牙髓干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中Oct4可變剪接體表達(dá)改變的研究

賀 瑩，關(guān)麗娜，孫雪飛，韓 冰，張亞慶，楊 帆

（軍事口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，陜西西安710032）

牙髓干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中Oct4可變剪接體表達(dá)改變的研究

賀 瑩，關(guān)麗娜，孫雪飛，韓 冰，張亞慶，楊 帆

（軍事口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，陜西西安710032）

目的：研究多能性轉(zhuǎn)錄因子Oct4可變剪接體在人牙髓干細(xì)胞（hDPSCs）向成牙本質(zhì)細(xì)胞定向分化過程中的表達(dá)改變。方法：礦化液誘導(dǎo)hDPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化，RT－PCR檢測(cè)未經(jīng)分化誘導(dǎo)、分化誘導(dǎo)7、14 d時(shí)Oct4可變剪接體（Oct4A，Oct4B）以及干性分子Sox2、Klf4和DSPP的表達(dá)改變；激光共聚焦顯微鏡（CLSM）檢測(cè)Oct4A在分化過程中的表達(dá)和定位。結(jié)果：hDPSCs高表達(dá)CD146、CD105、CD90、CD29；CD45及CD34表達(dá)陰性。礦化液誘導(dǎo)細(xì)胞分化后牙本質(zhì)涎磷蛋白（DSPP）的總蛋白和mRNA表達(dá)陽(yáng)性。在hDPSCs未經(jīng)分化誘導(dǎo)、分化誘導(dǎo)7、14 d時(shí)，Oct4A和Sox2、Klf4均有表達(dá)，分化誘導(dǎo)后表達(dá)量明顯降低（P＜0．05），14 d時(shí)hDPSCs表達(dá)均低于7 d（P＜0．05）；Oct4B在hDPSCs未經(jīng)分化誘導(dǎo)、分化誘導(dǎo)7、14 d時(shí)表達(dá)均為陰性；TIP110與Oct4A在hDPSCs成牙本質(zhì)分化過程中表達(dá)趨勢(shì)相同。未經(jīng)分化誘導(dǎo)hDPSCs剪接體Oct4A主要表達(dá)于細(xì)胞核，而分化誘導(dǎo)21 d后主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。結(jié)論：hDPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化過程中伴隨著其干性降低、剪接體Oct4A表達(dá)降低和核漿穿梭效應(yīng)的發(fā)生，提示Oct4A在維持hDPSCs干性中發(fā)揮著一定作用。

牙髓干細(xì)胞；Oct4；成牙本質(zhì)細(xì)胞分化；可變剪接體

［Chinese Journal of Conservative Dentistry，2015，25（5）：282］

多能性轉(zhuǎn)錄因子Oct4（0ctamer binding transcription factor－4）是第一個(gè)被確定為調(diào)控干細(xì)胞多潛能性的核心轉(zhuǎn)錄因子，在維持胚胎干細(xì)胞未分化狀態(tài)和體細(xì)胞重編程中發(fā)揮著重要的作用［1］，已證實(shí)Oct4基因敲除小鼠缺失具有多向分化潛力的細(xì)胞群［2］。此外，在早期胚胎發(fā)育中Oct4也是決定細(xì)胞特定分化方向的重要因子。小鼠胚胎干細(xì)胞內(nèi)抑制Oct4基因表達(dá)，細(xì)胞失去原有向內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分化能力，分化形成滋養(yǎng)層［3］。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)抑制Oct4表達(dá)可促進(jìn)中胚層發(fā)育，相反高表達(dá)則促進(jìn)內(nèi)胚層發(fā)育［4］。Oct4經(jīng)選擇性剪接可生成2種主要剪接異構(gòu)體Oct4A和Oct4B，二者組成不同，功能也不盡相同。Oct4A mRNA序列包括447個(gè)堿基對(duì)，而Oct4B mRNA序列包括344個(gè)堿基。Oct4A是Oct4的原始形式，主要表達(dá)于未分化細(xì)胞的細(xì)胞核中，參與維持干細(xì)胞未分化狀態(tài)。而Oct4BmRNA序列由344個(gè)堿基構(gòu)成，表達(dá)于非多能性細(xì)胞［4－5］，其作用尚不清楚。目前有關(guān)Oct4不同剪接體產(chǎn)生的機(jī)制尚未明確，有研究發(fā)現(xiàn)TIP110通過調(diào)控Oct4選擇性剪接參與維持胚胎干細(xì)胞Oct4A高表達(dá)［6］。牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells，DPSCs）屬于成體間充質(zhì)干細(xì)胞，具有多向分化和自我更新能力，位于牙髓組織血管旁的細(xì)胞龕內(nèi)。當(dāng)牙髓受到損傷時(shí)，DPSCs從龕內(nèi)遷徙至受損部位分化為特定類型細(xì)胞參與牙髓損傷修復(fù)。DPSCs在未分化與分化狀態(tài)的轉(zhuǎn)變受到自身攜帶的遺傳信息以及周圍所處的微環(huán)境的調(diào)控［7］，對(duì)比分化前后基因表達(dá)改變有助于篩選出維持細(xì)胞未分化狀態(tài)和誘導(dǎo)其定向分化的調(diào)控因子。Oct4作為轉(zhuǎn)錄因子一方面參與維持細(xì)胞未分化狀態(tài)，一方面抑制分化相關(guān)特定基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)在人牙髓干細(xì)胞（hDPSCs）內(nèi)可檢測(cè)到Oct4、Sox2、Klf4高表達(dá)，且表達(dá)隨著DPSCs的衰老降低［8］，說明Oct4在hDPSCs的干性維持中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)擬采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）和激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)牙髓干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化前后Oct4主要可變剪接體（Oct4A和Oct4B）的表達(dá)水平和定位改變，為進(jìn)一步深入研究Oct4在hDPSCs干性維持中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 材料和器材

α－MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（Hyclone，美國(guó)）；雙抗（Gibco，美國(guó)）；Dispase酶（Roche，瑞士）；CD29－PE、CD34－PE、CD45－PE、CD90－PE、CD105－PE、CD146－PE（Biolegend，美國(guó)）；鼠抗人Oct4A單克隆抗體（Santa Cruz，Cat sc－5279，美國(guó)）；山羊抗鼠Cy3熒光二抗（武漢博士德公司）；Ⅰ型膠原酶、β－甘油磷酸鈉、地塞米松、維生素C、離心機(jī)、小鼠抗β－actin抗體（Sigma，美國(guó)）；小鼠抗人DSPP抗體（Santa Cruz，sc－73632，美國(guó)）；Trizol Reagent、Oct4A、Sox2、Klf4、TIP110及β－actin引物（Invitrogen，美國(guó)）；細(xì)胞孵箱（Heraeus，德國(guó)）；倒置相差顯微鏡（Olympus，日本）；低溫高速離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)）；cDNA合成試劑盒、SYBR Green試劑盒（Takara，日本）。

1．2 人牙髓細(xì)胞的分離培養(yǎng)和純化

臨床收集18～22歲新鮮拔除的健康完整的第三磨牙和因正畸需要拔除的牙齒，用帶有雙抗的PBS于超凈臺(tái)沖洗凈后，置于無(wú)菌環(huán)境中劈開取出牙髓，用含有雙抗的PBS反復(fù)沖洗3次，剪成1 mm ×1 mm×1 mm小塊，移入含有3 g／L膠原酶和4 g／L Dispase酶（1∶1）離心管內(nèi)，聯(lián)合消化法37℃消化45 min，待組織塊呈絮狀加入等體積含雙抗的100 mL／L胎牛血清的α－MEM培養(yǎng)液終止消化，1 000 r／min離心5 min，棄上清液，細(xì)胞培養(yǎng)液重懸2次后加入200 mL／L胎牛血清的α－MEM培養(yǎng)基，接種于35 mm的培養(yǎng)皿，37℃、50 mL／L CO2孵箱培養(yǎng)3 d，倒置顯微鏡下觀察組織塊周圍是否有細(xì)胞爬出，采用有限稀釋法挑選單克隆并傳代擴(kuò)增，取處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的第4代細(xì)胞進(jìn)行研究。

1．3 牙髓干細(xì)胞的鑒定

1．3．1 流式細(xì)胞儀鑒定干細(xì)胞表面標(biāo)記物

2．5 g／L胰蛋白酶消化P4 hDPSCs，PBS清洗兩遍，顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109／L，分別用CD146、CD105、CD90、CD45、CD34和CD29標(biāo)記抗體，室溫避光孵育30 min，PBS清洗3遍，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1．3．2 礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)

hDPSCs（1×105／孔）接種于35 mm培養(yǎng)皿，等細(xì)胞融合至80%時(shí)更換培養(yǎng)液為礦化誘導(dǎo)液（含有100 mL／L FBS的α－MEM培養(yǎng)基中加入終濃度為2 ng／mL地塞米松、10 mmol／Lβ－甘油磷酸鈉、50 ng／mL維生素C），每3 d換液1次，誘導(dǎo)分化14 d終止礦化培養(yǎng)，茜素紅進(jìn)行染色。

1．3．3 成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)

hDPSCs（1×105／孔）接種于35 mm培養(yǎng)皿，等細(xì)胞融合至80%時(shí)更換培養(yǎng)液為成脂誘導(dǎo)液（含有100 mL／L FBS的α－MEM培養(yǎng)基中加入終濃度為0．2 mmol／L吲哚美辛、0．5 mmol／L IBMX、10 mg／L胰島素、1 mmol／L地塞米松），每3 d換液1次，21 d后終止培養(yǎng)，油紅O染色。

1．4 牙本質(zhì)涎磷蛋白（DSPP）的表達(dá)檢測(cè)

Western blot：礦化誘導(dǎo)液連續(xù)培養(yǎng)hDPSCs 2周，分別提取礦化0、7、14 d時(shí)總蛋白，Western blot檢測(cè)DSPP的表達(dá)，以β－actin作為內(nèi)參。

1．5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT－PCR）

收集未經(jīng)分化誘導(dǎo)和分化誘導(dǎo)7、14 d的牙髓干細(xì)胞，分別用Trizol試劑盒提取總RNA，分光光度計(jì)測(cè)量總RNA濃度，使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將1μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA模版，使用20μL體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，引物設(shè)計(jì)和合成由Invitrogen公司完成，引物序列見表1。PCR擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，包括10 min預(yù)變性，95℃變性，55℃退火，72℃延伸及最后10 min延伸。采用2－△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1．6 免疫熒光染色

將P4代hDPSCs以1×103／孔的密度接種于24孔板內(nèi)的蓋玻片上，加入礦化誘導(dǎo)液，21 d后終止培養(yǎng)，PBS清洗5 min×3次，40 g／L多聚甲醛固定30 min，PBS清洗5 min×3次，1 g／L Triton X－100通透20 min，PBS清洗3次，山羊來(lái)源的血清封閉30 min，孵一抗（1∶150），4℃濕盒過夜，PBS清洗3次，避光孵二抗2 h，PBS清洗，DAPI染細(xì)胞核，激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

表1 RT－PCR引物序列

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0．05。

2 結(jié)果

2．1 人牙髓干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定

鏡下見組織塊貼壁3 d后周圍有梭形細(xì)胞爬出（圖1），貼壁細(xì)胞胞體小，胞核大。換液繼續(xù)培養(yǎng)至10 d左右細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí)進(jìn)行有限稀釋法挑選單克隆，經(jīng)單克隆細(xì)胞篩選擴(kuò)增后的細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面標(biāo)記物，結(jié)果顯示，CD29、CD90、CD105、CD146呈陽(yáng)性表達(dá)，CD34、CD45陰性表達(dá)（圖2）。分化誘導(dǎo)14 d后，細(xì)胞呈復(fù)層生長(zhǎng)，出現(xiàn)顆粒狀結(jié)節(jié)，茜素紅染色陽(yáng)性（圖3a），鏡下見大量著色的礦化結(jié)節(jié)（圖3b）。細(xì)胞成脂誘導(dǎo)21 d，油紅O染色顯示胞漿內(nèi)出現(xiàn)散在脂滴（圖3c）。

圖1 組織塊周圍細(xì)胞爬出情況（倒置顯微鏡，×10）

圖2 流式細(xì)胞儀鑒定干細(xì)胞表面標(biāo)記物

圖3 hDPSCs分化能力鑒定

2．2 DPSCs、成牙本質(zhì)細(xì)胞分化過程中Oct4可變剪接體及其調(diào)控分子TIP110、干性分子（Sox2和Klf4）表達(dá)改變

Western blot結(jié)果顯示未經(jīng)礦化誘導(dǎo)的人牙髓干細(xì)胞不表達(dá)DSPP，經(jīng)礦化誘導(dǎo)7、14 d后，牙髓干細(xì)胞高表達(dá)DSPP，且隨誘導(dǎo)時(shí)間增加表達(dá)增強(qiáng)（圖4A）。qPCR結(jié)果顯示Oct4A和干性分子（Sox2，Klf4）在牙髓干細(xì)胞未經(jīng)分化誘導(dǎo)，分化誘導(dǎo)7、14 d均有表達(dá)，而Oct4B表達(dá)陰性，Oct4A、Sox2和Klf4隨誘導(dǎo)時(shí)間增加表達(dá)量明顯降低（P＜0．05），誘導(dǎo)14 d表達(dá)低于7 d（P＜0．05）；Oct4可變剪接調(diào)控分子TIP110與Oct4A在牙髓干細(xì)胞成牙本質(zhì)分化誘導(dǎo)過程中表達(dá)趨勢(shì)相同，在牙髓干細(xì)胞未經(jīng)分化誘導(dǎo)，分化誘導(dǎo)7、14 d均有表達(dá)，且隨誘導(dǎo)時(shí)間增加表達(dá)量明顯降低（P＜0．05）（圖4B）。

2．3 DPSCs成牙本質(zhì)分化誘導(dǎo)前后Oct4A表達(dá)定位

激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)未經(jīng)分化誘導(dǎo)的hDPSC Oct4A主要位于細(xì)胞核，hDPSC成牙本質(zhì)向誘導(dǎo)分化21 d時(shí)Oct4A表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)（圖5）。

圖4 hDPSCs經(jīng)礦化誘導(dǎo)分化前后相關(guān)基因的表達(dá)

圖5 Oct4A免疫熒光染色結(jié)果（×60）

3 討論

轉(zhuǎn)錄因子Oct4可與Sox2、Klf4協(xié)同共同維持干細(xì)胞多能狀態(tài)，當(dāng)Oct4表達(dá)受抑制，干細(xì)胞干性相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞發(fā)生分化［9］。Oct4選擇性剪接形成Oct4A、Oct4B兩種主要可變剪接體，但研究顯示只有剪接體Oct4A參與維持干細(xì)胞的全能性［10］。本研究著重觀察DPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化過程中轉(zhuǎn)錄因子Oct4可變剪接體表達(dá)改變，以初步探究Oct4可變剪接體在DPSCs干性維持中作用。本結(jié)果表明DPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化過程中伴隨著成牙本質(zhì)細(xì)胞特異標(biāo)記物DSPP表達(dá)增高，細(xì)胞其干性基因表達(dá)明顯降低，同時(shí)在未經(jīng)分化誘導(dǎo)DPSCs檢測(cè)到Oct4A剪接體，且誘導(dǎo)分化后表達(dá)降低，并發(fā)生胞核向胞漿轉(zhuǎn)位，但剪接體Oct4B在誘導(dǎo)DPSCs分化前后均不表達(dá)。

Oct4兩種主要可變剪接體不同的表達(dá)分布提示二者功能不同。本研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的DPSCs表達(dá)Oct4A，但不表達(dá)Oct4B，在誘導(dǎo)DPSCs成牙本質(zhì)細(xì)胞分化過程中伴隨干性分子Sox2和Klf4表達(dá)降低，Oct4A的表達(dá)也明顯降低，表明Oct4可變剪接體中Oct4A是真正發(fā)揮調(diào)控DPSCs干性維持的分子。Wang等報(bào)道，Oct4B對(duì)應(yīng)急狀態(tài)的細(xì)胞具有保護(hù)作用［11］。有研究發(fā)現(xiàn)炎癥牙髓組織中Oct4BmRNA水平顯著高于正常牙髓組織［12］，提示可能與牙髓組織的免疫應(yīng)答有關(guān)。

基因mRNA水平上的可變剪接是指從一個(gè)mRNA前體中通過不同的剪接方式（選擇不同的剪接位點(diǎn)組合）產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體的過程。研究顯示90%的人類基因會(huì)在選擇性剪接的作用下產(chǎn)生功能相同、不同甚至拮抗的多個(gè)同源異構(gòu)體（isoform），從而增加蛋白質(zhì)的多樣性。已證實(shí)單個(gè)基因選擇性剪接模式的異常即可引起細(xì)胞表性改變，發(fā)育異常和疾病。有研究提示Ⅱ型牙本質(zhì)發(fā)育不全癥（DGI－Ⅱ）的發(fā)生與牙本質(zhì)涎磷蛋白選擇性剪接位點(diǎn)基因點(diǎn)突變相關(guān)，提示維持正常選擇性剪接模式是牙齒發(fā)育的重要因素［13］。Liu等報(bào)道TIP110調(diào)控Oct4的選擇性剪接，過表達(dá)TIP110可上調(diào)Oct4A的表達(dá)量，抑制TIP110表達(dá)則不能形成剪接體Oct4A，但并不影響剪接體Oct4B的形成［6］。本研究也發(fā)現(xiàn)TIP110在DPSCs經(jīng)成牙本質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化中的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化與Oct4A的表達(dá)一致，提示在DPSCs內(nèi)TIP110可能參與調(diào)控Oct4可變剪接過程中Oct4A表達(dá)，但機(jī)制仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位是調(diào)控核蛋白活性的重要機(jī)制。文獻(xiàn)報(bào)道，多種胞核分子信號(hào)通路參與調(diào)控核蛋白胞漿轉(zhuǎn)位［14－15］。Oct4A作為轉(zhuǎn)錄因子主要位于未分化的細(xì)胞核內(nèi)以維持干細(xì)胞的全能性［16］。本實(shí)驗(yàn)熒光染色結(jié)果顯示在未經(jīng)分化誘導(dǎo)DPSCs中Oct4A主要表達(dá)在胞核，但礦化誘導(dǎo)21 d后表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)，發(fā)生胞核向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位，也進(jìn)一步提示Oct4A在維持DPSCs未分化狀態(tài)中具有重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)特定激酶介導(dǎo)的磷酸化調(diào)控著轉(zhuǎn)錄因子核漿穿梭的過程。Ferro等發(fā)現(xiàn)在DPSCs中絲／蘇氨酸蛋白激酶CK－II介導(dǎo)的Oct4A蛋白磷酸化程度減少是導(dǎo)致Oct4A發(fā)生胞核向胞漿轉(zhuǎn)位的主要原因［9］。Spelat等發(fā)現(xiàn)Oct4A含有6個(gè)特定的ERK磷酸化結(jié)合位點(diǎn)，ERK通過磷酸化Ser111位點(diǎn)增強(qiáng)Oct4A從胞核到胞質(zhì)轉(zhuǎn)位［17］。

DPSCs干性維持是由多種基因、蛋白和外界因素共同決定的。本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)DPSCs內(nèi)Oct4A通過其表達(dá)量改變和核漿穿梭效應(yīng)參與調(diào)控維持細(xì)胞未分化狀態(tài)，但其調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

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Expressions of Oct4 isoforms during odontoblastic differentiation of human dental pulp stem cells

HE Ying，GUAN Li－na，SUN Xue－fei，HAN Bing，ZHANG Ya－qing，YANG Fan
（State Key Laboratory of Military Stomatology，Department of Operative Dentistry and Endodotics，School of Stomatology，The Fourth Military Medical University，Shaanxi Key Laboratory of Stomatology，Xi′an 710032，China）

AIM：To examine the expression of Oct4 isoforms during odontoblastic differentiation of human dental pulp stem cells（hDPSCs）．METHODS：hDPSCswere cultured in odontogenic inductionmedium．Expression of Oct4 isoforms（Oct4A and Oct4B），stem cellsmarkers Sox2，Klf4 and DSPPwere detected by RT－PCR．The protein location of Oct4A in hDPSC was detected by confocal laser scanningmicroscope（CLSM）．RESULTS：hDPSCs positively expressed CD146，CD105，CD90 and CD29，but negatively expressed CD45 and CD34．Oct4A isoform and Sox2 and Klf4 were downregulated after odontogenic induction（P＜0．05），while Oct4B isoform was not detected before and after induction of hDPSCs．TIP110 showed the same dynamic changeswith Oct4A during odontoblastic differentiation．Moreover，Oct4A was translocated from nuclear to cytoplasm after odontogenic induction．CONCLUSION：The stemness of hDPSC are reduced during odontogenic induction．Downregulation and translocation of spliced variant Oct4A indicates that itmay play a role inmaintaining stemness of hDPSC．

dental pulp stem cell；Oct4；odontoblastic induction；alternative splicing variant

R780．2

A

1005－2593（2015）05－0282－06

10．15956／j．cnki．chin．j．conserv．dent．2015．05．005

2014－12－20；

：2015－03－30

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81070803，81170930）

陜西省國(guó)際合作課題（2011KW－40）

賀瑩（1989－），女，漢族，陜西榆林人。碩士生（導(dǎo)師：張亞慶）

張亞慶，E－mail：Zhangyaqq＠fmmu．edu．cn

楊 帆，E－mail：yangfan＠fmmu．edu．cnn