冷皂化—高效液相色譜法測(cè)定乳制品中葉黃素的5種順反式異構(gòu)體

陳萬勤等

摘 要 建立了冷皂化高效液相色譜法測(cè)定乳制品中葉黃素的5種順反式異構(gòu)體。將乳制品進(jìn)行冷皂化處理后， 經(jīng)正己烷石油醚二氯甲烷（2∶2∶1， V/V）提取， 使用YMC C30色譜柱分離， 以甲醇和甲基叔丁基醚為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫， 采用二極管陣列檢測(cè)器于445 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)， 外標(biāo)法定量； 在0.127～5.082 mg/L范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好， 相關(guān)系數(shù)（R2）為0.9999， 回收率在96.7%～102.2%之間， RSD在4.1%～5.4%之間（n=6）， 檢出限為0.010 μg/g（S/N=3）， 定量限為0.030 μg/g（S/N=10）。 本方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、靈敏度高， 適用于乳制品中葉黃素5種異構(gòu)體的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜法； 葉黃素； 異構(gòu)體； 乳制品

1 引 言

葉黃素（Lutein）， 又名黃體素， 是存在于蔬菜、花卉、水果與某些藻類生物中的天然類胡蘿卜素。葉黃素具有良好的預(yù)防人體衰老、動(dòng)脈硬化[1]、抗氧化、抗癌功效[2]以及獨(dú)特的護(hù)眼功能[3，4]等， 在保健品、化妝品和動(dòng)禽類飼料等多個(gè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。美國(guó)FDA于1995年批準(zhǔn)了葉黃素作為食品補(bǔ)充劑用于食品中， 我國(guó)2007年批準(zhǔn)了葉黃素作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑添加到嬰幼兒或兒童配方食品中[5]。葉黃素分子結(jié)構(gòu)中含多個(gè)共軛碳碳雙鍵結(jié)構(gòu)， 由于烯鍵的存在， 葉黃素可以存在多種幾何異構(gòu)體。葉黃素不同異構(gòu)體在生物體內(nèi)的生物活性也不同， 其中全反式構(gòu)象的生物活性較順式構(gòu)象要高很多[6，7]。目前市售的食品中很少有區(qū)分葉黃素不同異構(gòu)體的含量。因此， 建立高效的葉黃素順反異構(gòu)體的檢測(cè)方法具有重要的意義。

目前葉黃素的檢測(cè)方法主要以高效液相色譜法[8～10]和液質(zhì)聯(lián)用法[11，12]為主。由于葉黃素在光和熱的作用下容易發(fā)生順反異構(gòu)化[13，14]， 因此樣品的所有處理過程需在較低溫度和避光條件下進(jìn)行， 避免全反式葉黃素發(fā)生異構(gòu)化。所以到目前為止， 國(guó)際市場(chǎng)上也只有全反式葉黃素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在售， 尚未有葉黃素順式異構(gòu)體的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)， 對(duì)順式異構(gòu)體進(jìn)行定量仍然是一個(gè)難題。本研究采用全反式葉黃素作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)， 對(duì)5種葉黃素異構(gòu)體進(jìn)行定量分析， 并且對(duì)樣品的前處理方法進(jìn)行了研究， 采用冷皂化法進(jìn)行樣品的前處理， 避免葉黃素在高溫皂化時(shí)葉黃素發(fā)生異構(gòu)化， 采用液相色譜法結(jié)合YMC C30色譜柱對(duì)葉黃素異構(gòu)體進(jìn)行有效分離， 準(zhǔn)確定量。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Agilent1260高效液相色譜儀， 配二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）； 紫外/可見分光光度計(jì)； 乙腈、甲醇（色譜純， Merk公司）； 甲基叔丁基醚、石油醚、二氯甲烷、正己烷、乙醇、四氫呋喃（色譜純， Tedia公司）； 2，6二叔丁基對(duì)甲苯酚（BHT， 純度99.4%， SigmaAldrich公司）； KOH（純度>80%， SigmaAldrich公司）； 實(shí)驗(yàn)用水為MilliQ超純水。全反式葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.8%， ChromaDex公司）。

2.2 全反式葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取5.0 mg全反式葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品于100.0 mL容量瓶中，用含0.003% BHT的乙醇溶解并定容。該溶液可在

40 ℃下完好保存6個(gè)月。準(zhǔn)確吸取葉黃素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用含0.003% BHT乙醇配制成標(biāo)準(zhǔn)系列溶液Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ和Ⅴ。采用分光光度法[15]和高效液相色譜峰面積歸一法校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ的濃度分別為5.082，2.033，1.016，0.254和0.127 mg/L。

2.3 色譜條件

液相色譜柱：YMC C30色譜柱（250 mm×4.6 mm， 3.5 μm， YMC公司）； 柱溫： 25 ℃； 進(jìn)樣量：100 μL； 以甲醇（A）和甲基叔丁基醚（B）為流動(dòng)相， 梯度洗脫： 0.0～14.0 min， 85%A， 15%B； 14.0～15.0 min， 90%A，10%B； 15.0～18.0 min， 10%A， 90%B； 18.0～22 min， 85%A， 15%B。 流速1.0 mL/min； 檢測(cè)波長(zhǎng)： 445 nm， 參考波長(zhǎng)： 550 nm。

2.4 樣品前處理

樣品的前處理過程都要在避光或者在經(jīng)對(duì)紫外光過濾的燈光下進(jìn)行， 以避免葉黃素發(fā)生異構(gòu)化。稱取粉末樣品2 g（精確到0.001 g）或液態(tài)樣品10 g（精確到0.001 g）， 置于50.0 mL離心管中， （粉末樣品加入10 mL實(shí)驗(yàn)室用水， 充分渦旋2 min）， 加入四氫呋喃5 mL， 渦旋混勻， 加入5% KOH甲醇溶液10 mL， 漩渦振蕩1 min， 于搖床上室溫振蕩反應(yīng)30 min， 反應(yīng)結(jié)束后加入含0.005%BHT的石油醚正己烷二氯甲烷（2∶2∶1， V/V）提取液10 mL， 加蓋漩渦混勻60 s， 6000 r/min離心10 min， 取上層有機(jī)相于玻璃試管中； 再用10 mL提取液重復(fù)提取一次， 合并有機(jī)相， 有機(jī)相在35 ℃下氮?dú)獯蹈桑?用含0.003% BHT的乙醇溶液完全溶解， 并定容至5.0 mL， 用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾， 供HPLC分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 方法定量原理

葉黃素屬于類胡蘿卜素， 其分子式為C40H56O2， 分子量為568.9， 熱處理時(shí)， 全反式葉黃素異構(gòu)化成為順式葉黃素異構(gòu)體， 其中最常見的是13順式葉黃素、13′順式葉黃素和9順式葉黃素、9′順式葉黃素， 葉黃素也易被氧化及光誘導(dǎo)異構(gòu)化， 因此， 實(shí)驗(yàn)過程必須與氧氣和白光隔絕， 并且所有操作在室溫下進(jìn)行， 全反式葉黃素的結(jié)構(gòu)如圖1所示。

由于葉黃素容易發(fā)生異構(gòu)化， 難以獲得順式葉黃素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。有報(bào)道采用全反式葉黃素制備順式葉黃素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的方法， 方法雖然可行， 但是不適用于檢測(cè)機(jī)構(gòu)日常檢測(cè)工作。順式葉黃素與反式葉黃素在445 nm的吸光系數(shù)存在著差異， 在定量順式葉黃素異構(gòu)體， 以反式葉黃素為標(biāo)準(zhǔn)， 使用修正系數(shù)0.7以修正順式和反式異構(gòu)體吸收峰和消光系數(shù)之間的差異， 因此本實(shí)驗(yàn)通過在445 nm下得到的順式葉黃素峰面積與全反式葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積相比， 從而實(shí)現(xiàn)對(duì)全反式葉黃素的定量分析， 也可以對(duì)4種順式葉黃素和全反式葉黃素同時(shí)進(jìn)行計(jì)算， 最終計(jì)算總?cè)~黃素含量。endprint

3.2 色譜條件的優(yōu)化與葉黃素異構(gòu)體的定性

C18色譜柱和C30色譜柱都可以用來檢測(cè)類胡蘿卜素， 但是C18色譜一般用于分析類胡蘿卜素的總量， 而C30色譜柱具有良好的峰形和較長(zhǎng)的保留時(shí)間等優(yōu)越的性能， 通常用于類胡蘿卜素的順反異構(gòu)體的分離。

本研究參考了文獻(xiàn)[16]的方法對(duì)全反式葉黃素進(jìn)行異構(gòu)化反應(yīng)。將1 mg反式葉黃素用少量甲苯溶解后， 加入2 mg/L碘正己烷溶液， 使碘的含量為葉黃素質(zhì)量的2%， 將混合液放在40 W日光燈下光照1 h， 然后用1 mol/L硫代硫酸鈉溶液洗滌2次， 除去多余的碘， 有機(jī)相在30 ℃下氮?dú)獯蹈珊螅?用含0.003%BHT的乙醇溶液復(fù)溶， 定容至10.0 mL， 得到順式和反式葉黃素混合樣品， 用于葉黃素的定性分析。為了消除上一個(gè)色譜樣品雜質(zhì)對(duì)下一個(gè)色譜樣品目標(biāo)物的干擾， 在目標(biāo)物完全洗脫后， 采用大比例的甲基叔丁基醚對(duì)色譜柱進(jìn)行洗脫， 保證可能存在雜質(zhì)完全被洗脫出來后不干擾下一個(gè)樣品的檢測(cè)。在液相色譜系統(tǒng)中， 對(duì)5種葉黃素異構(gòu)體的紫外可見光譜圖進(jìn)行全掃描， 葉黃素5種異構(gòu)體的紫外可見光譜的吸收波長(zhǎng)見表1， 9順式和13順式結(jié)構(gòu)與全反式結(jié)構(gòu)的葉黃素的最大吸收波長(zhǎng)相差約4 nm， 這是由于順式結(jié)構(gòu)葉黃素發(fā)生了紫移現(xiàn)象， 與文獻(xiàn)[8]報(bào)道一致。通過光譜對(duì)照并參照采用YMC C30色譜柱實(shí)現(xiàn)葉黃素5種順反異構(gòu)體完全分離的文獻(xiàn)[8，17，18]， 對(duì)葉黃素5種異構(gòu)體進(jìn)行定性分析。全反式葉黃素標(biāo)準(zhǔn)樣品如圖2a所示， 經(jīng)過異構(gòu)化處理的葉黃素標(biāo)準(zhǔn)樣品中葉黃素5種順反異構(gòu)體如圖2b所示， 各種葉黃素異構(gòu)

體的分離效果良好。由于葉黃素標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品在運(yùn)輸和轉(zhuǎn)移過程中， 不可避免會(huì)受光和熱影響， 全反式葉黃素會(huì)發(fā)生微量的異構(gòu)化， 因此采用面積歸一化法得到全反式葉黃素的含量， 從而消除了微量順式葉黃素對(duì)計(jì)算結(jié)果的影響。

3.3 樣品制備方法的優(yōu)化

葉黃素對(duì)光和熱都很敏感， 操作過程要避光且防止高溫， 因此實(shí)驗(yàn)在常溫下對(duì)樣品進(jìn)行皂化， 使用甲醇KOH溶液作為皂化液的皂化效果優(yōu)于KOH水溶液， 減少了水溶液的稀釋作用， 同時(shí)甲醇作為有機(jī)溶劑加入， 有利于溶解葉黃素。為了防止提取過程中發(fā)生乳化， 促進(jìn)葉黃素的溶解， 提高皂化效率， 在皂化過程加入四氫呋喃。

使用石油醚、正己烷、二氯甲烷作為提取溶劑， 發(fā)現(xiàn)3種試劑混合提取時(shí)效果較好； 考察了不同比例的混合溶液的提取效率發(fā)現(xiàn)， 當(dāng)石油醚正己烷二氯甲烷（2∶2∶1， V/V）時(shí)， 提取效率高， 并且提取溶劑在提取液上層， 有利于提取操作， 減少了樣品基質(zhì)的干擾作用。不同萃取溶劑的萃取效果見表2。本研究采用石油醚正己烷二氯甲烷（2∶2∶1， V/V）溶液作為提取液。

3.4 線性范圍、檢出限和定量限

對(duì)全反式葉黃素標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行檢測(cè)， 以儀器響應(yīng)的峰面積A對(duì)全反式葉黃素的質(zhì)量濃度C進(jìn)行線性回歸， 在0.127～5.082 mg/L范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好， 回歸方程為A=1368.4C-9.7， 相關(guān)系數(shù)（R2）為0.9999。在空白樣品中添加葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品， 以S/N=3確定方法的檢出限， 以S/N=10確定方法的定量限， 得到葉黃素的檢出限為0.010 μg/g， 定量限為0.030 μg/g。

3.5 回收率和精密度

對(duì)不含葉黃素乳粉樣品進(jìn)行全反式葉黃素回收率實(shí)驗(yàn)， 添加水平分別為0.200， 0.500和1.000 μg/g， 采用優(yōu)化后的前處理方法對(duì)樣品進(jìn)行處理， 每個(gè)添加水平重復(fù)6次， 平均回收率分別為97.5%， 102.2%和96.7%， RSD分別為5.4%， 4.3%和4.1%。

3.6 實(shí)際樣品測(cè)定

4 結(jié) 論

建立了乳制品中葉黃素5種順反異構(gòu)體的高效液相色譜法。采用冷皂化前處理， 保證樣品在皂化過程中葉黃素能保持原有的構(gòu)型， 使用YMC C30色譜柱對(duì)葉黃素5種順反異構(gòu)體進(jìn)行了有效分離， 4種順式異構(gòu)體依據(jù)反式葉黃素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析。方法簡(jiǎn)單快速， 準(zhǔn)確度和精密度高， 適用于乳制品中葉黃素5種順反異構(gòu)體的定量檢測(cè)。

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Abstract A cold saponification method for determination of 5 lutein stereoisomers in dairy products by high performance liquid chromatography （HPLC） was developed. Samples were coldsaponified at room temperature and extracted by nhexane/petroleum/dichloromethane （2∶2∶1， V/V/V）. Then 5 lutein stereoisomers were separated on a YMC C30 column with gradient elution using methanol/methyl tertbutyl ether as the mobile phase， and data were acquired by a photodiode array detector at wavelength of 445 nm. The calibration curve was linear in the range of 0.127-5.082 mg/L with correlation coefficient of 0.9999， and the recoveries were from 96.7% to 102.2% with the RSDs in the range of 4.1%-5.4% （n=6）. The limit of detection was 0.010 μg/g （S/N=3）， and the limit of quantification was 0.030 μg/g （S/N=10）. By presenting results of good accuracy， precision and sensitivity， this method validates its suitability for routine analysis of 5 lutein stereoisomers in dairy products.

Keywords High performance liquid chromatography； Lutein； Stereoisomers； Dairy products

（Received 20 October 2014； accepted 17 December 2014）endprint