雞致病性大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

涂玉蓉 李美娣 武 力*

（廣州華農大實驗獸藥有限公司 廣州 510642）

雞大腸桿菌病是嚴重危害養(yǎng)雞業(yè)的重要細菌性傳染病，規(guī)模養(yǎng)雞場細菌性疫病的發(fā)生以大腸桿菌為主。隨著我國養(yǎng)雞業(yè)的持續(xù)發(fā)展,特別是集約化程度的加深,雞大腸桿菌病的流行日趨嚴重,由于區(qū)域性差異較大、防治措施和手段相對薄弱,造成我國雞大腸桿菌病比國外更為復雜。該病血清型多樣、抗原性復雜、臨床癥狀和病理變化多變,不同品種、不同日齡的雞群均可發(fā)病,輕者可以引起雞群生產性能下降,重者導致發(fā)病雞大批死亡,尤其對雛雞危害更大。

該病在一些養(yǎng)殖場中仍嚴重發(fā)生，臨床上經常使用大量的抗菌藥物，導致不斷出現耐藥大腸桿菌株，從而也不斷擴大了耐藥譜[1-2]；同時還加劇了抗菌藥物在畜禽體內的殘留，不僅給養(yǎng)禽業(yè)的持續(xù)發(fā)展帶來潛在危害，還嚴重影響到食品安全，從而危及人類的身體健康。本文在廣東地區(qū)疑似患雞大腸桿菌病的病料中分離到“大腸桿菌”，對其進行分離鑒定和藥敏試驗，在此基礎上進行防治，并對廣東地區(qū)雞大腸桿菌病的綜合防制措施進行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源

從疑似發(fā)生雞大腸桿菌病的廣東雞場采集病料，臨床剖檢病死雞，發(fā)現有典型心包炎、肝周炎、氣囊炎或卵黃性腹膜炎等癥狀。

1.1.2 試劑

培養(yǎng)基：麥康凱培養(yǎng)基、LB 肉湯和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基為廣州環(huán)凱生物技術有限公司產品。

葡萄糖、甘露糖、緩慢發(fā)酵蔗糖、果糖、乳糖、麥芽糖和尿素酶等微量細菌生化管均為北京陸橋技術有限責任公司產品。

藥敏紙片：頭孢他啶（CAZ）、鏈霉素（STR）、環(huán)丙沙星（CIP）、阿莫西林(AMX)、四環(huán)素（TCY）、替米考星(TIL)和氟苯尼考(FFC)均為杭州天和生物制品科技有限公司產品。

其他化學試劑均為國產分析純產品。

1.2 方法

1.2.1 病原的分離培養(yǎng)

將接種環(huán)在酒精燈上煅燒消毒，待接種環(huán)冷卻后，采集?。ㄋ溃╇u心、肝、脾、肺及卵黃液，無菌操作劃線接種于麥康凱瓊脂平板上，于37℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24h，觀察結果；挑取疑似大腸桿菌的單個菌落進一步純化培養(yǎng)。

1.2.2 形態(tài)學鑒定：染色鏡檢

將疑似菌株進行涂片和革蘭氏染色程序染色，并觀察顯微鏡下的細菌形態(tài)。

1.2.3 生化試驗鑒定

選取在麥康凱瓊脂上長出的磚紅色菌落分別作V-P、三糖鐵試驗、各種糖發(fā)酵試驗、吲哚試驗、尿素酶試驗和MR 試驗。

1.2.4 致病性試驗

將分離到的大腸桿菌接種于肉湯培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24h，按比濁計數法計數，配制成菌濃度為1×109cfu/mL 的菌液。給每組9 只雛雞進行腹腔注射菌液0.2mL。對照組9 只注射滅菌肉湯0.2mL。攻毒后，觀察雛雞狀態(tài)，記錄精神、行為、健康和死亡情況及數據，并及時剖檢死亡雞，分離細菌。判定標準：能使試驗雞在24 h 內全部死亡或在48 h 內死亡2/3 以上的菌株作為致病菌株。

1.2.5 藥物敏感性試驗

按照國外常用的Kirby－Bauer 法（簡稱K-B 法）進行。在無菌的條件下，將鑒定為雞大腸桿菌的純培養(yǎng)物接種于LB 肉湯中，置于37℃溫箱中培養(yǎng)24 h，稀釋菌液至0.5 標準麥氏比濁管，用滅菌棉簽蘸取稀釋過的菌液并擠去多余的液體，在MHA 平板上均勻涂布，蓋上平板，置室溫數分鐘至培養(yǎng)基的表面無明顯液體，用無菌小鑷子夾取藥敏紙片平貼于瓊脂平板表面，然后翻轉倒置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，測量抑菌環(huán)直徑并判定結果。

本試驗所選用的藥敏紙片有：頭孢他啶、鏈霉素、環(huán)丙沙星、阿莫西林、四環(huán)素、替米考星和氟苯尼考。把抑菌圈直徑的大小作為敏感性的高低，采用WHO 質控標準菌的敏感性及抑菌圈大小劃分方法報告結果，即敏感、中度敏感和耐藥。藥敏紙片種類及判定標準見表1。

2 結果

2.1 細菌分離培養(yǎng)結果

在麥康凱瓊脂上形成紅色、圓形隆起、光滑濕潤、邊緣整齊、直徑為1.5～2.5mm 的小菌落。

2.2 染色鏡檢結果

涂片并染色后顯微鏡下可見大多數分散排列，偶爾有2～3 個連在一起，兩端鈍圓，兩端濃染的革蘭氏陰性短桿菌。

2.3 生化試驗結果

分離獲得的4 株疑似大腸桿菌生化試驗結果顯示:均能發(fā)酵葡萄糖、甘露糖，緩慢發(fā)酵蔗糖果糖、乳糖、麥芽糖,產酸、產氣或是不產氣。MR 試驗陽性，三糖鐵底層產酸，V-P 試驗陰性，尿素酶試驗陰性，產生靛基質，詳見表2，其結果符合大腸桿菌的生化特性。

2.4 致病性試驗結果

大部分雛雞6h 以后開始出現癥狀，表現精神沉郁，食欲下降，多數出現腹瀉，有的出現神經癥狀。接種12 h 后開始出現死亡。剖檢死亡雞，表現為典型大腸桿菌病病變，并且從死亡雞病變組織均能回收到相應接種致病菌株。

2.5 藥敏試驗結果

試驗結果顯示，分離菌株對頭孢拉定、環(huán)丙沙星、替米考星和氟苯尼考等藥物敏感，對鏈霉素、阿莫西林和四環(huán)素耐藥，詳見表3。

3 討論

本試驗從廣東地區(qū)疑似患雞大腸桿菌病的病料中分離到疑似細菌，進行了細菌形態(tài)觀察、培養(yǎng)特性和生化特性鑒定，證實為大腸桿菌，且分離的大多數菌株為致病性大腸桿菌。藥物敏感試驗結果表明，分離菌株對頭孢拉定、環(huán)丙沙星、替米考星和氟苯尼考等藥物敏感,對鏈霉素、阿莫西林和四環(huán)素耐藥。試驗證明藥敏試驗結果與臨床治療應用效果不盡相同,藥敏試驗可作為臨床治療大腸桿菌病選藥的重要依據,但不能據此不加選擇地盲目投藥。在生產當中用藥不規(guī)范、療程不當或是長期使用同一類藥物或長期在飼料、飲水中加入預防性用藥，均可促使細菌產生抗藥性[4-5]。本文雞大腸桿菌的分離和鑒定為廣東地區(qū)大腸桿菌的流行病學打下了基礎，對分離菌株進行的耐藥性試驗為臨床治療提供了依據，為廣東地區(qū)雞大腸桿菌病的防治積累了經驗，并具有一定的指導意義。

表1 藥敏紙片種類及判定標準（mm）

表2 生化反應結果

表3 藥敏試驗結果（mm）

另外，尚應當注意，即使經藥敏試驗篩選出了一些敏感藥物用于臨床雞大腸桿菌的防控，表面上效果并不見得理想，此時，一要考慮是否混合感染雞沙門氏菌等其他病原[6-7]，二要注意藥物體外與體內作用環(huán)境不同等問題，在實際用藥選擇上應作科學、全面的考慮。

[1] 張曉紅. 雞大腸桿菌的分離鑒定與藥敏試驗[J]. 中國動物檢疫,2013,30(1):65-66.

[2] 張遂平,楊建奮,邵艷華.雞大腸桿菌分離及藥敏試驗研究[J].中國畜牧業(yè),2013(2):62-63.

[3] 鄒玲,任慧英.雞大腸桿菌病病原的分離鑒定及藥敏試驗[J].中國畜牧獸醫(yī),2007,34(2):119-121.

[4] 劉桂榮. 雞大腸桿菌病的流行狀況與防治[J].家禽科學,2007(6):28-29.

[5] 劉娣琴,楊紅梅,賈志江.雞大腸桿菌病的防制誤區(qū)與對策[J].畜牧獸醫(yī)雜志,2012,31(5):89-89.

[6] 雷崇良.雞沙門菌、大腸桿菌和傳支混合感染的診治[J].中國家禽,2004,26(6):24.

[7] Cabrera R,Ruiz J,Marco F, et al.Mechanism of resisitance to several antimicrobial agents in Salmonella clinnical isolates causing traveler’s diarrhea [J].Antimicrob Agents Chemothe,2004,48(10):3934-3939.