具鞘微鞘藻胞外多糖抗紫外輻射活性研究*

唐 倩 周 楠 唐東山，2 曾鐵兵 朱 洪 張曉文，2

(1.南華大學(xué)環(huán)境保護(hù)與安全工程學(xué)院，湖南 衡陽 421001;2.南華大學(xué)放射性三廢處理與處置重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 衡陽 421001;3.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 衡陽 421001)

0 引言

多糖(polysaccharides)是除蛋白、核酸外的第三類大分子，是一類生物活性廣泛的極性大分子聚合物，廣泛分布于自然界各類生物體中［1］。胞外多糖(extracellular polysaccharides，EPSs)是指廣義的細(xì)菌胞外多糖，即細(xì)胞外含多糖的結(jié)構(gòu)。因細(xì)菌和真菌的胞外多糖具有易于分離純化而且產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，人們對(duì)來源于微生物的多糖越來越重視，它們?cè)诠I(yè)生產(chǎn)中也頗受青睞。藍(lán)藻(藍(lán)細(xì)菌)是地球上最古老的光合放氧原核生物，一直是生物圈的優(yōu)勢(shì)生物類群［2］，而荒漠藍(lán)藻是荒漠土壤結(jié)皮和荒漠生態(tài)系統(tǒng)中非常重要的優(yōu)勢(shì)物種，目前對(duì)荒漠藻多糖的研究主要集中在其室內(nèi)培養(yǎng)條件優(yōu)化［3］和抗干旱、抗鹽堿、抗捕食［4－6］及其在沙漠土壤成土中的作用等方面［7］，對(duì)荒漠藍(lán)藻胞外多糖抗紫外輻射活性的研究還較少。

具鞘微鞘藻(Microcoleus vaginatus Gom.)屬于顫藻科，微鞘藻屬的一種絲狀藍(lán)藻，作為荒漠生境中的優(yōu)勢(shì)藻種，在長期進(jìn)化過程中獲得了較強(qiáng)的抗紫外輻射能力，這種能力與其胞外多糖密切相關(guān)。許多研究表明:多糖能夠使輻射所引起的遲發(fā)型超敏感性反應(yīng)低下和SOD活性下降明顯恢復(fù)，促進(jìn)自由基清除，抑制或阻斷自由基引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)［8－9］，因此研究具鞘微鞘藻的胞外多糖抗紫外輻射活性對(duì)于進(jìn)一步了解荒漠藻多糖的生物活性、揭示荒漠藻適應(yīng)環(huán)境脅迫的機(jī)理，進(jìn)而對(duì)于加強(qiáng)荒漠化治理和促進(jìn)生態(tài)安全具有一定的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

所用試劑純度均為分析純。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R－3，瑞士)、高速臺(tái)式離心機(jī)(TGL－10C，上海)、臺(tái)式低溫恒溫振蕩搖床(PSET15OA，上海)、電子天平(AL204，上海)、立式壓力蒸汽滅菌器(BXM－30R，上海)、雙光束紫外可見分光光度計(jì)(TU－1901，北京)、水浴恒溫振蕩箱(SHZ－88，江蘇金壇)、隔水式恒溫培養(yǎng)箱(GNP－9080，上海)、核酸蛋白儀(DU640，上海)、磁力加熱攪拌器(78－1，湖南長沙)、人工氣候箱(PYX－250QB，廣東韶關(guān))。

1.2 試驗(yàn)用胞外多糖

1.2.1 藻種來源與培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)所用具鞘微鞘藻從中國科學(xué)院水生生物研究所藻種庫購得。

藻種恢復(fù)培養(yǎng)成功后，采用 BG11培養(yǎng)基(121℃高壓蒸汽滅菌30 min)，通過反復(fù)通氣培養(yǎng)來擴(kuò)大藻種量，培養(yǎng)溫度為25℃，光暗比12∶12，每天手動(dòng)搖晃數(shù)次。

1.2.2 具鞘微鞘藻粗多糖提取

取培養(yǎng)20 d的微鞘藻，抽濾收集取上清液，抽濾后過0.45μm的微孔濾膜，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮(40℃，120 r/min)上清液至原來體積的1/4，加入體積倍數(shù)為3倍的95%乙醇，產(chǎn)生白色絮狀沉淀，充分?jǐn)嚢瑁?℃靜止沉降過夜后棄上清液，4 000 r/min離心10 min得沉淀，沉淀用無水乙醇洗滌2～3次。

1.2.3 Sevag 法脫蛋白

將沉淀溶于一定量的水中，加入3倍體積比為3∶1的氯仿和正丁醇混合液，振蕩0.5 h，4 000 r/min離心除去沉淀。重復(fù)以上步驟至無白色沉淀生成。多糖含量測(cè)定采用酚－硫酸法［10－11］。

1.3 試驗(yàn)用大腸埃希氏菌

大腸埃希氏菌的菌株為E.coliJM109，取自南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所。

在－80℃冰箱中保存的冰凍菌種融化后，接種于預(yù)先配置好的LB固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 h。根據(jù)試驗(yàn)要求配制初始濃度約為109CFU/mL的菌懸液:從平板上挑取E.coliJM109接種于4 mL LB液體培養(yǎng)基，繼續(xù)于37℃、220 r/min下振蕩培養(yǎng)4 h后，測(cè)定吸光度0.4～0.5麥?zhǔn)蠞岫龋礊閷?shí)驗(yàn)所需菌樣。

1.4 E.coli JM109菌種的紫外輻照存活曲線

(1)取8 mL制備的濃度約為109CFU/mL菌液加到直徑9 cm的小培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)皿內(nèi)放入無菌磁力攪拌棒，然后置于電磁攪拌器上，15 W和20 W紫外燈下30 cm處，照射前先開啟紫外燈預(yù)熱20 min。開啟皿蓋在攪拌狀態(tài)下分別照射 5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 s，每個(gè)照射時(shí)間設(shè)3個(gè)平行樣，操作避免白熾光。

(2)取未照射的菌液和照射菌液各1 mL進(jìn)行稀釋分離，避光置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，利用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)。

1.5 多糖抗紫外輻射實(shí)驗(yàn)步驟

為得出不同量的多糖對(duì)大腸桿菌保護(hù)作用的差別，設(shè)置200、400、800 mg/L的3個(gè)梯度濃度。取濃度為109CFU/mL的大腸埃希氏菌菌懸液1 mL，與濃度為200、400、800 mg/L的多糖溶液7 mL分別混勻，對(duì)照為l mL菌懸液與7 mL無菌生理鹽水混勻。將之前已制備好的菌液加到直徑9 cm的小培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)皿內(nèi)放入無菌磁力攪拌棒，然后置于磁力攪拌器上，于15 W、20 W紫外燈下30 cm處照射，照射前，先開啟紫外燈預(yù)熱20 min。開啟皿蓋在攪拌狀態(tài)下分別照射10 s，20 s，40 s及80 s，操作避免白熾光［12］。

取照射后的菌液各1 mL進(jìn)行稀釋分離，避光置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，利用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)活菌細(xì)胞數(shù)。多糖對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株的紫外保護(hù)作用以抗輻射率(%)表示:

Ai:對(duì)照實(shí)驗(yàn)菌液紫外照射后存活的菌數(shù);

Ao:樣品實(shí)驗(yàn)菌液紫外照射后存活的菌數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸埃希菌的紫外輻射存活率

圖1為紫外燈輻射下大腸埃希菌存活率。

圖1 紫外燈輻射下大腸埃希菌存活率

如圖1所示，輻射時(shí)間為5 s時(shí)，15W紫外燈輻射下大腸埃希菌存活率為50%，20W紫外燈輻射下大腸埃希菌存活率為43%;輻射時(shí)間為10 s時(shí)，15W紫外燈輻射下大腸埃希菌存活率為41%，20W紫外燈輻射下大腸埃希菌存活率為37%;輻射時(shí)間為60 s時(shí)，15W紫外燈輻射下大腸埃希菌存活率為17%，20W紫外燈輻射下大腸埃希菌存活率為12%;80 s以后，二者的紫外存活率都接近于0。由此可知，隨著輻射時(shí)間的增長，大腸埃希菌的紫外存活率越來越低，5～40 s之間，該菌的紫外存活率下降比較明顯，40～60 s之間該菌的紫外存活率的下降速度趨于平緩，但是60 s之后，該菌的紫外存活率又急速下降，80 s以后幾乎沒有存活的菌落。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:大腸埃希菌對(duì)短時(shí)間、低劑量的紫外輻射具有一定的抵抗能力，但對(duì)于長時(shí)間、高劑量的紫外輻射幾乎沒有抵抗力;在相同功率的紫外燈照射下，紫外存活率隨照射時(shí)間延長而降低，高紫外線照射強(qiáng)度對(duì)大腸埃希菌的殺菌效果要高于低強(qiáng)度。

紫外線輻射時(shí)，大腸埃希氏菌會(huì)形成過氧化氫，并進(jìn)一步產(chǎn)生過氧自由基。由于自由基含未配對(duì)的電子，所以極不穩(wěn)定，因此會(huì)從鄰近的分子(包括脂肪、蛋白質(zhì)和DNA)上奪取電子，讓自己處于穩(wěn)定的狀態(tài)。這樣一來，鄰近的分子又變成一個(gè)新的自由基，然后再去奪取電子，如此連鎖反應(yīng)的結(jié)果便是讓細(xì)胞的結(jié)構(gòu)受到破壞，造成細(xì)胞功能喪失、基因突變、甚至死亡。隨著輻射時(shí)間的增長，大腸埃希氏菌體內(nèi)產(chǎn)生越來越多的自由基，當(dāng)自身修復(fù)功能不足以阻止自由基的損害時(shí)，細(xì)胞便走向死亡。

2.2 具鞘微鞘藻胞外多糖抗輻射率

自然界中微生物利用光能、抵御強(qiáng)光的輻射，是光化學(xué)反應(yīng)的主體。紫外線通過光敏化劑間接對(duì)DNA產(chǎn)生損傷，通常輻射激發(fā)光敏化劑，產(chǎn)生氧或氫氧自由基，引起脂質(zhì)過氧化，造成對(duì)細(xì)胞、酶類及核酸等生物大分子的損傷。自由基能造成DNA束斷裂、堿基水合物或者導(dǎo)致DNA和與之相聯(lián)系的蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)。DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)形成DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)能影響二聚體形成的位置。

利用抗氧化劑消除紫外線輻射所帶來自由基的侵害是微生物抵抗紫外輻射的一種機(jī)理。多糖是一種新興的天然抗氧化劑，多糖能夠使輻射所引起的遲發(fā)型超敏感性反應(yīng)低下和SOD活性下降明顯恢復(fù)，過氧化水平降低。在紫外輻射條件下，多糖對(duì)大腸埃希氏菌抗紫外輻射能力有一定的增強(qiáng)效應(yīng)。

2.2.1 不同功率紫外輻射下，胞外多糖濃度對(duì)抗輻射率的影響

如圖2(a)所示，在20 W紫外燈輻射的條件下，添加400 mg/L多糖溶液的大腸埃希氏菌菌懸液的抗輻射率要高于添加200 mg/L與800 mg/L多糖溶液的菌懸液。如當(dāng)輻射時(shí)間為40s時(shí)，添加400 mg/L多糖溶液的菌懸液的抗輻射率為41%，添加200 mg/L與800 mg/L多糖溶液的菌懸液的抗輻射率分別為24%和28%;當(dāng)輻射時(shí)間為80 s時(shí)，添加400 mg/L多糖溶液的菌懸液的抗輻射率為24%，添加200 mg/L與800 mg/L多糖溶液的菌懸液的抗輻射率分別為16%和20%。在15 W紫外燈輻射的條件下，多糖的抗輻射率與20 W紫外燈輻射下的抗輻射率大體相似，如圖2(b)所示。

圖2 不同紫外燈輻射下多糖抗輻射率

添加400 mg/L多糖溶液且輻射時(shí)間為40 s時(shí)，大腸埃希氏菌的輻射防護(hù)作用最強(qiáng)，這可能是因?yàn)闈舛葹?00 mg/L時(shí)，多糖能更好地清除由于輻射所導(dǎo)致菌懸液里的細(xì)菌組分中分子或原子激發(fā)而產(chǎn)生的自由基，并且能增強(qiáng)大腸埃希氏菌本身的免疫力與抗輻射能力，修復(fù)紫外輻射損傷，從而保護(hù)菌體。200 mg/L的多糖溶液可能由于量太少，不足以迅速清除因紫外輻射而產(chǎn)生的大量自由基，消除紫外輻射對(duì)大腸埃希氏菌的負(fù)面影響，并且雖然自由基的存活時(shí)間非常短暫只有10 s，但是一旦自由基進(jìn)入生物體內(nèi)就會(huì)直接或間接損傷細(xì)胞膜或直接與基因結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化或死亡。800 mg/L的多糖溶液對(duì)大腸埃希氏菌的保護(hù)作用低于400 mg/L多糖溶液的原因可能是過量的多糖分子擠占了大腸埃希氏菌的生存空間，阻礙其光復(fù)活反應(yīng)或是DNA修復(fù)等活動(dòng)的進(jìn)行，因此其對(duì)大腸埃希氏菌的保護(hù)效果較差。

2.2.2 同紫外輻照時(shí)間下，胞外多糖濃度對(duì)抗輻射率的影響

同一濃度的多糖大腸埃希氏菌菌懸液的抗紫外輻射率大致隨時(shí)間增長呈上升趨勢(shì)，但在40 s之后抗輻射率逐漸下降。如圖3所示，在多糖濃度為200 mg/L、紫外燈功率為20W、15W條件下，多糖大腸埃希氏菌菌懸液在40 s的抗輻射率分別為24%和22%，在20 s的抗輻射率分別為15%和14%，在80 s的抗輻射率分別為16%和15%，而在10 s的抗輻射率分別只有8%和7%。這可能是因?yàn)楫?dāng)輻射時(shí)間比較短時(shí)，輻射作用產(chǎn)生的自由基相對(duì)較少，所以多糖對(duì)大腸埃希氏菌的輻射防護(hù)作用相對(duì)要小，此外，紫外輻射時(shí)間較短時(shí)，由于大腸埃希氏菌本身的自我保護(hù)能力及自我修復(fù)功能使其死亡率較低，這也會(huì)致使多糖抗輻射率的下降。

圖3 胞外多糖濃度對(duì)不同紫外輻射的抗輻射情況

20W紫外燈輻射條件下，多糖的抗輻射率高于15W紫外燈輻射下的抗輻射率。在多糖濃度為400 mg/L的條件下，20W紫外燈照射條件下多糖的抗紫外輻射率要比15W紫外燈照射條件下的高出約4～10個(gè)百分點(diǎn)。這可能是由于在高強(qiáng)度紫外燈輻射下，產(chǎn)生的自由基更多，自由基形成后，它們可以進(jìn)攻、浸潤和損傷細(xì)菌結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞膜受損部位產(chǎn)生類脂過氧化物，致使死亡的大腸埃希氏菌更多。一方面，在高強(qiáng)度紫外燈輻射下，大腸埃希氏菌本身死亡率較高;另一方面，由于多糖的抗輻射、抗氧化活性增強(qiáng)了大腸埃希氏菌的免疫能力，使該菌在面對(duì)高強(qiáng)度紫外輻射時(shí)，抵抗能力較強(qiáng)，存活率提高。此外多糖能夠清除因輻射產(chǎn)生的大量自由基，阻止自由基對(duì)大腸埃希氏菌的浸潤、攻擊和損傷，維護(hù)其生命活動(dòng)，提高大腸埃希氏菌的紫外存活率。因此，在高強(qiáng)度的紫外輻射條件下，多糖對(duì)大腸埃希氏菌的保護(hù)作用就更明顯，相對(duì)來說抗輻射率就更高。

3 結(jié)論

多糖作為一種生物活性物質(zhì)，具有抗氧化和清除自由基的作用，可以綜合改善機(jī)體的免疫能力和各方面的生理功能。經(jīng)紫外輻射后的細(xì)菌，其細(xì)胞DNA會(huì)受到損傷，即引起DNA分子形成嘧啶二聚體結(jié)構(gòu)［14］，同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生破壞力很強(qiáng)的活性氧自由基，這些自由基反過來又引起DNA分子斷裂，進(jìn)而影響DNA復(fù)制或?qū)е禄蛲蛔儯?5］。多糖可以清除OH、O2－自由基，減少自由基對(duì)細(xì)胞的損傷，減緩脂質(zhì)過氧化，增強(qiáng)細(xì)胞的免疫力，有助于細(xì)胞抵抗紫外輻射所引起的損傷。

大腸埃希氏菌是革蘭氏陰性菌，細(xì)胞壁外膜含有脂質(zhì)成分，如脂多糖、磷脂和脂蛋白，更易受到氧自由基的侵襲產(chǎn)生類脂過氧化物，損傷細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致大腸埃希氏菌的死亡。胞外多糖對(duì)大腸埃希氏菌的保護(hù)作用一是通過清除自由基，減少自由基對(duì)細(xì)菌結(jié)構(gòu)的攻擊、損傷，另外一個(gè)途徑就是胞外多糖可以增強(qiáng)大腸埃希氏菌的免疫力和抗氧化功能，對(duì)抗紫外輻射損傷。

多糖的抗氧化作用已得到廣泛重視，許多研究都表明了多糖具清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化的作用，它可以保護(hù)微生物，提高微生物的紫外存活率。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也說明了這一點(diǎn)，也對(duì)將來需要繼續(xù)研究胞外多糖抗紫外輻射活性研究有一定的參考意義。但是關(guān)于胞外多糖抗紫外輻射活性還需要更深入的研究，如多糖作用的靶點(diǎn)、有效部位及其機(jī)理等。此外，不同的提取方法對(duì)多糖結(jié)構(gòu)也會(huì)有一定的影響，可能會(huì)造成生物活性的差異，因此多糖的提取工藝也應(yīng)該考慮進(jìn)來，這些都值得我們進(jìn)一步探索、研究。

［1］許春平，劉帥，孫斯文.不同來源多糖在降血糖降血脂方面的研究進(jìn)展［J］.食品研究與開發(fā)，2014，15:115－118.

［2］唐倩，周楠，唐東山.荒漠藍(lán)藻抗逆性及應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.環(huán)境保護(hù)與循環(huán)經(jīng)濟(jì)，2014，11:34 －37.

［3］張雅涵.具鞘微鞘藻室內(nèi)培養(yǎng)及產(chǎn)胞外多糖條件的優(yōu)化［D］.蘭州:蘭州理工大學(xué)，2014.

［4］Hu CX，Zhang D L，Huang Z B，et al.The vertical microdistribution of cyanobacteria and green algae within desert crusts and the development of the algal crusts［J］.Plant Soil，2003，257:97 －111.

［5］Chen L Z，Li D H，Liu Y D.Salt tolerance ofMicrocoleus vaginatusGom.，a cyanbacterium isolated from desert algal crust，was enhanced by exogenous carbohydrates ［J］.J.Arid Environ.，2003，55b:645 －656.

［6］ Stal L J.Cyanobacterial mats and stromatolites［M］//Whitton and Pons(Eds.).The Ecology of Cyanobac teria:Their Diversity in Time and Space.Dordrecht:K luwer Academic Publishers，2000:62.

［7］陳蘭周，劉永定，宋立榮.微鞘藻胞外多糖在沙漠土壤成土中的作用［J］.水生生物學(xué)報(bào)，2002，02:155 －159.

［8］ Hong－Bin Wang，Sheng－Jun Wu，Dou Liu.Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc communeand their antioxidant activities［J］.Carbohydrate Polymers，2014，99:553–555.

［9］陳立，董俊興.多糖抗輻射作用研究進(jìn)展［J］.癌變.畸變.突變，2004，06:380 －382.

［10］張惟杰.糖復(fù)合物生化研究技術(shù)［M］.杭州:浙江大學(xué)出版社，2004.

［11］李戰(zhàn).三種紫球藻培養(yǎng)、胞外多糖提取及RAPD分析［D］.上海:上海師范大學(xué)，2004.

［12］梁曉婷.Pantoea agglomerans TCa－7抗紫外輻射損傷作用的研究［D］.大連:中國海洋大學(xué)，2006.

［13］王洪媛，江曉路，任虹，等.抗UV－B輻射菌紫外吸收代謝產(chǎn)物分析及其抗紫外輻射活性研究［J］.中國海洋藥物，2006，04:1 －5.

［14］謝作明.荒漠藻類對(duì)紫外輻射的響應(yīng)及其結(jié)皮形成的研究［D］.北京:中國科學(xué)院研究生院(水生生物研究所)，2006.