銀杏葉提取物通過Wnt減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷

沈明志，李冬云，范 利，付振虹，韓寶石，李 可，胡 鑫，劉海斌，薛 橋*

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銀杏葉提取物通過Wnt減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷

沈明志1,2，李冬云1，范 利2，付振虹1，韓寶石1，李 可1，胡 鑫1，劉海斌3，薛 橋1*

（1解放軍總醫(yī)院海南分院心內(nèi)科，三亞 572013；2解放軍總醫(yī)院老年心內(nèi)科，北京 100853；392474部隊醫(yī)院內(nèi)科，三亞 572018）

探討銀杏葉提取物（EGB）對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的影響以及Wnt通路在其中的作用。取1d齡乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)后，應(yīng)用衣霉素（Tm）構(gòu)建心肌細(xì)胞損傷模型，隨機(jī)分為對照組、Tm組、Tm＋EGB組、EGB組。噻唑藍(lán)（MTT）比色法檢測心肌細(xì)胞存活率，雙熒光報告系統(tǒng)檢測Wnt活性，實(shí)時定量PCR檢測C-myc、CyclinD1基因水平。Tm降低了心肌細(xì)胞存活率，EGB處理改善了心肌細(xì)胞存活率；與對照組比較，Tm組Wnt活性顯著降低，與Tm組比較，Tm＋EGB組Wnt活性、C-myc、CyclinD1水平明顯升高，而應(yīng)用Wnt抑制劑分泌型卷曲相關(guān)蛋白（sFRP），Wnt活性顯著下調(diào)，C-myc、CyclinD1水平下調(diào)，EGB的保護(hù)作用顯著下降。EGB可以抑制Tm誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能與改善Wnt信號有關(guān)。

銀杏葉提取物；衣霉素；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；心肌細(xì)胞；Wnt

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)參與了膜蛋白與分泌蛋白的折疊過程，在細(xì)胞維持功能與存活過程中扮演了重要角色[1,2]。糖剝奪、病毒感染、錯誤折疊或未折疊蛋白的增加將會干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能，從而誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）[3,4]。ERS是機(jī)體對外界或自身反應(yīng)的一種自我保護(hù)機(jī)制，以維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞生存，但過強(qiáng)或持續(xù)時間過長的ERS可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5,6]。

研究表明，Wnt信號通路在抗凋亡過程中扮演了重要角色[7?9]。然而，Wnt信號在ERS過程中扮演的作用迄今尚無報道。

銀杏葉又名白果葉，是從銀杏科植物銀杏的干燥葉提取的有效成分，主要化學(xué)成分包括銀杏內(nèi)酯及黃酮苷，具有保護(hù)心血管、改善微循環(huán)的功效[10,11]，但機(jī)制尚不完全清楚。

本實(shí)驗擬應(yīng)用衣霉素（tunicamycin，Tm）誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞損傷模型[12]，觀察銀杏葉提取物（extracts ofleaf，EGB）對衣霉素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的影響，以及對Wnt信號通路表達(dá)水平的影響及意義，為EGB防治ERS相關(guān)性疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物和試劑

1日齡SD乳鼠（解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)動物實(shí)驗中心）；EGB（中國藥科大學(xué)植化教研室）；杜爾貝科改良培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM，Gibco公司）；胎牛血清（四季青公司）；膠原酶、噻唑藍(lán)（MTT）雙熒光報告系統(tǒng)（Promega公司）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、5?溴?2?脫氧核苷尿嘧啶（BrdU）（Sigma公司）；實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測試劑盒（TaKaRa公司）。

1.2 原代培養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞

方法同文獻(xiàn)[13]，取1d齡乳鼠心臟，冰磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗3次，剔除心房以及大血管等成分，將其剪成小米粒大小組織塊，用Ⅰ型膠原酶（1mg/ml）分次消化（3～5min/次）。收集心肌細(xì)胞懸液，加入含10%血清DMEM培養(yǎng)基中以終止消化，1000轉(zhuǎn)/min離心5min，棄上清。重懸細(xì)胞，用滴管吹打至單細(xì)胞懸液，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾后接種于培養(yǎng)瓶，并在孵箱中差速貼壁1h。加入BrdU母液，使其終濃度為100μmol/L。37℃CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24h后，更換含BrdU的DMEM培養(yǎng)液，37℃繼續(xù)孵育培養(yǎng)48h，備用。

1.3 藥物處理和實(shí)驗分組

實(shí)驗分對照組、Tm組、Tm+EGB組和EGB組。對照組：單純培養(yǎng)液，不給予任何藥物；Tm組：培養(yǎng)液中加100ng/ml Tm；Tm+EGB組：培養(yǎng)液中加100ng/ml Tm和20、50、100μg/ml EGB；EGB組：培養(yǎng)液中加50μg/ml EGB。

1.4 MTT比色法檢測心肌細(xì)胞存活率

心肌細(xì)胞接種于96孔板，經(jīng)無血清培養(yǎng)基處理后，隨機(jī)分組。經(jīng)過相應(yīng)處理，每孔加入5mg/ml MTT母液10μl，37℃孵育4 h。吸棄上清，加入150μl DMSO以溶解沉淀，選擇490nm波長，振蕩3min。檢測各孔吸光度（）值（值與活細(xì)胞數(shù)呈正比），實(shí)驗重復(fù)5次。

1.5 實(shí)時定量PCR

提取各組細(xì)胞總RNA，應(yīng)用Quanti Tect Reverse Transcription Kit試劑盒進(jìn)行細(xì)胞cDNA合成。使用ABI prism 7500實(shí)時定量PCR儀，應(yīng)用the Power SYBR Green PCR Master Mix進(jìn)行實(shí)時定量PCR熒光檢測。β-actin作為內(nèi)參照。c-myc正義鏈：5'-CCTCAGTGGTCTTCCC-CTAC-3'，反義鏈：5'-CTGGAGCATTTGCGGTTG-3'；cyclinD1正義鏈：5'-GAGGAGCAGAAGTGCGAAGA-3'，反義鏈：5'- GGAGGGTGGGTTGGAAAT-3'；β-actin正義鏈：5'-AGGGAAATCGTGCGTGAC-3'，反義鏈：5'-CTGGAAGGTGGACAGTGAG-3'。

1.6 H9C2心肌細(xì)胞系培養(yǎng)及Topflash活性檢測

H9C2心肌細(xì)胞系（ATCC公司），應(yīng)用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在5% CO2孵箱中37℃情況下進(jìn)行培養(yǎng)。取第三代以后細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗。

檢測Topflash活性方法同前[14]，應(yīng)用Lipo2000將Topflash和pRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染36h后，應(yīng)用裂解緩沖液裂解細(xì)胞，應(yīng)用雙熒光系統(tǒng)報告試劑盒分析Topflash活性。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度EGB對Tm誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞損傷的影響

將對照組心肌細(xì)胞存活率定義為100%。與對照組比較，Tm組心肌細(xì)胞存活率顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）；與Tm組相比，Tm（100ng/ml）+EGB（20μg/ml）組心肌細(xì)胞存活率輕度升高，而Tm+EGB（50或100μg/ml）心肌細(xì)胞存活率顯著升高，呈濃度依賴性升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05，圖1）。本部分實(shí)驗表明，EGB能夠減輕Tm誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

圖1 EGB對Tm誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞存活率的影響

Figure 1 Effects of EGB on Tm-induced cardiomyocytes viability

EGB: extracts ofleaf; Tm: tunicamycin. Compared with control group,*<0.05; compared with Tm group,#<0.05

2.2 EGB對Tm誘導(dǎo)Wnt信號通路的影響

為了研究Wnt信號通路在EGB改善心肌細(xì)胞存活率中的作用，我們應(yīng)用Topflash雙熒光報告系統(tǒng)轉(zhuǎn)染H9C2心肌細(xì)胞系，檢測Wnt活性。結(jié)果表明，Tm可以顯著降低Topflash活性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）；而加用EGB可以顯著改善Topflash活性，與Tm組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）。與對照組相比，單用EGB時Topflash活性沒有明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05，圖2）。本部分研究結(jié)果表明，Tm能夠抑制Wnt活性，而加用EGB可以顯著改善Wnt活性。

圖2 EGB對Tm誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞Wnt活性的影響

Figure 2 Effects of EGB on Tm-induced Wnt activity in cardiomyocytes

EGB: extracts ofleaf; Tm: tunicamycin. Compared with control group,*<0.05; compared with Tm group,#<0.05

2.3 EGB對Tm誘導(dǎo)C-myc、CyclinD1的影響

為了進(jìn)一步驗證Wnt信號通路在EGB改善心肌細(xì)胞存活率中的作用，我們檢測了Wnt信號通路下游基因C-myc、CyclinD1的水平。研究結(jié)果表明，Tm可以顯著下調(diào)C-myc、CyclinD1水平，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）；而加用EGB兩者表達(dá)水平顯著上調(diào)，并且呈現(xiàn)EGB濃度依賴性上調(diào)，與Tm組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）。然而，與對照組相比，單用EGB時兩者表達(dá)水平并沒有顯著變化（＞0.05，圖3和圖4）。本部分研究結(jié)果進(jìn)一步表明，Tm抑制了Wnt活性，而EGB能夠顯著改善Wnt活性。

圖3 EGB對Tm誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞C-myc水平的影響

Figure 3 Effects of EGB on Tm-induced C-myc in cardiomyocytes

EGB: extracts ofleaf; Tm: tunicamycin. Compared with control group,*<0.05; compared with Tm group,#<0.05

圖4 EGB對Tm誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞CyclinD1水平的影響

Figure 4 Effects of EGB on Tm-induced CyclinD1 in cardiomyocytes

EGB: extracts ofleaf; Tm: tunicamycin. Compared with control group,*<0.05; compared with Tm group,#<0.05

2.4 抑制Wnt信號通路抵消EGB的保護(hù)作用

為了進(jìn)一步驗證Wnt信號通路在EGB發(fā)揮保護(hù)作用中的地位，我們給予Wnt抑制劑分泌型卷曲相關(guān)蛋白（secreted frizzled related protein，sFRP，圖5）。結(jié)果表明，與Tm＋EGB組相比，Tm＋EGB＋sFRP組心肌細(xì)胞存活率顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）。本部分研究結(jié)果表明，EGB主要是通過Wnt信號通路發(fā)揮保護(hù)作用的。

3 討 論

心血管疾病的發(fā)病率和死亡率居高不下，是威脅人類健康的“第一殺手”。在發(fā)達(dá)國家，心血管疾病的病死率呈現(xiàn)了下降趨勢，而在我國，心血管疾病的病死率還在迅猛增長，防控形勢不容樂觀。心血管疾病發(fā)病過程伴隨心肌細(xì)胞凋亡，由于心肌細(xì)胞屬于終末分化細(xì)胞，因而導(dǎo)致心肌細(xì)胞數(shù)量絕對減少，使心肌收縮力下降，從而發(fā)展至心功能不全，導(dǎo)致心力衰竭[14]。研究表明，死亡受體和線粒體途徑是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡最主要的途徑；近十年來，ERS途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡越來越受到關(guān)注[15]，Tm可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)新生蛋白質(zhì)糖基化從而誘導(dǎo)ERS[16]。

圖5 Wnt信號通路抑制劑對EGB保護(hù)作用的影響

Figure 5 Effects of Wnt signal pathway inhibitor on EGB protective role in cardiomyocytes

EGB: extracts ofleaf; Tm: tunicamycin; sFRP: secreted frizzled related protein. Compared withTm+EGB group,*<0.05

EGB是銀杏葉經(jīng)過多步驟分離提取后得到的天然活性物質(zhì)，主要為黃酮類、萜類內(nèi)酯化合物、多糖類等。大量研究表明，EGB具有拮抗血小板活化因子、清除自由基、抗炎及抗過敏等作用。然而，EGB對Tm誘導(dǎo)的心肌損傷是否有保護(hù)作用目前尚未清楚。本實(shí)驗應(yīng)用Tm構(gòu)建ERS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷模型，觀察EGB對細(xì)胞存活狀況的影響。

本研究表明，應(yīng)用Tm處理乳鼠心肌細(xì)胞可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷。而加用EGB的心肌細(xì)胞存活率明顯升高，并且呈現(xiàn)了實(shí)驗劑量范圍內(nèi)的濃度依賴性，首次發(fā)現(xiàn)了EGB可以減輕Tm誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

為了進(jìn)一步驗證EGB的保護(hù)機(jī)制，我們將目光轉(zhuǎn)移到具有抗凋亡作用的Wnt信號通路上來。研究發(fā)現(xiàn)，Tm可以顯著降低Wnt活性，而加用EGB可以顯著恢復(fù)Wnt活性。為了進(jìn)一步證明兩者的相關(guān)性，我們檢測了其下游基因C-myc、CyclinD1水平。研究發(fā)現(xiàn)，Tm可以降低兩者的水平，而加用EGB可以顯著恢復(fù)它們的水平，進(jìn)一步表明EGB可以顯著影響Wnt信號通路。為了證明EGB的保護(hù)作用是通過Wnt信號通路實(shí)現(xiàn)的，我們應(yīng)用了Wnt信號通路抑制劑sFRP，結(jié)果表明，加用sFRP抵消了EGB的保護(hù)作用，進(jìn)一步證實(shí)了EGB通過Wnt減輕了心肌ERS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，達(dá)到保護(hù)受損心肌細(xì)胞的目的。

綜上所述，本實(shí)驗結(jié)果表明Tm激活了心肌細(xì)胞ERS，降低了Wnt活性，導(dǎo)致了心肌細(xì)胞損傷；而加用EGB，可以恢復(fù)Wnt活性，從而達(dá)到保護(hù)受損心肌細(xì)胞的目的。這可能為EGB抑制ERS誘導(dǎo)的心肌損傷提供新的治療靶點(diǎn)。

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（編輯: 李菁竹）

EGB attenuates endoplasmic reticulum stress-induced injury in cultured rat neonatal cardiomyocytes through Wnt signal pathway

SHEN Ming-Zhi1,2, LI Dong-Yun1, FAN Li2, FU Zhen-Hong1, HAN Bao-Shi1, LI Ke1, HU Xin1, LIU Hai-Bin3, XUE Qiao1*

(1Department of Cardiology, Hainan Branch of Chinese PLA General Hospital, Sanya 572013, China;2Department of Geriatric Cardiology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China;3Department of Internal Medicine, Hospital of Troop 92474, Sanya 572018, China)

To determine the effect of the extracts ofleaf (EGB) on the endoplasmic reticulum stress-induced cardiomyocyte injury and investigate the role of Wnt signal pathway in this process.Tunicamycin(Tm) was used to establish the endoplasmic reticulum stress model in rat cardiomyocytes which were isolated from neonatal rats in 1d after born and then cultured for 48h. There were 4 groups of cardiomyocytes, that is, control, Tm treated, Tm+EGB treated and EGB treated. MTT assay was used to detect cell viability. The dual-luciferase report system was used to measure Wnt activity. C-myc and CyclinD1 were detected by real-time PCR.Compared to control cells, Tm treatment resulted in significantly decreased cell viability, but the presence of EGB markedly attenuated the cell injury. The treatment also decreased the activity of Wnt, whereas co-treatment of Tm and EGB led to not only the increase in Wnt activity, but also recovery of the C-myc and CyclinD1 levels. However, Wnt inhibitor, secreted frizzled-related protein (sFRP) decreased Wnt activity, C-myc and CyclinD1 levels, and inversed EGB-induced protective effect.These findings demonstrate that EGB protects cardiomyocytes against Tm-induced injury through improving Wnt activity.

extracts ofleaf; tunicamycin; endoplasmic reticulum stress; cardio myocytes; Wnt

R284.14; R978.12; R329.24

A

10.11915/j.issn.1671-5403.2015.03.050

(CWS12J122).

2014?12?24;

2015?01?09

全軍后勤科研計劃（CWS12J122）

薛 橋, E-mail: xueqiao301@sina.com