mL甲醇，漩渦振蕩1 min，用0.45 μm有機(jī)濾膜過膜，上機(jī)測(cè)定。

1.4 色譜條件

1.4.1 超高效液相色譜儀色譜條件 色譜柱：DIONEX Acclaim C16色譜柱（4.6 mm×150 mm，3 μm）；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：30℃；流動(dòng)相：A：甲醇，B：乙酸銨水溶液（30 mmol/L）。采用等度洗脫方式，洗脫程序：0～10 min，45%A。檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)265 nm[28]。

1.4.2 超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀色譜條件 色譜柱：Eclipse Plus C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，5 μm）；流速：0.2 mL·min-1；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：30℃；流動(dòng)相：A：甲醇，B：乙酸銨水溶液（30 mmol/L）。采用等度洗脫方式，洗脫程序：0～10 min，45%A。

1.5 質(zhì)譜檢測(cè)條件

離子源：電噴霧離子源（ESI＋）；采集方式：MRM；干燥氣溫度：300℃；干燥氣流量：7 L·min-1；鞘氣溫度：350℃；鞘氣流量：11 L·min-1；毛細(xì)管電壓：3.5 kV。質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)值見表1。

表1 6-BA質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)設(shè)定表Table 1 MRM parameters of 6-BA

1.6 空白樣品豆芽中6-BA的消解

在室溫25℃下，用自來水培養(yǎng)6 d后收獲，收獲后的豆芽分別以冷藏（5℃）和凍藏（-20℃）方式儲(chǔ)存，每天檢測(cè)豆芽中6-BA殘留量的變化，以消解動(dòng)態(tài)方程評(píng)價(jià)消解效果，消解動(dòng)態(tài)方程為C=C0e-kt，式中：C為生長(zhǎng)激素殘留量，mg·kg-1；C0為生長(zhǎng)激素初始濃度，mg·kg-1；k為降解速率常數(shù)，d-1；t為時(shí)間，d；當(dāng)C= 0.5×C0時(shí)，t為半衰期。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件選擇和優(yōu)化

圖1 6-BA標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig.1 Chromatogram of 6-BA standard

2.1.1 6-BA標(biāo)準(zhǔn)色譜圖 按“1.4.1超高效液相色譜儀色譜條件”所述方法測(cè)得6-BA的標(biāo)準(zhǔn)圖如圖1所示，6-BA添加量為10 mg·kg-1，出峰時(shí)間為7.6 min。

2.1.2 色譜柱選擇 首先選用MGⅢC18（3.0 mm I.D. ×100 mm，3 μm）色譜分析柱，C18色譜柱是以硅烷化鍵合型（Si-O-Si-C）存在的，實(shí)驗(yàn)所分析的目標(biāo)化物6-BA在該色譜柱上雖有很好的保留，但樣品中的雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)物存在較大的干擾（圖2A）。為了使目標(biāo)物更好的與雜質(zhì)分離，選用Acclaim?Polar Advantage C16（4.6 mm×150 mm，3 μm）色譜柱，C16柱對(duì)極性化合物具有出色的保留能力和分離度，與C18柱相比具有獨(dú)特的選擇性，疏水性比C18柱弱，實(shí)驗(yàn)證明目標(biāo)物在C16柱上保留效果好且峰形良好，有效避免了雜質(zhì)對(duì)6-BA在色譜柱上的干擾，從而滿足樣品分離的要求（圖2B）。

圖2 選用不同色譜柱的黃豆芽樣品和6-BA標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比圖Fig.2 Comparision of soybean sprouts characterized by twochromatographic columns

2.1.3 萃取溶劑選擇 甲醇是一種通用型提取溶劑，且能與水互溶，適合分析含水量較高的豆芽樣品。實(shí)驗(yàn)分別用酸化甲醇、甲醇∶水（V/V=7∶3）混合液和甲醇∶水（V/V=5∶5）混合液對(duì)樣品進(jìn)行提取對(duì)比。結(jié)果表明，三種提取溶劑對(duì)目標(biāo)化合物的提取均有較好的回收率，平均回收率均在90%以上，但酸化甲醇會(huì)提取更多的雜質(zhì)，干擾6-BA的檢測(cè)，因此不選用酸化甲醇。水相含量大雖然有利于樣品在固相萃取柱上的保留，但會(huì)增加水溶性雜質(zhì)的提取量，且有機(jī)相含量大目標(biāo)物提取率高，故選擇甲醇∶水（7∶3）混合液為提取溶劑，而不選擇甲醇∶水（5∶5）的混合液。

2.1.4 固相萃取柱的選擇 由于豆芽樣品種類繁多，成分復(fù)雜，干擾物較多，必須對(duì)樣品進(jìn)行凈化，本實(shí)驗(yàn)采用固相萃取技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行前處理。分別使用Waters Oasis?MAX柱和Waters Oasis?HLB固相萃取柱進(jìn)行凈化。6-BA極性較小，難溶于水，微溶于乙醇，可溶于酸、堿，在酸、堿條件下均穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)表明，樣品提取液過柱時(shí)，吸附劑為混合型陰離子交換填料的Oasis?MAX固相萃取柱不能對(duì)6-BA有較好的保留，無法進(jìn)行進(jìn)一步的分析。而使用固相萃取柱為親水親脂平衡聚合物的Waters Oasis?HLB柱，其填料為親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物，可以極好的保留中強(qiáng)極性的物質(zhì)，所以采用Waters Oasis?HLB固相萃取柱對(duì)樣品中6-BA進(jìn)行凈化、濃縮。

2.1.5 固相萃取條件優(yōu)化 在Waters Oasis?HLB固相萃取柱上，本實(shí)驗(yàn)中以甲醇∶水（7∶3）混合液作為提取液，采用甲醇水混合溶液進(jìn)行淋洗，目的在于增強(qiáng)6-BA與固定相的結(jié)合，同時(shí)除去不需要的組分和雜質(zhì)，并通過調(diào)節(jié)水中甲醇的不同濃度，最大可能的去除雜質(zhì)而不洗脫分析物。實(shí)驗(yàn)選取甲醇∶水（V/V）分別為5∶5、6∶4、7∶3的三種混合液作為淋洗液進(jìn)行優(yōu)化，最終以甲醇∶水（5∶5）混合液作為淋洗液。洗脫溶液的選擇目的在于使分析物完全洗脫，經(jīng)篩選實(shí)驗(yàn)確定以5 mL純甲醇溶液洗脫，回收率較好，除雜質(zhì)效果理想。故最終確定固相萃取條件為5 mL水，5 mL甲醇：水（5∶5）混合液淋洗，5 mL甲醇洗脫。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性范圍和檢出限 選取50、10、1、0.5、0.2、0.1、0.05 mg·L-1的6-BA標(biāo)準(zhǔn)工作液，按“1.4色譜條件”進(jìn)行測(cè)定，繪制樣品濃度（橫坐標(biāo)X，mg·L-1）與峰面積（縱坐標(biāo)Y，AU）標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸分析，且當(dāng)信噪比為3（S/N=3）時(shí)，該方法對(duì)6-BA的最低檢出限（LOD）為0.01 mg·L-1。分析結(jié)果，如表2所示。結(jié)果表明，該方法在0.05～50 mg·kg-1線性范圍內(nèi)，線性良好。

表2 線性范圍及檢出限Table 2 The linear range and limit of detection

表3 方法加標(biāo)回收率及精密度Table 3 The linear range and limit of detection

2.2.2 樣品加標(biāo)回收率和精密度 本實(shí)驗(yàn)中空白樣品均來自于實(shí)驗(yàn)室自發(fā)的黃豆芽、綠豆芽和扁豆芽。在豆芽的成熟期（6 d）后進(jìn)行樣品添加回收測(cè)定，分別取三種不同品種的空白豆芽樣品，每一個(gè)品種取3份，每份5.0 g，分別加入0.5、2.0、10 mg·kg-1的6-BA標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.3檢測(cè)步驟”進(jìn)行前處理操作后，按“1.4.1超高效液相色譜儀色譜條件”進(jìn)行測(cè)定，以濃度值計(jì)算加標(biāo)回收率，沒有基質(zhì)干擾。為得到測(cè)定方法的精密度，實(shí)驗(yàn)對(duì)每一添加濃度樣品重復(fù)測(cè)定9次。結(jié)果表明：6-BA的平均回收率在87.4%～90.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%）在0.46%～0.60%之間。方法的回收率和重現(xiàn)性均較好。所得結(jié)果見表3。

圖3 豆芽空白樣品及6-BA添加樣品對(duì)比圖Fig.3 Comparision chromatogram of blank sprouts’sample and 6-BA sprouts’sample

綜上所述，此方法回收率較高，且精密度良好，因此實(shí)驗(yàn)方法能滿足各個(gè)品種豆芽中6-BA殘留量的檢測(cè)要求。豆芽添加樣品及空白樣品檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示，三種空白樣品中均未檢測(cè)到6-BA，而添加樣品中檢測(cè)到的6-BA色譜峰不受豆芽中雜質(zhì)干擾，精密度較高，適用于豆芽樣品中6-BA的檢測(cè)。

2.3 6-BA在豆芽中的降解動(dòng)態(tài)

供試的三種不同品種的空白豆芽樣品均為實(shí)驗(yàn)室自發(fā)豆芽，統(tǒng)一在豆芽成熟期后，向三種空白豆芽樣品中添加濃度為10 mg·kg-1的6-BA，于添加后1～15 d內(nèi)每天檢測(cè)豆芽中6-BA的含量。圖4中A為冷藏（5℃）方式，B為凍藏（-20℃）方式，由圖4所見，在冷藏條件下6-BA在三種不同的豆芽品種中殘留量的變化為，0～4 d含量消解速率極快，4～12 d含量消解速率平緩；在凍藏條件下6-BA在三種不同的豆芽品種中殘留量的變化為，0～10 d含量消解速率極快，10～15 d含量消解速率平緩。

圖4 不同貯藏方式下6-BA的殘留動(dòng)態(tài)Fig.4 Dynamics of residues of 6-BA stored by different conditions注：A為冷藏條件下；B為凍藏條件下。

由表4可知，6-BA在凍藏方式下貯藏的黃豆芽、綠豆芽、扁豆芽中的原始沉積量分別為9.83、9.76、9.83 mg·kg-1，黃豆芽降解速度最快，綠豆芽次之，扁豆芽最慢，半衰期分別為3.108、3.349、3.675 d；6-BA在冷藏方式下貯藏的黃豆芽、綠豆芽、扁豆芽中的原始沉積量分別為9.79、9.59、9.91 mg·kg-1，黃豆芽降解速度最快，綠豆芽次之，扁豆芽最慢，半衰期分別為1.642、1.723、1.808 d。凍藏方式可以較好地減緩6-BA在豆芽中的降解速率。

表4 不同貯藏方式下6-BA的的殘留動(dòng)態(tài)（n=7）Table 4 Dynamics of residues of 6-BA stored by different conditions（n=7）

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)對(duì)各大型超市及蔬菜市場(chǎng)中30批豆芽進(jìn)行檢測(cè)，其中，黃豆芽、綠豆芽及扁豆芽分別在超市與蔬菜市場(chǎng)抽取5個(gè)樣品。檢測(cè)結(jié)果表明，在市場(chǎng)購(gòu)買的黃豆芽樣品及綠豆芽樣品中有兩批樣品檢出6-BA，含量分別為5.3 mg·kg-1和2.1 mg·kg-1。

2.5 陽性樣品驗(yàn)證

實(shí)驗(yàn)首先采用10 mg·kg-16-BA標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行MRM質(zhì)譜條件優(yōu)化，使用“1.5質(zhì)譜條件”對(duì)1 mg·kg-1標(biāo)準(zhǔn)品和三種不同種類的陽性樣品同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，陽性樣品中的目標(biāo)物質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)品中的目標(biāo)物質(zhì)出峰時(shí)間相同，離子豐度均相同（圖5），因此可以進(jìn)一步驗(yàn)證所測(cè)陽性樣品中的目標(biāo)物質(zhì)為所要檢測(cè)的6-BA。

3 結(jié)論

該方法在超高效液相色譜儀上，用離子色譜柱作為分離手段，對(duì)植物生長(zhǎng)激素6-BA進(jìn)行了很好的分離分析，操作簡(jiǎn)單快速，靈敏度高，檢出限較低，重現(xiàn)性好，此方法尚未見報(bào)道，是分析植物生長(zhǎng)中添加6-BA值得推廣的方法。本文還跟蹤研究了6-BA在豆芽中的降解過程，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，6-BA在豆芽中會(huì)在短時(shí)間內(nèi)大量消解，因此對(duì)豆芽中添加的6-BA殘留量進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，需要在抽樣后盡快進(jìn)行檢測(cè)，并注重抽樣樣品的保存方法，抽樣后立即凍藏保存，這樣能最真實(shí)有效的反映出6-BA在樣品中的殘留量。

圖5 6-BA標(biāo)準(zhǔn)與陽性樣品對(duì)比譜圖（MRM）Fig.5 Comparision spectra chromatogram of 6-BA standard andthe positive sample

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Determination of 6-BA and its residual dynamics in bean sprouts by SPE-UPLC

LIU Yu-si1，WANG Bo2，YAN Heng1，LIU Qian-qian2，WANG Yan-chun1，ZHOU Wei2，*
（1.College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.Central Laboratory of Technical Center of Gansu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Lanzhou 730020，China）

This study was aimed to set up a novel method to detect the residual content of 6-Benzylaminopurine（6-BA）of three kind of bean sprouts with the solid-phase extraction-ultra performance liquid chromatography and try to indicate the dynamic variation of content of 6-BA in bean sprout with different storage conditions and interval times.DIONEX Acclaim C16（4.6 mm×150 mm，3 μm）was used and the mobile phases were methanol and ammonium acetate，respectively，with a ratio of 45%methanol.Flow velocity was 1 mL·min-1and the detection wavelength was 265 nm.The results showed that spiked recoveries were 87.4%～90.0%.The relative standard deviation was 0.46%～0.60%.Detection limit and linear range of 6-Benzylaminopurine was about 0.01 mg·kg-1and 0.05～50 mg·kg-1respectively.The novel method was quite easy to use and could be used to detect accurately the content of 6-BA.The content of 6-BA showed the drop trend with the rise of storage time and the minimum half-life period was 1.642 and 3.108 d respectively under the conditions of frozen storage and cold storage.

SPE-UPLC；6-BA；bean sprouts；residual dynamics

TS201.1

A

1002-0306（2015）22-0061-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.004

2015－01－08

劉雨思（1988-），女，在讀碩士研究生，主要從事環(huán)境、食品藥品的分析與檢測(cè)方面的研究，E-mail：lys2931@126.com。

*通訊作者：周圍（1957-），男，博士，研究員，主要從事食品營(yíng)養(yǎng)及食品安全分析方面的研究，E-mail：zhouwei845@163.com。