高效液相色譜法測(cè)定三七地上部分維生素含量

劉 英，曲 媛，崔秀明

（昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，中藥質(zhì)量與資源利用滇澳聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650500）

分析檢測(cè)

高效液相色譜法測(cè)定三七地上部分維生素含量

劉 英，曲 媛，崔秀明*

（昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，中藥質(zhì)量與資源利用滇澳聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650500）

采用高效液相色譜法測(cè)定三七地上部分水溶性維生素以及脂溶性維生素的含量。三七莖葉中與三七花中各檢測(cè)出5種維生素，但種類(lèi)有所差異，兩者所檢測(cè)出維生素標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均達(dá)0.9990以上。三七莖葉與花中所檢測(cè)水溶性維生素均以葉酸含量為最高，平均含量分別為0.1291%，0.1910%～0.3163%；兩者均僅檢測(cè)出一種脂溶性維生素VK1，平均含量分別為0.0033%，0.0009%～0.0012%。本研究的方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，為三七地上部分新食品原料的開(kāi)發(fā)研究提供科學(xué)依據(jù)。

高效液相色譜法，三七地上部分，水溶性維生素，脂溶性維生素，含量測(cè)定

三七地上部分為五加科人參屬植物三七[Panax notoginseng（Burk）F.H.Chen]的干燥莖葉和花序，主產(chǎn)于我國(guó)云南和廣西[1]。大量藥理研究表明，三七地上部分中的有效成分具有抗炎、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗抑郁、抗腫瘤、延緩衰老、提高免疫力、活血化瘀、抗高血壓等作用[2-9]，在民間，三七莖葉、花均有作為茶葉、菜肴食用的歷史，許多企業(yè)也以其為原料加工成各種食品、飲料以及保健食品[10]，但《中華人民共和國(guó)食品衛(wèi)生法》的有關(guān)規(guī)定使三七地上部分的食用存在不合法的問(wèn)題。有研究[11]表明，三七地上部分包含豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括一般營(yíng)養(yǎng)元素粗蛋白、粗纖維、糖類(lèi)以及礦質(zhì)元素等，維生素（包括水溶性與脂溶性維生素）也是衡量營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)[12-14]。目前僅有少量報(bào)道[15]對(duì)三七地上部分的水溶性維生素進(jìn)行了含量測(cè)定，但僅局限在VC含量的測(cè)定，測(cè)定指標(biāo)單一。本研究采用高效液相色譜法對(duì)三七地上部分的10種水溶性與5種脂溶性維生素進(jìn)行含量測(cè)定，同時(shí)為三七地上部分新食品原料的開(kāi)發(fā)研究提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

對(duì)照品維生素C（編號(hào)：100425-201103，含量：100%）、維生素B1（編號(hào)：100390-200703，含量：99.9%）、維生素B3（編號(hào)：100434-201102，含量：99.9%）、維生素B6（編號(hào)：100116-200502，含量：98%）、煙酰胺（編號(hào)：100115-200703，含量：99.9%）、維生素B5（編號(hào)：100370-200301，含量：99.9%）、葉酸（編號(hào)：100074-201214，含量：89.7%）、生物素（編號(hào)：100291-201303，含量：99.6%）、維生素B12（編號(hào)：100248-201203，含量：90.2%）、維生素B2（編號(hào)：100369-201103，含量：99.1%）、維生素A（編號(hào)：100368-201301，含量≥95%）、維生素D2（編號(hào)：100155-201207，含量：99.9%）、維生素D3（編號(hào)：100061-201208，含量：99.8%）、維生素E（編號(hào)：100062-201110，含量：98%）、維生素K1（編號(hào)：100156-201205，含量：98%） 均購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)；超純水 來(lái)自?xún)?yōu)普系列超純水器；甲醇為色譜純，其他所有試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純；三七地上部分包括莖葉與花 2012年8～10月采集于云南省文山州與紅河州各地。

LC-20AB高效液相色譜儀 日本島津公司，包括在線脫氣機(jī)DGU-20A3R（C）、二元泵LC-20AB、自動(dòng)進(jìn)樣器SIL-20A、柱溫箱CTO-20A、檢測(cè)器SPD-20A；Thermo Scientific Hypersil GOLD C18色譜柱 美國(guó)Thermo Scientific公司，250 mm×4.6 mm，5 μm；UPT-I-20T優(yōu)普系列超純水器 成都超純科技有限公司；CP114電子天平 上海奧豪斯儀器有限公司；TD25-WS臺(tái)式低速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

1.2.1.1 水溶性維生素色譜條件 色譜柱：Thermo Scientific Hypersil Gold（4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相：0.05 mol/L KH2PO4溶液（pH=4.0）（A）-甲醇（B），進(jìn)行梯度洗脫：0 min 5%B，5 min 5%B，15 min 10%B，35 min 40%B；流速：1 mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm，進(jìn)樣量為10 μL。

1.2.1.2 脂溶性維生素色譜條件 色譜柱：Thermo Scientific Hypersil Gold（4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相：水（A）-乙腈（B），進(jìn)行線性洗脫：0 min 90%B，30 min 90%B，40 min 100%B；流速：1 mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：275 nm。進(jìn)樣量為10 μL。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備

1.2.2.1 水溶性維生素對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取水溶性維生素VC、VB1、VB3、VB6、煙酰胺、VB5、葉酸、生物素、VB12、VB2對(duì)照品，加水配制成每毫升各含VC、VB1、VB3、VB6、煙酰胺、VB5、VB2為3.52、3.01、0.62、1.03、0.61、2.38、0.19 mg的混合溶液，加乙醇配制成每毫升各含葉酸、生物素、VB12為0.43、0.49、6.78 mg的混合溶液，濃度分別為20、10、10、10、10、10、0.5 mmol/L和1、2、5 mmol/L的對(duì)照品溶液。

1.2.2.2 脂溶性維生素對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取脂溶性維生素A、D2、D3、K1對(duì)照品，加甲醇配制成每毫升各含維生素A、D2、D3為1.44、1.98、1.92 mg的混合溶液，加甲醇配制成每毫升含維生素K1為2.26 mg的混合溶液，濃度均為5 mmol/L的對(duì)照品溶液；精密吸取脂溶性維生素E對(duì)照品，加甲醇配制成每毫升含維生素E 2.16 mg的混合溶液，濃度均為5 mmol/L的對(duì)照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備

1.2.3.1 水溶性維生素提取 稱(chēng)量0.50 g三七莖葉/花粉末，加入4 mL 0.1 mol/L HCl研磨，超聲提取20 min，3500 r/min離心15 min，上清液定容至10 mL量瓶中，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾所得續(xù)濾液，作為供試品溶液[16]，進(jìn)樣量為20 μL。

1.2.3.2 脂溶性維生素提取 稱(chēng)量1.0 g三七花/莖葉粉末，20 mL無(wú)水乙醇，超聲30 min，40℃搖床振蕩50 min，3500 r/min離心15 min，收集上清液。殘?jiān)?0 mL無(wú)水乙醇洗3次，合并上清液。加入10 mL 10% NaCl，混勻，再加30 mL正己烷萃取，靜置分層，收集上層（正己烷層），再加10 mL正己烷萃取，合并正己烷層，旋干，1 mL（氯仿∶甲醇=1∶4）溶出[17]，20 μL進(jìn)高效液相。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

1.2.4.1 水溶性維生素 分別精密吸取水溶性維生素VB1、VB3、VB6、煙酰胺、VB5對(duì)照品溶液各0.1、0.5、1、10、25、50 μL，加水配制成濃度分別為0.002、0.01、0.02、0.2、0.5、1.0 mmol/L的對(duì)照品溶液；

精密吸取VB12對(duì)照品溶液0.5、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 μL，加水配制成濃度分別為0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 mmol/L的對(duì)照品溶液；

精密吸取VC對(duì)照品溶液0.125、25、50、125、250、500 μL，加水配制成濃度為0.005、1.0、2.0、5.0、10、20 mmol/L的對(duì)照品溶液；

精密吸取生物素對(duì)照品溶液12.5、25、50、125、250、500 μL加乙醇配制成濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 mmol/L的對(duì)照品溶液；

精密吸取葉酸對(duì)照品溶液1、2、5、10、100、250 μL，加乙醇配制成濃度為0.002、0.004、0.01、0.02、0.2、0.5 mmol/L的對(duì)照品溶液；

精密吸取VB2對(duì)照品溶液2、5、10、20、100、250 μL，加水配制成濃度為0.002、0.005、0.01、0.02、0.1、0.25 mmol/L的對(duì)照品溶液。

1.2.4.2 脂溶性維生素 分別精密吸取脂溶性維生素A、D2、D3、K1對(duì)照品溶液各0.2、5、20、50、100、200 μL，加甲醇配制成濃度分別為0.002、0.05、0.2、0.5、1.0、2.0 mmol/L的對(duì)照品溶液；精密吸取維生素E對(duì)照品溶液0.6、15、60、150、300、500 μL，加甲醇配制成濃度分別為0.006、0.15、0.6、1.5、3、5 mmol/L的對(duì)照品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜結(jié)果

按照1.2.1.1色譜條件對(duì)三七地上部分水溶性維生素進(jìn)行含量測(cè)定，對(duì)照品及三七地上部分樣品的色譜圖見(jiàn)圖1，色譜圖基線平穩(wěn)，水溶性維生素VC、VB1、VB3、VB6、煙酰胺、VB5、葉酸、生物素、VB12、VB2分離程度較好；按照1.2.1.2色譜條件進(jìn)行測(cè)定，對(duì)照品維生素A、D2、D3、E、K1及樣品的色譜圖見(jiàn)圖2，色譜圖基線平穩(wěn)，但由于維生素D2、D3的性質(zhì)相近，因此兩者很難分開(kāi)。

圖1 水溶性混合對(duì)照品（A）、三七莖葉樣品（B）和三七花樣品（C）高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed water-soluble standard sample（A），the sample of stems and leaves of Panax notoginseng（B）and the sample of flowers of Panax notoginseng（C）

圖2 脂溶性混合對(duì)照品（A）、三七莖葉樣品（B）和三七花樣品（C）高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of mixed fat-soluble standard sample（D），the sample of stems and leaves of Panax notoginseng（E）and the sample of flowers of Panax notoginseng（F）

2.2 線性關(guān)系考察

取1.2.4.1與1.2.4.2中各系列對(duì)照品溶液測(cè)定峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，樣品量為橫坐標(biāo)，作線性回歸，得回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表1，10種水溶性維生素與5種脂溶性維生素的R2值均大于0.9990。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程Table 1 Regression equation of standard curve of vitamins

2.2.1 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性考察 取1.2.2.1中水溶性維生素對(duì)照品溶液各50 μL，混合，取1.2.2.2中脂溶性維生素對(duì)照品溶液各100 μL，混合，分別連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)得水溶性維生素VC、VB1、VB3、VB6、煙酰胺、VB5、葉酸、生物素、VB12、VB2百分含量的RSD分別為0.31%、2.20%、0.05%、0.03%、2.55%、0.04%、2.73%、1.21%、0.03%、0.09%，脂溶性維生素A、D2、D3、E、K1百分含量的RSD分別為0.60%、0.14%、0.16%、0.69%、0.69%，表明儀器精密度良好；按平行制備三七莖葉/花供試品各6份測(cè)定含量，測(cè)得三七莖葉樣品中維生素C、煙酰胺、葉酸、生物素、維生素K1百分含量的RSD分別為3.07%、3.69%、2.36%、1.37%、2.46%，三七花樣品中維生素C、煙酰胺、維生素B5、維生素K1、葉酸百分含量的RSD分別為2.54%、1.27%、3.24%、2.79%、3.09%，均小于4%，表明該實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性良好；取1.2.3中三七莖葉/花的供試品溶液，分別在0、1、2、3、4、5 h進(jìn)樣，分別計(jì)算所測(cè)維生素的百分含量以及RSD值，結(jié)果得三七莖葉樣品中維生素C、煙酰胺、葉酸、生物素、維生素K1百分含量的RSD分別為3.11%、3.23%、1.46%、1.97%、1.39%，三七花樣品中維生素C、煙酰胺、維生素B5、葉酸、維生素VK1百分含量的RSD分別為2.26%、1.72%、2.34%、3.15%、2.42%，說(shuō)明供試品溶液在5 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.2 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知水溶性/脂溶性維生素含量的三七莖葉/花樣品各6份，在三七莖葉樣品中分別精密加入適量的維生素C、煙酰胺、葉酸、生物素、維生素K1對(duì)照品，在三七花中加入適量的維生素C、煙酰胺、維生素B5、葉酸、維生素K1對(duì)照品，按照1.2.3.1/1.2.3.2制備供試品溶液，取按照各自的線性回歸方程，測(cè)定含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果三七莖葉樣品中水溶性維生素VC、煙酰胺、葉酸、生物素、脂溶性維生素VK1的平均回收率分別為107.91%（RSD=1.46%，n=3）、95.26%（RSD=2.11%，n=3）、97.71%（RSD=1.63%，n=3）、105.04%（RSD=2.33%，n=3）和98.91%（RSD=2.16%，n=3）；三七花樣品中水溶性維生素VC、煙酰胺、維生素B5、葉酸、脂溶性維生素VK1的平均回收率分別為103.97%（RSD=1.73%，n=3）、93.02%（RSD=1.78%，n=3）、104.17%（RSD=2.45%，n=3）、91.79%（RSD=2.35%，n=3）和99.42%（RSD= 1.73%，n=3）。

2.3 樣品測(cè)定結(jié)果

2.3.1 三七莖葉維生素含量測(cè)定 紅河州與文山州各地三年生三七莖葉維生素含量結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可得，在所檢測(cè)的10種水溶性維生素以及5種脂溶性維生素中，三七莖葉中共檢測(cè)出5種，即水溶性維生素C、煙酰胺、葉酸、生物素、脂溶性維生素K1，其他維生素均未檢測(cè)出。

表2 不同產(chǎn)地三年生三七莖葉中維生素含量Table 2 Determination of vitamins from the triennial stems and leaves of Panax notoginseng in different areas

表3 不同產(chǎn)地不同生長(zhǎng)年限三七花中維生素含量Table 3 Determination of vitamins from the flowers of Panax notoginseng in different areas and with different growth years

不同產(chǎn)地三年生莖葉中所檢測(cè)出的水溶性維生素：VC含量范圍為0.0046%～0.0119%，煙酰胺含量范圍為0.0034%～0.0134%，葉酸含量范圍為0.0510%～0.3788%，生物素含量范圍為0.0218%～0.0809%，4種水溶性維生素的含量平均值從大到小依次為葉酸、生物素、維生素C、煙酰胺，數(shù)值分別為0.1291%、 0.0482%、0.0089%、0.0056%；脂溶性維生素K1含量范圍為0.0009%～0.0140%，平均值為0.0033%。在不同產(chǎn)地的三七莖葉的比較中，以文山州文山縣東山鄉(xiāng)的5種維生素總和含量最高，為0.4357%，以紅河州蒙自市的維生素總和最低，為0.0908%。

2.3.2 三七花維生素含量測(cè)定 不同產(chǎn)地不同生長(zhǎng)年限的三七花維生素含量結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可得，在所檢測(cè)的10種水溶性維生素以及5種脂溶性維生素中，三七花中共檢測(cè)出5種，即水溶性維生素VC、煙酰胺、維生素B5、葉酸、脂溶性維生素K1，其他維生素均未檢出。

不同產(chǎn)地不同生長(zhǎng)年限的三七花，水溶性維生素VC含量范圍為0.0005%～0.0021%，煙酰胺含量范圍為0.0021%～0.0185%，維生素B5含量范圍為0.0220%～0.1130%，葉酸含量范圍為0.0087%～0.3797%，4種水溶性維生素的含量平均值從大到小依次為葉酸、維生素B5、煙酰胺、維生素C；脂溶性維生素含量范圍為0.0005%～0.0012%。

文山州不同生長(zhǎng)年限三七花相比較，二年生與三年生三七花中5種維生素含量總和相比，二年生大于三年生三七花，分別為0.5003%（二年生）、0.3306%（二年生）、0.1351%（三年生）；三年生不同產(chǎn)地三七花相比較，文山州文山市1三七花中5種維生素含量總和最小，為0.1351%，紅河州建水縣三七花中5種維生素含量總和最大，為0.3507%。

3 結(jié)論

3.1 采用高效液相色譜法測(cè)定不同產(chǎn)地不同生長(zhǎng)年限的三七地上部分的10種水溶性維生素以及5種脂溶性維生素的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在三七莖葉與花樣品中所檢測(cè)到的水溶性維生素種類(lèi)不完全相同，三七莖葉樣品中檢測(cè)到的4種水溶性維生素包括維生素C、煙酰胺、葉酸、生物素，而三七花中檢測(cè)到的4種水溶性維生素包括維生素C、煙酰胺、葉酸、維生素B5；在三七莖葉與花中均僅檢測(cè)到脂溶性維生素K1。

3.2 有研究[15]發(fā)現(xiàn)三七莖葉中維生素VC含量與三七花的含量相差不大，但本研究測(cè)定的三七莖葉中維生素VC含量與三七花含量的平均值分別為0.0089%、0.0014%，三七莖葉明顯高于三七花中VC的平均含量，可能是由于制備方法以及色譜峰分離條件的不同所致；三七莖葉中的煙酰胺含量（0.0056%）與三七花中的含量（0.0062%，0.0073%）相差不大，而葉酸平均含量則是三七花（0.3163%，0.1910%）高于三七莖葉（0.1291%）。脂溶性維生素VK1的平均含量則是三七莖葉（0.0033%）普遍高于三七花（0.0012%，0.0009%）。

3.3 三七地上部分所檢測(cè)出的維生素種類(lèi)包括水溶性維生素VC，煙酰胺，葉酸，生物素，維生素B5以及脂溶性維生素VK1，這幾種維生素對(duì)人體均具有一定營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與功效[18-24]。三七莖葉與花中所檢測(cè)水溶性維生素均以葉酸含量為最高，平均含量分別為0.1291%，0.1910%～0.3163%，高于以菠菜為首的一般蔬菜中葉酸的含量[25]；而在三七莖葉與花中檢測(cè)出的唯一一種脂溶性維生素VK1，則高于以芹菜中VK1含量為首的47種蔬菜[26]。因此，三七地上部分可以作為日常補(bǔ)充維生素的良好來(lái)源。

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Determination of vitamins in aerial part of Panax notoginseng by high performance liquid chromatography

LIU Ying，QU Yuan，CUI Xiu-ming*
（Faculty of Life Science and Technology，Kunming University of Science and Technology，Joint Laboratory of Quality and Utilization of TCM Resources in Dian and Macao，Kunming 650500，China）

The contents of water-soluble and fat-soluble vitamins in aerial part of Panax notoginseng were determined by high performance liquid chromatography.Five kinds of vitamins were respectively determined in the stems and leaves and in the flowers of Panax notoginseng，but there were some differences in the kinds of vitamins between the two parts.The correlation coefficients of vitamins were more than 0.9990.The content of Folic acid in the water-soluble vitamins which were determined was highest in the two parts，and the average content was 0.1291%in the stems and leaves and 0.1910%～0.3163%in the flowers.VK1was the only fatsoluble vitamin which was determined in the two parts，and the average content was 0.0033%in the stems and leaves and 0.0009%～0.0012%in the flowers.The method of this research was simple and accurate.The result could be used to lay the foundation for the research and development of the aerial part of Panax notoginseng as new resource food.

HPLC；aerial part of Panax notoginseng；water-soluble vitamins；fat-soluble vitamins；content determination

TS201.1

A

1002-0306（2015）22-0049-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.001

2015－03－01

劉英（1988-），女，在讀碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物研究，E-mail：308168275@qq.com。

*通訊作者：崔秀明（1963-），男，研究員，研究方向：生藥學(xué)，E-mail：sanqi@vip.sina.cn。

中央本級(jí)重大增減支項(xiàng)目（2060302）；昆明理工大學(xué)分析測(cè)試基金（20140699）。