1株畜禽糞便堆肥脫氨除臭菌的篩選及特性

尹紅梅 劉標 郭照輝 許麗娟 杜東霞 陳薇

摘要：為了探索微生物除臭菌對畜禽糞便中氨氣的處理效果，采用富集、平板劃線分離法，從堆肥樣品中共分離出25株菌株，通過氨氣選擇性培養(yǎng)基篩選出1株高效抑制氨氣的菌株，命名為菌株YS1。根據(jù)形態(tài)學觀察、內(nèi)部轉錄間隔區(qū)（ITS）rDNA序列同源性比對、系統(tǒng)進化分析對菌株YS1進行多相鑒定，初步鑒定該菌株為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。結果表明，菌株YS1接種到硝化培養(yǎng)基后反應96 h，NH+4-N含量從100.0 mg/L下降至9.4 mg/L，NH+4-N 的去除率達90.6%，體系總氮削減率達58.6%。在反硝化培養(yǎng)基中反應96 h，NO-3-N的濃度由初始的99.3 mg/L下降為17.6 mg/L，降解率達82.3%，體系總氮削減率達35.4%。溶血性試驗表明，YS1菌株無溶血性。

關鍵詞：尖孢鐮刀菌;除臭菌;脫氮;堆肥;NH+4-N;NO-3-N;菌株YS1

中圖分類號：S182 ??文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）17-0261-05

隨著畜禽養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，畜禽養(yǎng)殖廢棄物大量堆積，導致嚴重的環(huán)境污染問題，也影響?zhàn)B殖場的衛(wèi)生防疫和人體健康。禽畜糞便是畜禽養(yǎng)殖廢棄物的主要來源。據(jù)有關數(shù)據(jù)統(tǒng)計，2015年規(guī)?；笄蒺B(yǎng)殖糞污產(chǎn)生量為3.834×109 t，遠超同期工業(yè)固體廢棄物的排放量，據(jù)初步估計，到2020年我國養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生的畜禽糞便將超過60億t[1]。好氧堆肥技術由于工藝簡單、能耗低、投資少，被廣泛運用于禽畜糞便的處理，但是傳統(tǒng)的好氧堆肥處理容易產(chǎn)生惡臭，氮素損失嚴重，不僅污染大氣，還降低了肥料的養(yǎng)分含量。當前，除臭保氮技術是國內(nèi)外畜禽糞便堆肥研究的重點和熱點，但是迄今為止成效甚微。畜禽糞便堆肥產(chǎn)生的惡臭氣體的主要成分是氨氣、硫化氫等，且氨氣占比最大。當下畜禽糞便堆肥脫氨除臭的方式多種多樣，可分為物理、化學、生物、微生物方式等[2]。微生物處理方式是借助微生物的生理功能以及代謝作用，對其中的惡臭物充分降解，在實際使用中具有脫臭效果穩(wěn)定突出、避免二次污染等諸多優(yōu)勢，已成為當下解決臭氣問題的關鍵方法之一[3]。微生物脫氨除臭的主要作用機制是微生物的硝化和反硝化作用[4]，因此這種除臭技術的關鍵是篩選得到高效優(yōu)勢的微生物。

在除臭領域的微生物篩選、產(chǎn)品設計中，日本、歐美的技術更全面先進，目前取得了一系列的成果。而我國該領域的基礎研究有一定滯后，集中在相關除臭劑的基礎試驗上[5]，具備知識產(chǎn)權和科技創(chuàng)新的除臭制劑產(chǎn)品的研究不多。本研究以堆肥腐熟樣為分離材料，分離篩選得到1株脫氨除臭效果好的菌株，命名為YS1。進行了形態(tài)觀察、內(nèi)轉錄間隔區(qū)（ITS）測序等方式鑒定，同時分析了菌株YS1的降氨能力，以期控制畜禽糞便形成的惡臭氣體，改善生態(tài)環(huán)境，為微生物除臭劑的開發(fā)和應用提供更多的理論參考及技術保障。

1 材料與方法

1.1 材料

腐熟堆肥樣采自湖南省株洲市某有機肥廠，用于具有脫臭效果的微生物菌株篩選。

分離培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基等。

NH3選擇性培養(yǎng)基：蔗糖50.0 g，KH2PO4 2.0 g，MgSO4 0.5 g，F(xiàn)eSO4 0.1 g，ZnSO4 0.5 g，NaCl 2.0 g，H2O 1 000 mL 等。

硝化培養(yǎng)基：葡萄糖5.00 g，（NH4）2SO4 0.47 g，NaCl 1.00 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05 g，K2HPO4 0.50 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0，于121 ℃滅菌20 min。

反硝化培養(yǎng)基：葡萄糖5.000 g，KNO3 0.722 g，NaCl 1.000 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.050 g，K2HPO4 0.500 g，MgSO4·7H2O 0.250 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0，于121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 脫氨除臭菌的富集、分離與純化 取腐熟堆肥樣10 g接種于裝有90 mL無菌水的三角瓶中，室溫環(huán)境下于180 r/min搖床處理30 min，隨后在搖床中靜置 20 min，取5 mL接種在95 mL NH3培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)5 d，取5 mL發(fā)酵液繼續(xù)接種在NH3培養(yǎng)基中，以淘汰不能利用 NH+4-N 的微生物，如此反復連續(xù)富集7代。將發(fā)酵液適當稀釋后，涂散在不同的培養(yǎng)基平板上，于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，篩選其中長勢良好的菌落，多次分離純化，直至獲得完全純的單菌落，作斜面保存。

1.2.2 脫氨除臭菌的復篩 參照Liu等的篩選方法[6]，將分離得到的單菌株接種培養(yǎng)過夜后，以體積比5%的接種量接種至NH3選擇性培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)。于培養(yǎng)后24、48、96 h取樣，采用凱氏定氮法測定NH3的釋放量。

1.2.3 高效脫氨菌株的鑒定

1.2.3.1 形態(tài)觀察 將目標菌株YS1接種至固體培養(yǎng)基平板上，于28 ℃下恒溫培養(yǎng)。待菌落長出后，觀察菌落的大小、形狀、顏色等屬性，結合《真菌鑒定手冊》[7]進行初步鑒定。

1.2.3.2 ITS序列的聚合酶鏈式反應（PCR）擴增和測序研究 YS1基因組DNA的提取過程參照Ferre等的方法[8]完成。結合真菌ITS引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[9-10]擴增ITS rDNA序列。PCR參照劉建利的方法[10]進行。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、純化等處理后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。ITS rDNA結果在GenBank中完成同源性比較，挑選相似性>96%的序列，結合MEGA 5.0軟件構建ITS rDNA序列的系統(tǒng)進化樹[11]。

1.2.4 溶血性試驗 將活化后的YS1及對照菌株LY-3接種于血平板上，在30 ℃靜置培養(yǎng)48 h，觀察是否有溶血圈出現(xiàn)，以對照菌株LY-3作為指示菌株，判斷尖孢鐮刀菌YS1是否具有溶血性[12]。

1.2.5 種子液制備 將斜面上保存的YS1接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min 培養(yǎng)48 h，制得種子液用于后續(xù)試驗。

1.2.6 脫氮性能的測定 用“1.2.5”節(jié)中制備形成的菌懸液，以2%的接種量接種至硝化、反硝化培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)。每隔24 h取樣，樣品經(jīng)8 000 r/min離心20 min，取上清液測定NH+4-N、NO-3-N、總氮含量，每個取樣點設置3個平行。

1.2.7 分析測定 硝基氮含量采用紫外分光光度法進行檢測，氨氮含量采用納氏試劑分光度法進行檢測，總氮含量采用凱氏定氮法測定。菌絲干質量采用稱質量法測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件One-way ANOVA程序進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離篩選結果

豬糞腐熟堆肥樣經(jīng)富集、分離純化后，共獲得25株脫氨除臭菌株。將分離得到的25株菌株接種到NH3選擇性培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)48 h后，復篩得到7株脫氨效率較好、生長旺盛的單菌，分別編號為YS1、YS3、YS4、YS5、YX1、YX3、YX4。這7株菌株對氨氣的去除率如表1所示，可以看出，培養(yǎng)48 h后，菌株YS1對氨氣的降解率達81.20%，顯著高于其他菌株（P﹤0.05）。最后選擇除氨效率高、生長速度快的YS1為目標菌株進行后續(xù)試驗。

2.2 菌株YS1的鑒定

2.2.1 菌落及菌體形態(tài)學觀察 如圖1所示，菌株YS1在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，菌落呈白色，突起絮狀，高2～4 mm。菌絲白色質密，呈絨毛狀，孢子呈粉質，其孢子呈紡錘形。菌落與孢子的形態(tài)特征與鐮刀菌分類鑒定標準基本一致。

2.2.2 ITS序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構建 PCR擴增獲得YS1菌株的ITS序列長度為532 bp，在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast同源性比對分析，結果顯示其與Fusarium oxysporum同源性達98%以上。利用MEGA 5.0軟件對菌株YS1的ITS rDNA構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖2。結合菌株的菌落形態(tài)、顯微形態(tài)特征及ITS rDNA序列分析的結果，YS1菌株可鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。

2.3 菌株YS1溶血性

以LY-3為參照菌株，檢測菌株YS1溶血性。從圖3可以看出，LY-3菌株菌落附近形成了尺寸偏大的溶血圈（圖3-B），而尖孢鐮刀菌YS1菌落周圍沒有出現(xiàn)溶血圈（圖3-A），說明尖孢鐮刀菌YS1不具有溶血性。

2.4 菌株YS1脫氮性能測定

2.4.1 菌株YS1硝化性能測定 將菌株YS1種子液以5%的接種量接種于硝化培養(yǎng)基中，考察 NH+4-N 轉化情況，結果見圖4。菌株YS1在24 h后進入對數(shù)期，隨后開始快速轉化NH+4-N，96 h內(nèi)將NH+4-N量從 100.0 mg/L 降至9.4 mg/L，NH+4-N 的去除率達90.6%。在NH+4-N氧化的同時，培養(yǎng)基中積累NO-3-N，反應48 h后，NO-3-N濃度達23.4 mg/L，隨后緩慢下降。體系總氮含量初始值為99.6 mg/L，反應前24 h，發(fā)酵液的總氮含量維持在一個穩(wěn)定的水平，24 h 后，體系總氮含量開始下降，96 h時為41.2 mg/L，總氮含量的削減率達58.6%。證明YS1菌株有良好的硝化性能。

2.4.2 菌株YS1反硝化性能測定 將菌株YS1接種于反硝化培養(yǎng)基中，測定反應過程中菌絲干質量及硝態(tài)氮、氨態(tài)氮、總氮含量的變化。由圖5可知，在反應96 h時，YS1菌絲干質量達6.12 mg/mL，表明菌株YS1在反硝化培養(yǎng)基上長勢理想。菌株YS1對數(shù)期后NO-3-N的轉化速率很快提升，經(jīng)反應 96 h，NO-3-N含量從最初的99.3 mg/L降至 17.6 mg/L，降解率達82.3%。從圖5中還可以看出，反硝化培養(yǎng)基中有NH+4-N積累，反應48 h后，NH+4-N含量達 18.6 mg/L，隨后逐漸下降。體系總氮含量在菌株YS1進入對數(shù)期后迅速減少，后逐漸穩(wěn)定，反應96 h后總氮含量從最初的 99.6 mg/L 減少到64.3 mg/L，削減率為35.4%。初步確定YS1菌株有良好的反硝化性能。

3 討論與結論

堆肥處理是實現(xiàn)畜禽糞便無害化與資源化的一個十分有效的途徑。堆肥過程中散發(fā)的惡臭氣體中的主要成分是氨氣、硫化氫、三甲胺等，其中氨氣占比最大。有研究結果表明，在堆肥過程中，有98%的氮以NH3形式揮發(fā)損失[13]。氮的損失和形成的惡臭不僅污染環(huán)境，影響人體健康，而且降低了肥料中的養(yǎng)分含量。

本試驗以堆肥腐熟樣為分離源，以NH3的釋放量為分析菌株除臭性能的指標因素，并從堆肥樣本中分離獲得1株脫氨除臭性能最為突出的菌株YS1，根據(jù)菌株菌落、菌體形態(tài)與ITS rDNA序列分析結果，鑒定菌株YS1為尖孢鐮刀菌。

溶血性是體外對相關菌株安全性測定過程中需要分析的關鍵指標之一。根據(jù)溶血特點，可對該指標分成2類：α溶血，表現(xiàn)為菌落周圍存在草綠色的溶血圈，對人致病力差;β溶血，表現(xiàn)為菌落周圍存在透明溶血圈，易讓人體發(fā)病。若不存在溶血便不會形成溶血圈。本試驗觀察到菌株YS1無溶血圈形成，說明菌株YS1不具有溶血性。

將菌株YS1接種于硝化培養(yǎng)基中，96 h內(nèi)對氨態(tài)氮的去除率達90.6%。同時發(fā)現(xiàn)在NH+4-N氧化的同時，培養(yǎng)基中積累NO-3-N，反應48 h后，NO-3-N含量達23.4 mg/L。將菌株YS1接種于反硝化培養(yǎng)基中，在96 h內(nèi)對硝態(tài)氮的去除率達82.3%，同時發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中有NH+4-N積累，在反應48 h后，NH+4-N 含量達18.6 mg/L。初步判斷YS1菌株具有良好的硝化、反硝化能力。

以往的反硝化理論指出，反硝化需要在缺氧的環(huán)境下展開，溶解氧的存在對菌株反硝化發(fā)揮了一定的抑制效果。好氧反硝化環(huán)節(jié)中，由于內(nèi)部存在相應的還原酶，所以可借助NO-3-N與氧氣，完成協(xié)同呼吸[14]。YS1的菌體中也可能具有相應的還原酶，從而可借助氧和硝酸鹽共呼吸，這樣可在好氧環(huán)境下實現(xiàn)反硝化作用。

本試驗篩選得到的尖孢鐮刀菌具有同步硝化與反硝化特性，這在國內(nèi)外文獻中鮮見報道。尖孢鐮刀菌分致病性與非致病性2種。尖孢鐮刀菌致病菌是農(nóng)作物重要的土傳性真菌性病原菌，會引起植物根部腐爛、維管束褐變及植株萎蔫，導致茄科、芭蕉科與葫蘆科等許多重要農(nóng)作物嚴重減產(chǎn)[15]。非致病性尖孢鐮刀菌能在植株中定殖，不會造成植物病害且對致病性尖孢鐮刀菌有良好的抑制作用，因此已被作為生防菌株應用于防治番茄、黃瓜、康乃馨等植物的枯萎病[16-17]。為了確定菌株YS1是否能用于生產(chǎn)實踐，在后續(xù)研究中，將進一步鑒定其為致病菌株還是非致病性菌株。

本研究從豬糞腐熟堆肥樣中共獲得25株脫氨除臭菌株，通過氨氣選擇性培養(yǎng)基復篩，得到1株脫氨除臭效率最高的菌株YS1，經(jīng)鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum），該菌株無溶血性。

菌株YS1具有良好的硝化與反硝化性能。將菌株YS1接種于硝化培養(yǎng)基中，96 h后NH+4-N的去除率達90.6%;將菌株YS1接種于反硝化培養(yǎng)基中，反應96 h后，菌株YS1菌絲干質量達 6.12 mg/mL，NO-3-N的降解率達82.3%。

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