γ-亞麻酸產(chǎn)生菌的低能離子束誘變選育

劉勝男，王亞洲，石林霞，李市場(chǎng)，古紹彬

(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023)

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γ-亞麻酸產(chǎn)生菌的低能離子束誘變選育

劉勝男，王亞洲，石林霞，李市場(chǎng)，古紹彬

(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023)

為了得到γ-亞麻酸(GLA)高產(chǎn)菌株，以深黃被孢霉As3.3410為出發(fā)菌株，利用氮離子(N+)注入誘變，并采用馬來酰肼抗性篩選和紅四氮唑(TTC)法相結(jié)合對(duì)突變株進(jìn)行篩選。試驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)能量為10 keV時(shí)，最佳氮離子誘變劑量為1.56×1015cm-2；當(dāng)馬來酰肼的添加量為40 mg/L時(shí)，出發(fā)菌株的抑制率為100%；TTC法酶活測(cè)定的最佳條件為：溫度35 ℃、pH為8.4、TTC濃度為8 g/L、反應(yīng)時(shí)間為1 h，以此作為搖瓶初篩的條件。經(jīng)過反復(fù)誘變篩選獲得一株遺傳穩(wěn)定的高產(chǎn)突變株F312，其γ-亞麻酸產(chǎn)量為1 236 mg/L，比出發(fā)菌株(480 mg/L)提高了157.5%。

深黃被孢霉；γ-亞麻酸；低能離子束；馬來酰肼；紅四氮唑

0 引言

部分絲狀真菌微生物含有大量的油脂，具有巨大的商業(yè)生產(chǎn)潛力[1]，微生物油脂近年來已成為研究熱點(diǎn)。γ-亞麻酸(GLA)因具有重要的生理學(xué)功能而倍受人們的關(guān)注，它是合成前列腺素的前體物質(zhì)，對(duì)一些疾病有積極的預(yù)防和治療作用，如高血壓、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[2]、多發(fā)性硬化癥[3]、精神分裂癥[4]、異位性濕疹[5]、經(jīng)前綜合癥[6]等。文獻(xiàn)[7-8]指出γ-亞麻酸可以作為選擇性抗癌劑。γ-亞麻酸是人體必需的脂肪酸，像維生素一樣不能在人體內(nèi)合成，必需從食物中攝取。而市售富含γ-亞麻酸的藥品、保健品及食品大部分是從植物中提取，如E膠丸、保心乳等。由于月見草等富含γ-亞麻酸的植物易受氣候環(huán)境條件的影響，產(chǎn)量不穩(wěn)定，精煉成本高，無法滿足市場(chǎng)需求，人們開始探索微生物發(fā)酵法生產(chǎn)γ-亞麻酸。在富含γ-亞麻酸的產(chǎn)油微生物育種里主要采用物理或化學(xué)誘變的方法改變遺傳物質(zhì)，再測(cè)定突變株發(fā)酵參數(shù)挑選并保存正突變菌株[9-10]。這種篩選方法工作量大，效率低。由γ-亞麻酸在微生物體內(nèi)的合成途徑可知：γ-亞麻酸是由脂肪酸脫氫酶系催化油酸、亞油酸等脂肪酸脫氫去飽和而產(chǎn)生的[11]；脂肪酸脫氫酶是深黃被孢霉合成GLA的關(guān)鍵酶，而脫氫酶的活性受到馬來酰肼等物質(zhì)的抑制[12]。紅四氮唑(TTC)是一種氧化劑，從脫氫酶接受電子后，自身由無色被還原成紅色的三苯基甲臜(TF)，從而可以表示細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶活性。通過TTC法測(cè)定脂肪酸脫氫酶酶活可間接表示深黃被孢霉生產(chǎn)GLA的能力。本文以深黃被孢霉As3.3410為出發(fā)菌株，利用低能離子修飾技術(shù)對(duì)菌株進(jìn)行誘變，并采用馬來酰肼與TTC法篩選GLA高產(chǎn)突變菌株。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

深黃被孢霉As3.3410(購(gòu)于廣東微生物保藏中心)。

保藏活化培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖80 g/L，蛋白胨4 g/L，酵母膏5 g/L，KH2PO42 g/L，(NH4)2SO41.5 g/L，NaCl 1 g/L，MgSO42 g/L，pH6.0。115 ℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖100.90 g/L，KNO31.57 g/L，乙酸鈉3.42 g/L，檸檬酸鈉4.56 g/L，酵母膏3.75 g/L，KH2PO42.25 g/L，MgSO47H2O 0.6 g/L，CaCl20.30 g/L，F(xiàn)eSO40.15 g/L，ZnSO40.20 g/L。115 ℃滅菌30 min。

活化培養(yǎng)：轉(zhuǎn)接斜面后置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)7 d，4 ℃保藏。

種子培養(yǎng)：用接種環(huán)挑取一環(huán)斜面孢子，接種于種子培養(yǎng)基中(250 mL的三角瓶裝液量為50 mL)，28 ℃、190 r/min搖床培養(yǎng)1 d。

發(fā)酵培養(yǎng)：吸取5 mL種子液接種于50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中(250 mL的三角瓶裝液量為50 mL)，28 ℃、190 r/min搖床培養(yǎng)7 d。

1.2 菌種誘變與篩選

1.2.1 離子束誘變

用5 mL無菌生理鹽水洗脫斜面孢子，制成孢子懸液，然后梯度稀釋至10-5(孢子懸液濃度大約為106mL-1)。取0.1 mL稀釋孢子懸液均勻涂布于無菌平皿上，無菌風(fēng)干后進(jìn)行氮離子注入。在注入機(jī)(中國(guó)科學(xué)院離子束生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研究制備的LZD 900 多功能離子注入機(jī))上，選用10 keV、15 keV兩個(gè)能量級(jí)別的氮離子(N+)，以不同劑量的氮離子(N+)對(duì)風(fēng)干過的孢子平板進(jìn)行注入。將真空未接受離子注入的處理作為真空對(duì)照[13]。

氮離子注入后立即在超凈工作臺(tái)上用新鮮無菌生理鹽水洗脫，進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?，并涂布于PDA培養(yǎng)基平板上。每個(gè)誘變梯度做3個(gè)平行，28 ℃培養(yǎng)3 d，平板上長(zhǎng)出單菌落后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率。

存活率=(誘變處理后菌落總數(shù)/對(duì)照中的菌落總數(shù))×100%。

1.2.2 馬來酰肼抗性篩選

取0.2 mL誘變后稀釋到適當(dāng)濃度的孢子懸液，均勻涂布于含有40 mg/L馬來酰肼的PDA培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)3 d；待長(zhǎng)出菌落后，挑取菌落大、生長(zhǎng)快的菌落接種到PDA斜面保藏培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)7 d，4 ℃保藏備用。

1.2.3 脂肪酸脫氫酶活性測(cè)定—TTC法篩選

新鮮菌體過濾收集后用蒸餾水洗滌兩遍，取1 g菌體置于具塞試管中，加入2 mL質(zhì)量濃度為8 g/L TTC溶液，Tris-HCl(pH8.4) 2 mL，35 ℃于暗處放置1 h。菌體用蒸餾水洗滌兩遍后研磨成勻漿，用6 mL氯仿室溫提取TF，取氯仿層，用分光光度計(jì)在485 nm波長(zhǎng)下測(cè)定染色程度[14]。

1.3 生物量測(cè)定與油脂的提取

生物量測(cè)定：將一定體積(V)發(fā)酵液過濾后用蒸餾水洗滌兩遍，得到濕菌體;然后置于電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，于70 ℃下烘干至恒質(zhì)量，測(cè)得干菌體的質(zhì)量(W)。

生物量(g/L)：W0=W/V。

油脂的提?。簩⒏删w碾碎后稱取1 g，加入4 mol/L的鹽酸10 mL，振蕩混勻；室溫放置30 min后，沸水浴5 min；-20 ℃速冷20 min左右，加入氯仿-甲醇(v/v=1∶1)混合液20 mL，充分振蕩后，4 000 r/min離心20 min；棄上清，加入質(zhì)量濃度為1 g/L NaCl溶液20 mL，混勻，4 000 r/min離心；棄上清，氯仿?lián)]發(fā)后得到油脂，稱量所得油脂的質(zhì)量(W1)[15-16]。

產(chǎn)油量(g/L)：W2=W1×W0。

含油量：C=(W2/W0)×100%。

1.4 油脂脂肪酸成分分析

1.4.1 油樣預(yù)處理

取0.2 g油脂樣品置于具塞試管中，加入石油醚-乙醚(v/v= 4∶3)混合溶劑5 mL，振蕩溶解;再加入物質(zhì)的量濃度為0.5 mol/L的KOH-甲醇溶液4 mL，振蕩1 min;放置10 min后加入1 mL蒸餾水，靜置30 min待其分層，取上清液進(jìn)樣[17]。

1.4.2 氣象色譜條件

選用美國(guó)安捷倫7890A氣象色譜儀，Agilent HP-519091J-413(30 mm×0.32 mm×0.25 μm)氣相色譜柱；氫火焰離子化(FID)檢測(cè)器。載氣為高純氮?dú)?，氣體模式為恒流模式，流量為1 mL/min，尾吹氣(氮?dú)?流量為30 mL/min；H2流量為30 mL/min，空氣流量為400 mL/min。進(jìn)樣量為0.5 μL，分流比(v/v)為50∶1。進(jìn)樣口溫度為250 ℃，檢測(cè)器溫度為260 ℃。柱溫采用三級(jí)程序升溫：初溫100 ℃，保持2 min；然后以17 ℃/min升溫至200 ℃，保持4.7 min；再以40 ℃/min升溫至240 ℃，保持15 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 低能離子修飾技術(shù)對(duì)菌株的影響

低能離子束誘變有著特殊的作用過程和效應(yīng)，其先后經(jīng)歷物理、化學(xué)和生物學(xué)3個(gè)階段，最終引發(fā)終點(diǎn)生物學(xué)效應(yīng)[18]。低能離子注入技術(shù)具有突變率高和突變譜寬的特點(diǎn)，不同能量和不同劑量的離子束作用于微生物細(xì)胞有著不同的效應(yīng)，深黃被孢霉的存活率與氮離子的能量和劑量的關(guān)系如表1所示。

表1 存活率與氮離子能量和劑量之間的關(guān)系

突變率的高低與誘變的存活率密切相關(guān)，一般當(dāng)菌種誘變的存活率為20%～30%時(shí)，突變率最高。表1中，當(dāng)?shù)x子的能量為15 keV時(shí)，存活率均在20%以下；當(dāng)?shù)x子的能量為10 keV時(shí)，存活率在10%～30%;而當(dāng)?shù)x子誘變劑量為1.56×1015cm-2時(shí),深黃被孢霉的存活率為26.3%。所以試驗(yàn)選用10 keV，離子劑量為1.56×1015cm-2的氮離子作為誘變處理的誘變劑。

2.2 油脂高產(chǎn)菌株的篩選

微生物誘變選育是一種繁瑣而復(fù)雜的過程，往往耗費(fèi)大量的精力也篩選不到理想的菌株。為了提高篩選效率，本文對(duì)誘變后菌株首先在平板上進(jìn)行馬來酰肼篩選，除去大量的負(fù)突變及未突變菌株。脂肪酸脫氫酶是合成GLA的關(guān)鍵酶，在發(fā)酵后采用TTC法測(cè)定菌種的脂肪酸脫氫酶的活性，進(jìn)一步去除脂肪酸脫氫酶活性不強(qiáng)、GLA生產(chǎn)能力弱的菌種，留下GLA生產(chǎn)能力強(qiáng)的菌種。

2.2.1 馬來酰肼抗性篩選

GLA是由一系列脂肪酸脫氫酶催化油酸、亞油酸等脂肪酸脫飽和而生成的，而脂肪酸脫氫酶的活性會(huì)受到馬來酰肼的抑制，使其不能合成正常生理活動(dòng)所必需的GLA[19]。不同濃度的馬來酰肼對(duì)出發(fā)菌株生長(zhǎng)的抑制效果不同。表2為馬來酰肼添加量與出發(fā)菌株深黃被孢霉As3.3410存活率及菌落直徑的關(guān)系。從表2可以看出：當(dāng)馬來酰肼添加量小于40 mg/L時(shí)，深黃被孢霉的菌落存活率無顯著變化，菌落直徑隨添加量的增加而減??；當(dāng)添加量大于40 mg/L時(shí)，幾乎不形成菌落，抑制率幾乎達(dá)到100%。因此，選擇40 mg/L的馬來酰肼作為篩選劑加入平板培養(yǎng)基中，初步淘汰脂肪酸脫氫酶酶活低或GLA產(chǎn)量低、不足以維持菌株正常生長(zhǎng)的突變株，使平板上只有正突變的菌株得以生長(zhǎng)，縮小后期篩選的范圍，提高篩選效率。

表2 馬來酰肼添加量與出發(fā)菌株深黃被孢霉As3.3410存活率及菌落直徑的關(guān)系

2.2.2 TTC法測(cè)定脂肪酸脫氫酶活性

紅四氮唑(TTC)法廣泛用于植物細(xì)胞及細(xì)菌的活力測(cè)定。脂肪酸脫氫酶是深黃被孢霉中合成GLA的關(guān)鍵酶，其活力的大小可間接表示細(xì)胞合成GLA能力的強(qiáng)弱。將TTC法用于深黃被孢霉菌絲體染色，以染色程度表示細(xì)胞內(nèi)脂肪酸脫氫酶的活性[20]。通過對(duì)TTC法染色條件pH、溫度及TTC濃度的優(yōu)化，來確定最佳染色條件，結(jié)果如圖1所示，其中，OD485為樣品在485 nm時(shí)的吸光度值。從圖1a中可以看出：隨著TTC濃度的增加，菌絲體的染色程度逐漸加深；在TTC濃度為8 g/L時(shí)菌絲體染色程度最深，隨后又有所下降。從圖1b中可以看出：Tris-HCL緩沖溶液pH在8.4之前，隨著pH的升高，菌絲體染色萃取液的吸光度在增加；當(dāng)Tris-HCL緩沖溶液的pH為8.4時(shí)，菌絲體染色程度最深；當(dāng)pH大于8.4時(shí)，吸光度又呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。由此可知,脂肪酸脫氫酶的酶活測(cè)定的最適pH值為8.4。從圖1c中可以看出：反應(yīng)溫度低于35 ℃時(shí)，隨著反應(yīng)溫度的升高，吸光度值逐漸變大；當(dāng)反應(yīng)溫度高于35 ℃時(shí)，吸光度值又呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。以此得出脂肪酸脫氫酶的最適反應(yīng)溫度為35 ℃。確定脂肪酸脫氫酶酶活測(cè)定的最佳條件為：TTC溶液的濃度為8 g/L，最適pH為8.4，最適溫度為35 ℃，反應(yīng)時(shí)間為1 h。

圖1 TTC濃度、pH、溫度對(duì)脂肪酸脫氫酶活性的影響

2.3 誘變篩選結(jié)果

經(jīng)過反復(fù)的誘變→馬來酰肼平板抗性篩選→發(fā)酵第4天的脂肪酸脫氫酶酶活測(cè)定篩選，獲得5株高產(chǎn)菌株，其GLA產(chǎn)量及脂肪酸脫氫酶酶活(OD485)如表3所示。表3中，脂肪酸脫氫酶酶活從小到大依次為：As3.3410

表3 突變株與出發(fā)菌株比較表

注:菌種As3.3410為原始出發(fā)菌株，F(xiàn)208、F217、F369、F338、F312為經(jīng)過反復(fù)誘變所獲得的高產(chǎn)菌株。

圖2 發(fā)酵過程As3.3410與F312主要參數(shù)比較

2.4 發(fā)酵特性

本文對(duì)高產(chǎn)菌株的發(fā)酵特性進(jìn)行了初步研究(見圖2)。從圖2可以看出：F312及出發(fā)菌株As3.3410發(fā)酵過程中第3天到第8天的脂肪酸脫氫酶酶活的變化及GLA產(chǎn)量的變化。從第3天到第7天脂肪酸脫氫酶酶活隨著時(shí)間的增加呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)；而到第8天有所下降，但整個(gè)發(fā)酵周期中突變株F312的脂肪酸脫氫酶酶活始終比出發(fā)菌株As3.3410的高。GLA產(chǎn)量隨發(fā)酵時(shí)間的增加而增長(zhǎng)，在脂肪酸脫氫酶酶活較高時(shí)，GLA的生產(chǎn)速率加快，在第7天時(shí)趨于穩(wěn)定。通過用氣相色譜對(duì)出發(fā)菌株及高產(chǎn)菌株成分進(jìn)行分析(見圖3)，可知突變株F312的GLA產(chǎn)量較出發(fā)菌株深黃被孢霉As3.3410的GLA產(chǎn)量有大幅度提高。

圖3 GLA氣相色譜圖

3 結(jié)論

通過離子束誘變及抗性篩選的研究，找出了獲得高產(chǎn)GLA深黃被孢霉的誘變篩選體系，該誘變篩選體系快速高效，可以對(duì)誘變后的突變株進(jìn)行定向篩選，最終獲得了一株高產(chǎn)突變株F312。試驗(yàn)結(jié)果如下：(1)采用10 keV的氮離子(N+)進(jìn)行誘變，最佳離子束誘變劑量為1.56×1015cm-2。(2) 馬來酰肼的最佳篩選質(zhì)量濃度為40 mg/L；TTC法酶活測(cè)定的條件為：溫度35 ℃、pH8.4、TTC質(zhì)量濃度8 g/L、反應(yīng)時(shí)間1 h。(3) 通過反復(fù)的誘變篩選，最終篩選出一株遺傳性穩(wěn)定的高產(chǎn)突變株F312，GLA產(chǎn)量達(dá)到1 236 mg/L，比出發(fā)菌株(480 mg/L)提高了157.5%。突變株F312發(fā)酵過程中脂肪酸脫氫酶活性和GLA產(chǎn)量均比出發(fā)菌株高，具有一定的商業(yè)研究?jī)r(jià)值，實(shí)驗(yàn)室將進(jìn)一步進(jìn)行小罐發(fā)酵，挖掘其商業(yè)生產(chǎn)價(jià)值。

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國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(U1304307);河南科技大學(xué)大學(xué)生研究訓(xùn)練計(jì)劃基金項(xiàng)目(2014121)

劉勝男(1991-),女,河南周口人,碩士生;李市場(chǎng)(1978-),男,河南洛陽人,副教授,博士,碩士生導(dǎo)師,主要研究方向?yàn)槲⑸镉N.

2014-11-12

1672-6871(2015)03-0076-05

Q93

A