白銀市番茄黃化曲葉病毒的鑒定

李春雷， 文朝慧， 王溪橋， 尤 佳

（甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)中心，甘肅 蘭州 730010）

番茄（Solanum lycopersicum Mill.）屬茄科番茄屬，是世界上最重要的蔬菜作物之一［1］。番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）是一種雙生病毒（geminiviruses）病害，以煙粉虱作為傳播媒介［2］。其大面積爆發(fā)對(duì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成了不同程度的破壞［3～6］。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前我國(guó)番茄黃花曲葉病毒病年發(fā)生面積超過(guò)6.7萬(wàn)hm2，年經(jīng)濟(jì)損失至少20億元［7］。2011年，甘肅省武山縣首次發(fā)現(xiàn)TYLCV，2012年，相繼在武威市涼州區(qū)、民勤縣的日光溫室發(fā)現(xiàn)TYLCV，并于2013年在武威市設(shè)施番茄主產(chǎn)區(qū)開(kāi)始流行蔓延，造成嚴(yán)重?fù)p失［8～10］。鑒于此，我們對(duì)發(fā)生于白銀市的疑似TYLCV樣品進(jìn)行分子鑒定，并進(jìn)行了序列同源性比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

在甘肅白銀市水川鎮(zhèn)張莊村選取上部葉片黃化、邊緣向上卷曲、植株生長(zhǎng)變緩甚至停滯，矮化變小，具有典型黃化曲葉病毒病癥狀的番茄葉片。DNA提取試劑盒（PlantGenomic DNA Extraction Kit）購(gòu)自天根生化科技有限公司；PCR反應(yīng)體系試劑購(gòu)自寶生物工程有限公司。引物的合成與片段測(cè)序由大連寶生物工程有限公司完成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 特異性引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)李常保等的研究［11］，合成了上游引物TYLCV-F：5'-ACGCATGCCTC TAATCC AGTGTA- 3'和 TYLCV-R：5'-CCAATAAGGCGTAAGCGTGTA GAC-3'。所要擴(kuò)增的目的條帶為543 bp。該引物是針對(duì)TYLCV的特異區(qū)段設(shè)計(jì)，只與TYLCV的特異區(qū)結(jié)合，因此，可以通過(guò)PCR技術(shù)來(lái)判斷白銀地區(qū)番茄植株是否感染TYLCV。

1.2.2 植物基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增 取具有番茄黃化曲葉病毒病癥狀的番茄葉片，按照植物基因組DNA提取試劑盒的說(shuō)明提取番茄基因組DNA，利用引物TYLCV-F和TYLCV-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為25μL，其中10×PCR buffer 2.5μL，dNTP（10mmol/L）1μL，DNA模板3μL，上下游引物（10mmol/L）各1μL，rTaq酶（5 U/μL）0.5μL，ddH2O 16μL。PCR擴(kuò)增條件為：第一階段，94℃預(yù)變性4min；第二階段，94℃變性45 s，50℃復(fù)性45 s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；第三階段，72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，最后利用凝膠自動(dòng)成像儀檢測(cè)拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄黃化曲葉病毒病的田間感病表現(xiàn)

如圖1所示，采集的番茄植株樣品表現(xiàn)為矮縮、生長(zhǎng)變緩甚至停滯，葉片邊緣逐漸黃化且變小，符合黃化曲葉病毒病的發(fā)病癥狀。

2.2 番茄黃化曲葉病毒病的PCR 鑒定

以感病番茄葉片的病毒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。得到543 bp大小的特異性條帶，以水為模板的PCR結(jié)果無(wú)條帶。將測(cè)序結(jié)果（圖3）在NCBI網(wǎng)站（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）上進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果表明PCR擴(kuò)增所得的543 bp序列的特異性條帶是番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）的部分序列，根據(jù)以上結(jié)果，可以診斷確定白銀地區(qū)的番茄感染了TYLCV。

圖1 番茄田間感病表型

M 1 2 3

圖2 凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

圖3 PCR產(chǎn)物回收測(cè)序結(jié)果

3 小結(jié)與討論

1） 以李常保等研究為依據(jù)［11］，以PCR技術(shù)為鑒定方法，對(duì)白銀地區(qū)的番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）進(jìn)行了分子鑒定。結(jié)果表明，從具有典型番茄黃化曲葉病毒病病癥的植株上所采集的病毒，經(jīng)過(guò)PCR檢測(cè)及測(cè)序比對(duì)分析后，證實(shí)其確實(shí)為T(mén)YLCV，同時(shí)證明通過(guò)PCR技術(shù)可以方便快捷、準(zhǔn)確高效地檢測(cè)到番茄所感染TYLCV的情況。

2） 番茄黃化曲葉病毒病的危害嚴(yán)重，且依靠煙粉虱來(lái)傳播，傳播廣泛，已經(jīng)成為威脅番茄產(chǎn)量與品質(zhì)的重要病害。在生長(zhǎng)發(fā)育早期染病的番茄，其生長(zhǎng)、開(kāi)花和座果將受到嚴(yán)重影響，甚至導(dǎo)致毀滅性的絕產(chǎn)；在生長(zhǎng)發(fā)育后期染病的番茄，番茄的上部葉片及新生葉結(jié)果少且小，嚴(yán)重影響了番茄的產(chǎn)量及品質(zhì)［12］。

3） 番茄黃化曲葉病毒病一旦大面積的發(fā)生，會(huì)給經(jīng)濟(jì)造成不可估量的損失，因此，今后的研究還應(yīng)著重培育適合不同地區(qū)種植的抗番茄黃化曲葉病毒病的番茄品種，并著重追蹤該病毒的變異以及進(jìn)化情況，從而有效的控制病情并為培育新的抗病品種奠定理論依據(jù)。

［1］ 李 敏. 番茄抗花葉病毒（ToMV）的鑒定及其類(lèi)似序列分離［D］. 成都：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

［2］ 蔡建和，秦碧霞，朱桂寧，等. 番茄黃花曲葉病毒病在廣西爆發(fā)的原因和防治策略［J］. 中國(guó)蔬菜，2006（7）：47-48.

［3］ 何自福，虞 皓，毛明杰，等. 中國(guó)臺(tái)灣番茄曲葉病毒侵染引起廣東番茄黃化曲葉?。跩］. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2007，15（1）：119-123.

［4］ 趙統(tǒng)敏，余文貴，周益軍，等. 江蘇省番茄黃化曲葉病毒病（TYLCD）的發(fā)生與診斷初報(bào)［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，23（6）：654-655.

［5］ 吳永漢，張春胄，徐方程，等. 溫州地區(qū)番茄曲葉病毒病放生與防治［J］. 中國(guó)蔬菜，2007（5）：57-58.

［6］ 于 力，朱龍英，萬(wàn)延惠，等. 上海地區(qū)番茄黃花曲葉病毒病的鑒定及嫁接接種法研究［J］. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2009，28（1）：115-118.

［7］ ZHANG H，GONG HR，ZHOU XP. Molecular characterization and pathogenicity of tomato yellow leaf curl virus in China［J］. Virus Gen，2009，39（2）：249-255.

［8］ 胡志峰，邵景成. 甘肅省設(shè)施番茄黃化曲葉病毒病的發(fā)生與防治［J］. 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2014（1）：54-56.

［9］ 郭復(fù)海，王玉忠，張麗萍. 涼州區(qū)日光溫室番茄黃化曲葉病毒病的發(fā)生與綜合防治［J］. 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2013（2）：52-54.

［10］ 嚴(yán)煥蘭. 涼州區(qū)番茄黃化曲葉病毒病的發(fā)生及防治［J］. 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2013（8）：59-60.

［11］ 李常保，崔彥玲，張麗英，等. 番茄黃化曲葉病毒的快速分子檢測(cè)［J］. 遺傳，2012，34（3）：366-370.

［12］ 劉劍峰，肖啟明，張德詠，等. 番茄黃化曲葉?。═YLCV）的研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013，29（13）：70-76.