電灸心力衰竭大鼠內(nèi)關(guān)—間使穴對心功能和內(nèi)源性H2S的影響

崔白蘋?丁鳳云

摘 要：目的：研究電灸（electroacupuncture， EA）慢性心力衰竭（chronic heart failure， CHF）大鼠內(nèi)關(guān)-間使穴對CHF大鼠心功能和內(nèi)源性H2S的影響。方法：SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、結(jié)扎左前降支冠狀動脈致CHF組。CHF大鼠隨機分為EA組和對照組。EA組每天電灸刺激內(nèi)關(guān)-間使穴30min，EA對照組每天電灸刺激內(nèi)關(guān)穴旁偏歷-溫溜穴（大腸經(jīng)），超聲心動圖測定CHF大鼠心功能、心臟重塑和心肌梗死面積，取心臟和血酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）測定H2S含量。結(jié)果：與CHF大鼠和EA對照組相比，EA顯著升高CHF大鼠左心室射血分數(shù)、逆轉(zhuǎn)擴大的左心室收縮末期直徑和舒張末期直徑，降低梗死面積。EA組CHF大鼠心肌和血中H2S測定值顯著高于對照EA組（心?。?0.13+3.35umol/L） vs （22.26+2.97umol/L）；血漿 （33.34+3.25umol/L） vs （51.13+2.55 umol/L） ， P < 0. 001），差異有顯著性（ P 均< 0. 001）。結(jié)論：EA對CHF大鼠心肌有保護作用，能逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)，EA升高CHF大鼠心肌和血中H2S。EA可能是通過升高內(nèi)源性H2S改善CHF大鼠心功能。EA可以作為一種治療CHF的有效替代療法。

關(guān)鍵詞：電灸；心力衰竭；H2S ；內(nèi)關(guān)-間使穴

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是指由于心肌收縮力下降，使心輸出量不能滿足機體代謝的需要而引起的以循環(huán)功能障礙為主的綜合征。隨著人口老齡化進程的加快和高血壓病、冠心病等常見心血管病發(fā)病率的上升，CHF患病率正逐漸升高。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）預(yù)測，到2020年心血管疾病將成為世界上死亡率最高的疾病。心力衰竭是多種心血管疾病的最終結(jié)局，心室重構(gòu)被認為是導(dǎo)致心力衰竭及其病情惡化的內(nèi)在原因。中醫(yī)理論中，針灸早在1000多年前就已經(jīng)用來治療多種疾病和不適，現(xiàn)在世界范圍內(nèi)已經(jīng)廣泛接受針灸作為一種替代療法。臨床證據(jù)和動物實驗均表明針灸對高血壓、心律失常和冠心病[1-4]都有治療作用。內(nèi)關(guān)屬手厥陰心包經(jīng)，間使屬手厥陰心包經(jīng)，位于正中神經(jīng)上[5-6]。刺激內(nèi)關(guān)-間使穴能顯著降低心交感神經(jīng)反射[1，4，7]。因此，本實驗選內(nèi)關(guān)-間使穴施行電灸。硫化氫（hydrogen sulfide， H2S）是繼一氧化氮（nitric oxide， NO）和一氧化碳（carbonic oxide， CO）之后發(fā)現(xiàn)的第三類氣體信號分子，具有多種生理功能。心臟病內(nèi)源性H2S降低[8-11]；H2S可以抑制心肌重構(gòu)[9，12-14]；H2S通過抗氧化、抗凋亡保護心肌細胞。電灸CHF大鼠內(nèi)關(guān)-間使穴對CHF大鼠心臟是否有保護作用，對內(nèi)源性H2S是否有影響尚不清楚。

一、材料與方法

1.材料

（1）實驗動物。雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，清潔級，體重300～400g，由南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。實驗動物使用遵守美國國家衛(wèi)生機構(gòu)發(fā)布的《實驗動物保護和使用指南》（NIH，Publication No.85-23，1996修訂版）。大鼠隨機分為兩組，一組為慢性心力衰竭模型（CHF）組，另一組為假手術(shù)（Sham）組。實驗大鼠在溫度22 ℃、濕度30～40%的環(huán)境中飼養(yǎng)，12小時明暗周期，自由飲水和攝食。

（2）試劑與儀器。主要試劑：戊巴比妥鈉（生工生物工程（上海）股份有限公司），H2S ELISA試劑盒（Rapidbio，West Hills，USA）。主要儀器：Vevo超高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)（Vevo2100， 加拿大VisualSonics公司）；PowerLab數(shù)據(jù)分析處理系統(tǒng)（8SP，AD instruments，澳大利亞）；小動物呼吸機（Model 683，Harvard Apparatus Inc.，美國）；臺式高速冷凍離心機（Sigma，1-15PK，德國）；HANS-200A韓氏穴位神經(jīng)刺激儀（北京盛達醫(yī)療器械中心， 北京）。

2. 實驗方法

（1）動物造模。本實驗采用冠狀動脈結(jié)扎誘發(fā)CHF方法。在戊巴比妥鈉（50 mg/kg，i.p.）麻醉下，按照無菌操作進行手術(shù)。經(jīng)口腔途徑氣管插管，與嚙齒類動物呼吸機（Model 683，Harvard Apparatus Inc.，USA）相連進行機械通氣。在無菌手術(shù)條件下于左側(cè)第四肋間隙打開胸腔，剪開心包，暴露心臟。用6/0號縫合線在靠近主動脈根處結(jié)扎冠狀動脈左前降支（left anterior descending coronary artery，LAD），引起心臟局部缺血。Sham組除了不結(jié)扎LAD外，其余操作均相同。大鼠死亡率約30%，死亡主要發(fā)生在結(jié)扎后第一天。EA實驗在冠狀動脈結(jié)扎或?qū)φ战M假手術(shù)后4周末進行。用Vevo超高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)（Vevo2100， 加拿大VisualSonics公司）評價心率、射血分數(shù)（ejection fraction，EF）、短軸縮短率（shortening fraction，F(xiàn)S）、左室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD）和左室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end systolic diameter，LVESD） 指標確定CHF成模。

（2）電灸內(nèi)關(guān)-間使穴。大鼠的穴位與人類似，內(nèi)關(guān)-間使穴位于中神經(jīng)上。不繡鋼電針置于腕關(guān)節(jié)上1.5-2.0mm和2.5-3.0mm處掌長肌腱和屈腕橈側(cè)的韌帶中間的內(nèi)關(guān)間使穴上。穴位準確的標準是電針刺激時大鼠前爪輕幅度震動。HANS-200A韓氏穴位神經(jīng)刺激儀低電流、低頻（2Hz，2mA）刺激30min。CHF大鼠EA對照組選擇了靠近內(nèi)關(guān)-間使穴的偏歷-溫溜穴（大腸經(jīng)）。

（3） H2S 的ELISA檢測。采取大鼠腹主動脈血2 ml， 3000 r/ min 離心10 min， 分離血漿， EP 管密封后- 70 ℃ 保存待檢， 測定前將標本復(fù)融， 3000 r / min 離心10 min， 取上清液檢測。心肌組織冰上充分碾磨勻漿，離心20min（3000r/min），收集上清- 70 ℃ 保存待檢。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），按照大鼠ELISA試劑盒（ Rapidbio （RB）， West Hills， CA， USA）說明書中所述操作步驟分別檢測血漿和心肌組織中H2S水平。簡述如下：在酶標板上加樣、溫育、配液、洗滌、加酶、溫育、洗滌、顯色、加終止液、在酶標儀（ELX-800，BioTeK，Winooski，USA）上讀取樣本吸光度，繪制標準曲線，并根據(jù)標準曲線方程和標準品濃度，計算H2S水平。

（4）計算梗死面積。以常規(guī)的方式處理進行組織學(xué)研究，從頂點到底部把左心室切成四橫片，5um厚，Masson染色。ImageJ 1.34軟件是用來測量長度和左心室梗死面積。在每個心肌組織片，梗死率定義為梗死部位周長與整個心內(nèi)膜的周長的比值。左心室切片的面積乘以梗死率就是該心肌切片的梗死面積。左心室的梗死率就是左心室的梗死面積與左心室總面積的比值 。

（5）統(tǒng)計處理方法。應(yīng)用SPSS 17. 0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以均數(shù)+標準差（ x + SE） 表示， 兩組間比較用t 檢驗， 多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法。計數(shù)資料組間比較用卡方檢驗。應(yīng)用Pearson 法進行相關(guān)性分析。以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

二、 結(jié)果

1. 解剖學(xué)和血流動力學(xué)變化

CHF大鼠左心室梗死面積平均為左心室面積的34.5%，而Sham組大鼠沒有明顯的心肌梗死。與Sham大鼠相比，CHF大鼠心臟的重量與體重比值顯著增加，這提示CHF大鼠心肌非梗死區(qū)發(fā)生肥大。CHF大鼠射血分數(shù)、左室短軸縮短率和+LV dP/dtmax降低，而LVESD和LVEDD增加，這提示CHF大鼠心臟射血功能降低，心室擴張重構(gòu)（Table 1）。

三、討論

心臟的收縮和舒張功能受損形成CHF。目前，CHF的主要病因是缺血性心臟病、高血壓和心肌病。盡管心衰藥物的療效越來越好，世界范圍內(nèi)，CHF仍有較高的發(fā)病率和死亡率，據(jù)報道，男性患者5年存活率25%，女性患者5年存活率38%，因此，發(fā)現(xiàn)有效的治療心衰的方法備受期待。針灸是被普遍接受的治療干預(yù)手段，在美國針灸是廣泛應(yīng)用的替代療法。針灸除了治療術(shù)后疼痛，還可以有效地治療術(shù)后和化療引起的惡心和嘔吐。針灸也可以作為一個有效的方法治療其他情況，如上癮、頭痛、網(wǎng)球肘、肌筋膜疼痛、年骨關(guān)節(jié)炎、腰痛和哮喘。內(nèi)關(guān)-間使穴是治療心血管疾病最有效的穴位[23- 25]。在冠狀動脈部分阻塞的貓身上，模擬EA內(nèi)關(guān)穴刺激中神經(jīng)能增加心臟供氧，減少局部心肌梗死面積。硫化氫（H2S）是人體內(nèi)繼一氧化碳（CO）、一氧化氮（NO）后的第3種氣體信號分子，在中樞、心血管系統(tǒng)等發(fā)揮重要作用。先天性心臟病患兒和心力衰竭病人血漿H2S降低[27，28]，大量研究證明，H2S可抑制心力衰竭的發(fā)生，對心臟具有保護作用[29-31]。H2S可以改善心肌重構(gòu)， 缺血誘發(fā)心衰的小鼠模型中，再灌注后連續(xù)給予7 天 H2S 供體Na2S 可有效抑制心衰導(dǎo)致的左心室舒張末期及收縮末期容積增加，并抑制左室射血分數(shù)、左室縮短率的降低，提高左心室功能，發(fā)揮心臟保護作用。但是， EA是否能增加內(nèi)源性H2S，能否能改善心功能和心室重構(gòu)尚不清楚。

我們實驗證明，EA能改善心功能，降低心肌梗死面積，改善心肌重構(gòu)；EA能升高CHF內(nèi)源性H2S。EA升高CHF內(nèi)源性H2S可能是改善心功能和重構(gòu)的重要機制。EA能降低CHF大鼠的血壓和心率，但是與對照-EA相比沒有顯著差異。有研究證明低頻刺激人的內(nèi)關(guān)-間使穴對血壓和心率有雙向調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)針灸可以通過降低交感神經(jīng)的興奮性，改善心功能，但其具體的分子機制尚不清楚。

針灸可以作為一種有效的治療心衰的替代療法，其大規(guī)模、長期的臨床試驗和其作用機制有待進一步開展實施。

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基金資助：江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目（JX10231801）.