希望I號液對大鼠吸入臭氧肺損傷的保護作用研究

張微 劉甜甜 祖承哲 彭金娥 馮麗莉 王湘 張燕 蔡大勇 王玥琦

臭氧在全球和區(qū)域大氣環(huán)境變化中扮演著重要角色，作為城市污染大氣中的重要污染物，引發(fā)很強的環(huán)境效應［1］。而且，臭氧還會跟其他污染物聯(lián)合作用，臭氧加強PM 2.5 對人體的危害［2］。希望Ⅰ號液由中藥枸杞子和大棗組成，二者均有抗氧化增強免疫力的作用［3-4］，但未出現(xiàn)其防治臭氧損傷的報道。本研究采用大鼠吸入臭氧模型，灌胃給予希望I 號液，觀察希望Ⅰ號液對臭氧所致肺損傷的保護功能。

1 材料與方法

1.1 試藥

希望I 號液由枸杞子11 g、大棗6 g 組成(出自《太平圣惠方》枸杞子散)生藥飲片均購自北京同仁堂藥店，由北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院中醫(yī)藥基礎理論與關鍵技術中心配制;維生素E(Vitimin E，VE)軟膠囊(生產批號:20130104)由青島雙鯨藥業(yè)有限公司生產。

1.2 動物

健康成年SD 雄性大鼠48 只，體質量220 ～253 g［北京維通利華公司，實驗動物使用許可證號:SCXK(京)2012-0001］。

1.3 儀器與試劑

臭氧發(fā)生器(山東精工好醫(yī)生儀器有限公司);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)(生產批號:20130406)、過氧化脂質(lipid peroxide，LPO)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、測定試劑盒(批號:20140522)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)(生產批號:20130326)均購自南京建成生物工程研究所;肺表面活性蛋白-A(surfactant protein A，SP-A)抗體購自santacurz 公司;羊抗兔鏈霉親和素-生物素復合物(strept avidin-biotin complex，SABC)免疫組化試劑盒購于武漢博士徳公司。

1.4 動物分組及模型建立

48 只雄性SD 大鼠，隨機分為6 組，即對照組、模型組、維生素E 組、希望I 號液低、中、高劑量組各8 只。

除對照組外，其余各組都放入自制臭氧染毒柜中暴露臭氧(1.2 ±0.2 ppm)。所有老鼠自由飲食飲水。灌胃劑量:維生素E 組為0.0135 g/kg，希望I號液低、中、高劑量組為0.045、0.090、0.180 g/kg，臭氧造模同時給藥。45 天結束造模，處死各組動物。

1.5 血清中SOD、LPO、CAT、GSH-Px 檢測

腹主動脈取血，離心吸取血清，-80℃凍存，測定前取出血清解凍，按照試劑盒說明書方法測定血清中SOD、LPO、CAT 和GSH-Px。

1.6 肺組織病理學觀察檢測

將麻醉后的大鼠的胸腔打開，取左肺葉，10%福爾馬林固定48 小時，PBS 清洗，修塊，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋，4 μm 切片，脫蠟透明后，HE 染色［5］、Masson 染色，光學顯微鏡下觀察。計量膠原纖維面積和總面積，計算膠原纖維面積比。

1.7 免疫組化檢測肺組織SP-A 含量

將石蠟切片脫蠟后進行SABC 法免疫組化染色。石蠟切片脫蠟、水化后，3%H2O2避光孵育1 小時，置于枸櫞酸緩沖液中微波抗原修復，BSA 封閉后滴加一抗4℃過夜，洗脫后滴加二抗37℃孵育30分鐘，SABC 37℃孵育30 分鐘后DAB 顯色，蘇木素復染核，中性樹膠封片，掃描。采用Image Pro Plus軟件對圖像進行處理。隨機選取5 視野計量陽性細胞面積(A)、平均光密度值(D)、積分光密度值(IOD)，計量陽性表達量。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 希望I 號液降低臭氧吸入大鼠血清LPO 含量

血清LPO 經F-text 分析后結果如表1所示(F =4.034，P ＜0.01)，(1)與對照組比較，模型組大鼠血清中的LPO 含量顯著升高(P ＜0.01)。(2)與模型組比較，希望I 號液各治療組大鼠血清LPO 含量顯著降低，有差異性(P ＜0.05，P ＜0.01)。(3)將模型組作為給藥零劑量組，直線相關回歸顯示希望I 號液的用藥劑量與大鼠血清LPO 含量之間高度負相關(y=-0.0314x +0.5317，R2=0.7597，P ＜0.05);提示希望I 號液降低臭氧吸入大鼠血清過氧化脂質有劑量依賴特征。

表1 希望I 號液對大鼠血清中SOD、LPO、CAT、GSH-Px 含量(±s，n=8)

表1 希望I 號液對大鼠血清中SOD、LPO、CAT、GSH-Px 含量(±s，n=8)

注:與對照組比較，aP ＜0.05 與模型組比較，bP ＜0.05。

組別 LPO(nmol/L) SOD(U/mL) CAT(U/mL) GSH-Px(μmol/L)對照組 12.57 ±1.39b 78.43 ±7.54b 60.82 ±6.34b 91.42 ±3.40 b模型組 17.46 ±1.42a 55.60 ±2.27a 28.73 ±4.28a 76.00 ±1.22a維生素E 組 14.87 ±1.44 62.24 ±2.40a 47.88 ±6.93ab 94.16 ±3.19ab希望I 號液低劑量組 14.27 ±3.54b 56.37 ±3.33a 36.41 ±2.65a 89.09 ±0.91b中劑量組 13.35 ±1.37b 75.04 ±5.79b 50.70 ±5.89b 89.55 ±1.50b高劑量組 12.62 ±2.35b 69.06 ±7.02ab 48.84 ±6.38ab 91.17 ±2.89 b

2.2 希望I 號液回升臭氧吸入大鼠血清SOD 活性

血清SOD 經F-text 分析后結果如表1所示(F=15.177，P ＜0.01)，(1)與對照組比較，模型組大鼠血清SOD 活力含量顯著降低(P ＜0.01)。(2)與模型組比較，希望I 號液中、高劑量治療組大鼠血清SOD 活力回升，差異具有顯著性(P ＜0.01)，低劑量治療組SOD 活力略有增高，但無統(tǒng)計學差異。

2.3 希望I 號液回升臭氧吸入大鼠血清CAT 活性

血清CAT 經F-text 分析后結果如表1所示(F=16.579，P ＜0.01)，(1)與對照組比較，模型組大鼠血清CAT 活力含量顯著降低(P ＜0.01)。(2)與模型組比較，希望I 號液中、高劑量給藥組大鼠血清CAT 活力回升，差異具有顯著性(P ＜0.01)。低劑量治療組CAT 活力略有增高，但無統(tǒng)計學差異。(3)將模型組作為給藥零劑量組，直線相關回歸顯示希望I 號液的用藥劑量與大鼠血清CAT 活力之間高度正相關(y=0.0062x-0.176，R2=0.707，P ＜0.05);提示希望I 號液回升臭氧吸入大鼠血清CAT 具有劑量依賴特征。

2.4 希望I 號液回升臭氧吸入大鼠血清GSH-Px 活性

血清GSH-Px 經F-text 分析后結果如表1所示(F =53.328，P ＜0.01)，(1)與對照組比較，模型組大鼠血清GSH-Px 活力含量顯著降低(P ＜0.01)。(2)與模型組比較，希望I 號液各治療組大鼠血清GSH-Px 活力回升，差異具有顯著性(P ＜0.01)。

2.5 希望I 號液緩解臭氧吸入大鼠肺組織損傷

肺組織HE 染色結果如圖1所示，對照組大鼠的肺組織中肺泡間隔均勻;模型組出現(xiàn)了明顯的肺泡擴張并伴有塌陷現(xiàn)象，肺泡大小不一;維生素E組肺泡結構完整，未出現(xiàn)肺泡擴張現(xiàn)象;低、中劑量給藥組肺泡擴張現(xiàn)象有所緩解，肺泡大小不均勻;高劑量給藥組與維生素E 組相似，肺泡大小比較均勻。

圖1 各組大鼠肺組織HE 染色切片(×200)

2.6 希望I 號液回降大鼠肺組織膠原纖維沉積

如圖2所示肺組織膠原纖維經Masson 染色顯示為墨綠色。數(shù)據(jù)經Welch 方差分析后如表2所示(F' =30.504，P ＜0.01)，對照組大鼠的肺組織中氣管周圍膠原纖維較薄。(1)與對照組比較，模型組大鼠肺組織膠原纖維含量上升，差別有顯著性(P ＜0.01)。(2)與模型組比較，各治療組大鼠肺組織膠原纖維含量回降，差別有顯著性(P ＜0.01)。(3)將模型組作為給藥零劑量組，直線相關回歸顯示希望I號液的用藥劑量與大鼠肺組織原位SP-A 含量之間高度正相關(y =-1.5757x +0.1855，R2=0.6616，P ＜0.05)，提示希望I 號液保護臭氧誘導肺損傷具有劑量依賴特征。

圖2 各組大鼠肺組織Masson 染色切片(×200)

2.7 希望I 號液回升大鼠肺損傷原位表面活性物質

如圖4所示SP-A 表達陽性為黃褐色。對照組SP-A 表達量較多，主要分布于肺泡Ⅱ型細胞，少量位于巨噬細胞和支氣管上皮細胞中。SP-A 形態(tài)劑量經Welch 統(tǒng)計后結果顯示(表2)(F' =24.022，P ＜0.01)，希望I 號液顯著回升大鼠肺損傷原位表面活性物質。(1)與對照組比較，模型組大鼠肺組織原位SP-A 顯著下降，差別有顯著性(P ＜0.01)。(2)與模型組比較，各治療組大鼠肺組織原位SP-A顯著回升，差別有顯著性(P ＜0.01)。(3)將模型組看做給藥零劑量組，直線相關回歸顯示希望I 號液的用藥劑量與大鼠肺組織原位SP-A 含量之間高度正相關(y = 0.0062x- 0.4186，R2= 0.7808，P ＜0.05);提示希望I 號液保護嗅氧誘導肺損傷具有劑量依賴特征。

表2 希望I 號液緩解大鼠肺損傷(±s，n=8)

表2 希望I 號液緩解大鼠肺損傷(±s，n=8)

注:與對照組比較，aP ＜0.01;與模型組比較，bP ＜0.01

組別 膠原纖維面積比 SP-A 表達量對照組 4.10% ±1.08% b 88.11 ±7.77 b模型組 12.52% ±3.57% a 66.20 ±7.89a維生素E 組 4.34% ±1.68% b 88.03 ±9.99b希望I 號液低劑量組 6.33% ±1.37% b 78.28 ±8.43ab中劑量組 4.23% ±0.30% b 88.69 ±7.80b高劑量組 4.03% ±0.56% b 88.37 ±8.44 b

圖4 各組大鼠肺組織SP-A 免疫組化染色結果(×400，×800)

3 討論

隨著社會經濟發(fā)展，環(huán)境污染問題越來越受到人們的普遍重視。臭氧作為夏季的首要污染物［6］，其危害作用也受到人民的廣泛關注。臭氧可造成肺組織損傷，引發(fā)哮喘、支氣管肺炎等肺部疾?。?-8］。有少量清熱解毒、益氣活血類［9-10］中藥緩解肺損傷報道，但中藥緩解臭氧所致肺損傷的文獻甚少。希望Ⅰ號液中枸杞子可滋補肝腎、益精明目，大棗具有補中益氣、養(yǎng)血安神功能。本品從中醫(yī)脾腎論治保護肺功能，符合中醫(yī)臨床培土生金、金水相生治則，達到增強機體抵御外界傷害能力，從而為臨床防治肺損傷提供實驗依據(jù)。

SOD、CAT、GSH-Px 是抗氧化酶系統(tǒng)中重要組成部分。SOD、GSH-Px 水平反映機體氧化-抗氧化平衡，機體受到臭氧染毒后，這種平衡被打破，出現(xiàn)SOD、GSH-Px 活力降低的現(xiàn)象，SOD、GSH-Px 在臭氧導致氧化應激反應中起防御作用［11-12］。SOD、CAT、GSH-Px 活力下降，可能是由于臭氧造成DNA 損傷有關［2］。同時，根據(jù)LPO 結果顯示，經過臭氧染毒的模型組含量明顯增高，與文獻報道相一致［13］。臭氧導致肺纖維化和抗氧化物酶活性降低，肺損傷模型成功。

希望Ⅰ號液各給藥組LPO 水平均低于模型組，并回升抗氧化物酶活性，希望Ⅰ號液可能通過加速過氧化物的代謝從而減輕過氧化反應對機體的損傷。

肺組織形態(tài)學觀察表明:模型組巨噬細胞數(shù)量增多出現(xiàn)肺纖維化病灶，膠原纖維沉積，說明臭氧導致了大鼠肺部組織損傷。應用希望Ⅰ號液后，肺組織炎性細胞減少，纖維化現(xiàn)象減輕，從而有效地保護大鼠肺組織。

研究顯示SP-A 由肺泡Ⅱ型細胞分泌，其主要作用維持肺泡結構，在肺損傷時參與抗氧化反應，具有一定的防御功能與免疫調節(jié)作用［14］。臭氧破壞機體的氧化平衡，可見模型組SP-A 免疫組化陽性表達減少。希望Ⅰ號液中、高劑量組和維生素E組的SP-A 表達量，與對照組相比無統(tǒng)計學差異，說明希望Ⅰ號液中、高劑量組和維生素E 組有很好的保護肺泡的能力。

綜上所述，希望Ⅰ號液對于吸入臭氧導致的肺損傷具有保護作用，升高抗氧化物酶活性，減輕肺纖維化。而希望Ⅰ號液保護臭氧所致大鼠肺損傷的機制，可能是通過誘導抗氧化物酶激活，保護肺泡Ⅱ型細胞從而發(fā)揮保護作用。

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