豌豆白粉病抗性相關(guān)指標(biāo)的研究

張麗娟，楊曉明，陸建英，王 昶

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所， 甘肅 蘭州 730070）

豌豆白粉病是影響豌豆生產(chǎn)的主要病害之一，豌豆白粉病的發(fā)生與品種的抗性有直接的關(guān)系。我國關(guān)于豌豆白粉病的研究主要集中在對抗病種質(zhì)資源的鑒定評價和綜合防治技術(shù)方面［1～5］。植物病原真菌侵入植物體后可引起寄主植物體內(nèi)發(fā)生復(fù)雜的生理生化變化，許多學(xué)者都在研究真菌的致病機制和寄主植物的抗病機理［6］，而有關(guān)豌豆白粉病抗性與各生理指標(biāo)間的關(guān)系尚缺乏研究。

甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所選育的豌豆品種X9002是我國目前培育出來的高抗、且抗性穩(wěn)定的抗白粉病豌豆品種［7］。我們根據(jù)苗期抗性鑒定結(jié)果，以不同生長習(xí)性的抗、感病品種1702、定褐、S3008為對照，研究豌豆白粉病菌侵染前不同抗性品種間相關(guān)防御系統(tǒng)的變化規(guī)律，以期為抗病育種提供理論依據(jù)。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

選用抗病品種X9002、中抗品種1702、中感品種定褐及高感品種S3008為試材，培養(yǎng)土用甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗地耕層與蛭石、腐殖質(zhì)按1∶1∶2混合，裝于規(guī)格為30 cm×30 cm的花盆內(nèi)，每品種種6盆，置于智能化溫室中進行培養(yǎng)。

1.2 試驗方法

1.2.1 葉綠素含量測定 采用分光光度計法［8］。稱取剪碎的新鮮豌豆葉片0.2 g于研缽中，加80%丙酮25mL研磨，定容至25mL， 80%丙酮作對照，于652 nm處測定樣品液吸光值，按下列公式計算葉綠素含量，重復(fù)3次。

葉綠素含量=CT×提取液體積×稀釋倍數(shù)/樣品鮮重×1000

1.2.2 可溶性糖含量測定 稱取剪碎的新鮮豌豆葉片0.5 g，放入大試管中，加入15mL蒸餾水，沸水浴煮沸20min，取出冷卻，過濾入50mL容量瓶中，蒸餾水沖洗殘渣數(shù)次定容至刻度。取待測樣品提取液1.0mL加葸酮試劑5mL，將各管快速搖動混勻后，在沸水浴中煮10min，取出冷卻，在620 nm波長下，用空白調(diào)零測定光密度，同時繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［9］。

1.2.3 粗酶液的制備 稱取0.2 g新鮮豌豆葉片，放入預(yù)冷的研缽中，加入2.0mL 0.05mol/L磷酸緩沖液（pH 7.0）和0.1 g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）及少量石英砂，于冰浴中研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至離管中，然后再加入3.0mL上述緩沖液沖洗研缽合并入離心管。13 000 r/min，4℃離心20min，上清液即為酶的粗提液。

1.2.4 SOD活性的測定 取上清液0.03mL，加1.8 mL反應(yīng)液［含14.5 mM甲硫氨酸，2.25 mM NBT，60μM 核黃素，30μM EDTA-Na2；用50 mM PBS（7.8）］，4 000 lux照光20min，黑布避光終止反應(yīng)，黑暗下終止反應(yīng)，立即在560 nm波長處測定吸光值，以緩沖液代替酶液作為空白。抑制NBT光化學(xué)反應(yīng)50%為一個酶活性單位［10］。

1.2.5 CAT活性測定 取上清液0.1mL、磷酸緩沖液（pH 7.0）1.5mL、蒸餾水1mL，設(shè)置2個重復(fù)1個對照。25℃預(yù)熱后逐管加入0.2mol/L的H2O2，在240 nm下測定吸光度，每隔1min讀取一次，共測3min［11］。

1.2.6 POD活性測定 0.1 mL酶液，加入含有2%H2O2的0.05mol/L磷酸緩沖液和0.05mol/L愈創(chuàng)木酚，用加熱煮沸5min的酶液為對照，立即于37℃水浴中保溫15min，然后迅速轉(zhuǎn)入冰浴加入2.0mL 20%三氯乙酸終止反應(yīng)，470 nm波長下測定吸光度，以每分鐘內(nèi)吸光度變化0.01為1個過氧化物酶活性單位（U）［12］。

1.2.7 PPO活性測定 0.1mL酶液加入5mL試管中與1.7mL含0.02mol/L鄰苯二酚的磷酸緩沖溶液（pH 6.8）混合。在30℃水浴保溫30min，于398 nm下測光密度值，以提取緩沖液為空白對照。以每秒在398 nm處吸光度變化0.01為1個酶活性單位U。

1.2.8 PAL活性測定 取上清液0.1mL，加底物0.02M苯丙氨酸硼酸緩沖液（pH 8.8）1.7mL，30℃保溫30min，硼酸緩沖液為對照，以每秒在290 nm處吸光度變化0.01為1個酶活性單位［13］。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抗性品種可溶性糖含量差異

由表1可見，隨著豌豆品種抗性降低，可溶性糖含量大致呈升高趨勢， 抗性品種X9002和1702的可溶性糖含量均低于7%，感病品種定褐和S3008的可溶性糖含量均高于7%，抗病品種與感病品種間差異極顯著（P<0.01），但高抗品種X9002與中抗品種差異不顯著（P>0.05）。高感品種S3008可溶性糖含量并非最高，較中感品種1702低，為7.19%，不同抗性品種間可溶性糖含量差異不顯著。

2.2 不同抗性品種葉綠素含量差異

葉綠素含量作為直接反映植物光合特性的重要生理參數(shù)，已成為多種植物的抗逆生理指標(biāo)。葉綠素含量高，葉片光合作用強，產(chǎn)生的能量和積累的有機物質(zhì)就越多，植物抗病性也就越強。由表1可以看出，不同品種的葉綠素含量隨著白粉病抗性降低而降低，抗性品種葉綠素含量均高于3mg/g，明顯高于感病品種。高抗品種X9002葉綠素含量最高，達到4.13mg/g；感病品種葉綠素含量均低于3mg/g，高感品種S3008葉綠素含量最低，為2.63mg/g。經(jīng)統(tǒng)計分析高抗品種與中抗、中感及高感品種均存在極顯著差異（P<0.01），說明葉綠素含量與豌豆白粉病抗性正相關(guān)，可反映豌豆品種白粉病抗性的增強。

表1 不同抗性品種的生理指標(biāo)與抗病性的關(guān)系

2.3 不同抗性品種SOD 活性差異

由表1可以看出，SOD活性與豌豆白粉病抗性之間的變化規(guī)律不明顯。其中中抗品種1702的SOD活性最高，為403.28 U/（g·min），與高抗和中感品種存在極顯著差異（P<0.01）。而高抗與中感品種間無顯著性差異（P>0.05），且高抗品種X9002的SOD活性最低，為184.7 U/（g·min）?？共∑贩N與感病品種間的SOD活性不呈規(guī)律性變化，因此SOD活性的高低不能反映豌豆白粉病抗性的強弱。

2.4 不同抗性品種CAT 活性差異

由表1可以看出，不同抗性品種的CAT活性隨著白粉病抗性的減弱而增強，抗病品種CAT活性明顯低于感病品種；高抗品種X9002的CAT活性最低，為26.82U/（g·min），與中抗品種及感病品種的CAT活性存在極顯著差異（P<0.01）；高感品種S3008的CAT活性最高，達到43.65U/（g·min）。表明CAT活性與豌豆白粉病抗病性之間存在一定的關(guān)系，可用CAT活性高低反應(yīng)豌豆白粉病抗性的強弱。

2.5 不同抗性品種POD 活性差異

由表1可以看出，不同抗性豌豆品種之間POD活性差異不顯著，高感品種S3008的POD活性最低，為190.08 U/（g·min），高抗、中抗與中感品種POD活性均高于200U/（g·min），且三者之間沒有顯著差異（P>0.05）。即在豌豆不同抗性品種中，POD活性不隨白粉病抗性強弱呈規(guī)律性變化，POD活性的高低不能反映豌豆白粉病抗性的強弱。

2.6 不同抗性品種PPO 活性差異

從表1中看出，不同抗性品種的PPO活性隨著抗病性的減弱而降低。高抗品種X9002中PPO活性最高，為180 U/（g·s）；高感品種S3008活性最低，99U/（g·s），抗病品種與感病品種間差異極顯著（P<0.01）?？梢奝PO活性與豌豆白粉病抗病性有一定的關(guān)系，可用PPO活性的高低反映豌豆白粉病抗性的強弱。

2.7 不同抗性品種PAL 活性差異

表1顯示不同豌豆品種PAL活性隨著白粉病抗性的減弱而降低。高抗品種X9002的PAL活性最高，為190.65 U/（g·min），與中抗、中感及高感品種表現(xiàn)極顯著差異（P<0.01）；高感品種S3008的PAL活性最低，為77.85U/（g·min），不同抗性品種間PAL活性表現(xiàn)極顯著差異（P<0.01），可用PAL活性反應(yīng)豌豆白粉病抗性水平。

3 小結(jié)與討論

1） 選取4種抗性不同的豌豆品種，測定品種間葉綠素和可溶性糖含量以及超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性變化。結(jié)果表明，葉綠素含量、POD、PPO活性和PAL活性隨對豌豆白粉病抗性的減弱而降低，CAT活性隨豌豆白粉病抗性減弱而升高，SOD活性與豌豆白粉病抗性沒有明顯變化規(guī)律。方差分析結(jié)果顯示，不同抗感病品種間葉綠素含量、PPO活性、PAL活性和CAT活性差異極顯著（P<0.01），因此可以用葉綠素含量、PPO活性、PAL活性和CAT活性來反映豌豆白粉病抗性強弱。

2） 防御酶系統(tǒng)在植物抵御病害中起著非常重要的作用。酚類化合物在植物抗病中起著重要的作用，PPO能夠促進酚類物質(zhì)氧化成為醌或者形成木質(zhì)素，大量木質(zhì)素在受侵染部位合成并積累，抑制病原菌的繁殖，醌類化合物通過鈍化病原菌的呼吸酶，阻礙病原菌繁殖擴散。PPO活性越大，植株對病原菌抑制力越強，即抗病性越強。PAL也是酚代謝的主要酶之一，能催化苯丙氨酸脫氨基后產(chǎn)生肉桂酸，最終轉(zhuǎn)化為木質(zhì)素。PAL活性愈大，酚類合成代謝愈強。本研究發(fā)現(xiàn)，豌豆高抗品種X9002的PPO活性和PAL活性明顯高于感病品種，由于其酚類物質(zhì)氧化程度高，抵御病害能力強，這與在草莓和白菜上的研究中有相似結(jié)論［14～15］。CAT也是植物體內(nèi)重要的酶促防御系統(tǒng)之一，能清除活性氧的膜保護酶類，它能把活性氧轉(zhuǎn)變?yōu)榈突钚晕镔|(zhì)，從而保護細胞膜系統(tǒng)。

3） 本研究所篩選的幾個生理指標(biāo)是否能作為衡量豌豆白粉病抗性的標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)確反應(yīng)不同品種的抗病性，還需進一步接種白粉病菌，在盡可能多的豌豆品種中進行驗證，以期找到在誘導(dǎo)植株發(fā)病前即可通過采集少量葉片測定豌豆抗病性的可靠指標(biāo)。

［1］ 陳群航，鄭益嫩. 福建省豌豆白粉病調(diào)查與防治［J］.福建農(nóng)業(yè)科技，1998，（5）：13-14．

［2］ 彭化賢，姚 革. 我國豌豆地方品種抗白粉病性的研究［J］. 植物病理學(xué)報，1993，（1）：64．

［3］ 林成輝，唐樂塵. 不同豌豆品種對白粉病的抗性特點與防治對策［J］. 中國蔬菜，2002（6）：38-39．

［4］ 王志剛. 豌豆源類型篩選抗病性鑒定與利用評價［J］.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技，2003（1）：12-13

［5］ 陳振洛. 甜豌豆白粉病的發(fā)生與防治［J］. 福建農(nóng)業(yè).2004（2）：20-21．

［6］ 王阿旺，傅俊范，周如軍，等． 草莓白粉病菌對寄主防御酶活性的影響［J］． 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（2）：111-113．

［7］ 楊曉明. 豌豆白粉病研究進展［J］. 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2012（8）：35-37.

［8］ 趙世杰，劉華山，董新純． 植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)［M］．北京：中國農(nóng)業(yè)科技出版社，1998：68-72．

［9］ 鄒 琦. 植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)［M］. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2007：111-112.

［10］ 李合生. 植物生理生化實驗原理和技術(shù)［M］. 北京：高等教育出版社，2000：267-268.

［11］ 王保成，孫萬倉，范惠玲，等． 蕓芥自交親和系與自交不親和系SOD、POD 和CAT 酶活性［J］． 中國油料作物學(xué)報，2006，28（2）：162-165．

［12］ 李合生，李 琳，焦新之． 現(xiàn)代植物生理學(xué)實驗指南［M］． 北京：科學(xué)出版社，1999：164-165．

［13］ 邢會琴，李敏權(quán)，徐秉良，等. 過氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶與苜蓿白粉病抗性的關(guān)系［J］． 草業(yè)科學(xué)，2007，15（4）：376-377．

［14］ 張 梅，劉 瑤，叢慧芳，等. 草莓抗白粉病生理生化指標(biāo)研究［J］. 中國農(nóng)學(xué)通報，2011，27（28）：249-253．

［15］ 劉 琳，侯喜林，王利英，等． 不結(jié)球白菜感染蕪菁花葉病毒后4 種防御酶活性變化及其抗病相關(guān)性［J］． 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，32（3）：14-18．