復合益生菌菌液對奶牛產奶量和腸道菌群的影響

張海榮，黃 華，唐景春*，張清敏,，王希年，許艷龍

(1.南開大學環(huán)境科學與工程學院，天津 300071；2.吉林九豐生物科技開發(fā)有限公司，吉林 通化 134001)

?

復合益生菌菌液對奶牛產奶量和腸道菌群的影響

張海榮1，黃 華1，唐景春1*，張清敏1,2，王希年2，許艷龍2

(1.南開大學環(huán)境科學與工程學院，天津 300071；2.吉林九豐生物科技開發(fā)有限公司，吉林 通化 134001)

為了研究復合益生菌菌液對奶牛產奶量、乳品質量、牛群健康和腸道菌群的影響，選擇20頭條件相近的健康奶牛隨機分為試驗組和對照組，采用菌液與飼料混合的方法飼喂牛群，考察其對奶牛產奶量，腸道菌群乳品質量和牛群健康的影響。結果表明，食用復合益生菌液的每頭牛比對照組平均每天可以多產2.9 kg牛奶，提高產奶量14.8%，差異極顯著 (P<0.01 )，經濟效益顯著；復合益生菌菌液可以促進腸道菌群調整，使有益菌-主要是乳酸菌成為優(yōu)勢菌群，并可以抑制霉菌和降解霉菌毒素，降低牛乳中體細胞數，預防隱性乳腺(房)炎。

復合益生菌；產奶量；PCR-DGGE；乳酸菌；霉菌；體細胞數

益生菌是一種活性微生物制劑，廣泛應用于畜牧、水產等養(yǎng)殖業(yè)[1-4]。其中主要菌種是乳酸菌[5-6]、芽孢桿菌[7]、酵母菌[8-9]等。這些有益活性菌群在消化道內與病原菌競爭黏附位點，形成屏障，產生多種抗菌物質、維生素、有機酸和多種消化酶，降解霉菌毒素等。因此，能夠提高畜禽以及魚蝦飼料轉化率和對營養(yǎng)物質的吸收率，提高其抗病能力和抗應激能力，對機體產生明顯的生理效應和生態(tài)效應，從而提高經濟效益。

微生態(tài)制劑在反芻動物生產上的應用報道較少，單一的益生菌菌劑，如枯草芽孢桿菌或酵母培養(yǎng)物，在奶牛生產上的使用在國內已有一些報道[10]。但是，多種益生菌制成復合益生菌菌液，應用于奶牛生產還鮮有報道。為此，本研究采用多次、多點試驗的方法，探討了乳酸菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌等多種菌擴大培養(yǎng)的菌液對奶牛產奶性能的影響，并對其經濟效益進行了分析，旨在為復合益生菌廣泛應用于奶牛生產提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗用復合益生菌菌液

試驗用復合益生菌菌液由某公司研制，含有效活菌數1×1010CFU/mL，主要由乳酸菌、芽孢桿菌、光合細菌和酵母菌等組成。

1.2 試驗設計

選擇年齡、胎次、泌乳月份、產奶量、體重以及健康狀態(tài)相近的20頭荷斯坦奶牛，隨機分為對照組10頭，編號分別為1～10；試驗組10頭，編號分別為11～20。試驗組每天每頭牛第一餐草料中添加50 mL復合益生菌菌液，對照組每天每頭牛第一餐草料中相應多添加50 mL飲用水。兩組的飼料以及管理條件都完全相同。奶牛自由飲水，自由吃料，每天擠奶2次，喂料2次。試驗期21 d，其中預試驗期7 d，每天檢測試驗組和對照組的產奶總量，并計算頭均產奶量；從第8～21 d開始每2 d檢測試驗組和對照組的產奶總量，并計算頭均產奶量。在整個試驗期內還要記錄因下雨、干熱風等惡劣天氣因應激反應造成對產奶量的影響。

1.3 牛糞中乳酸菌和霉菌的檢測

為了解添加復合益生菌菌液后對牛腸道菌群的影響，于試驗的第10天早晨分別多次采集對照組與試驗組牛群新排出糞便，迅速冷藏運回實驗室。分別用乳酸菌培養(yǎng)基(MRS)和霉菌培養(yǎng)基(高鹽察氏培養(yǎng)基)培養(yǎng)并計數，觀察腸道中乳酸菌和霉菌的生態(tài)變化[11-12]。

將對照組和試驗組的冷藏鮮牛糞采用四分法，各分出10 g加于90 mL無菌水中，置于室溫下200 r/min，振蕩30 min，作為10-1稀釋液，然后從10-1稀釋液中在無菌條件下取1 mL加到9 mL無菌水中為10-2，依次制成10-3、10-4、10-5、10-6稀釋液。然后取10-4、10-5、10-6各1 mL加入滅菌的平板內，平板再加入適量乳酸菌瓊脂培養(yǎng)基混合均勻。先平放20 min，而后倒置于35℃溫箱內培養(yǎng)24～48 h；同樣取10-4、10-5、10-6各1 mL加到霉菌的瓊脂培養(yǎng)基內，37℃溫箱培養(yǎng)24～48 h。

1.4 牛乳中體細胞數檢測

采用美國加利福尼亞體細胞檢驗法(Califomia Mastitis Test CMT)[13]。具體操作方法是在診斷盤(深1.5 cm，直徑5 cm的乳白色平皿)內加被檢乳樣2 mL，再加2 mL CMT診斷液，平置診斷盤并使呈同心圓旋轉搖動，使乳液與診斷液充分混合，10～30 s后觀察混合液狀態(tài)，并與標準對照表比較，確定混合液的級數(N、T、1、2、3級)。對應的體細胞數為：N級0～2×105/mL，T級2～4×105/mL，1級4～12×105/mL，2級12～50×105/mL，3級5×106/mL以上。如果體細胞數一直持續(xù)很高，說明奶牛已患有乳房炎，可能由葡萄球菌、鏈球菌、棒狀桿菌、沙門氏菌或大腸桿菌等感染[14-15]。分別檢測試驗組奶牛在食用復合益生菌菌液前和連續(xù)食用復合益生菌菌液兩周后所產牛奶的體細胞數。

1.5 牛糞微生物群落的PCR-DGGE測定

牛糞中微生物多樣性的測定采用基因擴增-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術。牛糞中微生物DNA使用試劑盒(Zyme Research ZR Soil Microbe DNA MicroPrep)提取。PCR引物為16S rRNA保守區(qū)通用引物(F357GC：5'-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAGCAG-3'，R518：5-'ATT ACC GCG GCT GCT GG-3')。PCR反應程序為：94 ℃，5 min，預變性；94 ℃，30 s變性；56℃，40 s退火；72 ℃，60 s延伸，循環(huán)35次；72 ℃，5min，最后一次延伸，擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

利用DGGE電泳(DcodeTM，Bio-Rad)分離PCR產物，細菌DNA電泳條件為：8%丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺=37.5∶1)，30%～60%變性梯度，140V穩(wěn)壓，60℃恒溫下電泳220 min，EB染色20 min，最后利用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析。

1.6 數據處理

產奶量的變化采用SPSS統(tǒng)計軟件10.0進行方差分析和多重比較(Duncan法)。試驗結果用平均數±標準誤表示。利用Quantity one 4.62軟件(Bio-Rad)對DGGE電泳條帶進行分析，采用Shannon-Weiner指數和多樣性指數進行微生態(tài)多樣性分析。

2 結果與分析

2.1 產奶量變化

預試期與試驗期內對照組與試驗組產奶量的變化如表1所示。由表1知，每天每頭牛在日糧中添加復合益生菌菌液50 mL，與對照組相比每天每頭牛平均可多產奶2.9 kg，提高產奶量14.8%(P<0.01)。

表1 奶牛產奶量的變化(kg)

注：第19天下雨，氣溫驟降，產奶量降低，但試驗組降低較少。

Notes： * notified that on day 19th, rain and sudden lowering of temperature decreased the milk yield of control group significantly; however, it did not affect much on test group.

2.2 鮮牛糞中乳酸菌與霉菌

多次糞樣平板培養(yǎng)檢測結果如表2所示，對照組糞樣：乳酸菌含量為1.7×106CFU/mL，霉菌含量為1.3×107CFU/mL；而試驗組糞樣：乳酸菌含量達1.3×108CFU/mL，而霉菌幾乎無菌落長出。

表2 牛糞中乳酸菌和霉菌含量

注：“-”代表沒有檢測到

Notes： - marked a number next to zero.

2.3 牛乳中體細胞數

牛乳中體細胞數是反映牛奶質量和牛群健康程度的一項重要指標。國際上也將牛乳體細胞數作為判定奶牛隱性乳房炎的標準，一般認為體細胞數<40萬/mL為合格乳，正常牛乳中體細胞數一般在20～30萬/mL之間，而超過此范圍牛乳的品質就會降低。當乳汁中含有大量體細胞，且超過50萬/mL時，奶牛就已經患上乳腺炎[16]。由表3可知，采用美國加州體細胞檢驗法(CMT)檢測發(fā)現，食用益生菌菌液之前試驗組牛乳中的體細胞數較高且部分大于>50萬/mL，而食用益生菌菌液14 d后，試驗組牛乳中體細胞數均比食用益生菌菌液之前降低，并均在40萬/mL以下。說明復合益生菌菌液可以降低牛乳中體細胞數，可以預防乳腺(房)炎。

表3 食用復合益生菌菌液前和連續(xù)食用兩周后

2.4 PCR-DGGE

采用ZR土壤DNA提取試劑盒分別從試驗組和對照組的鮮牛糞樣中提取基因組DNA，再擴增細菌16SrDNA V3區(qū)，經過變性梯度凝膠電泳，因每種細菌的V3區(qū)有差別，因而在梯度變性劑和電泳泳動作用下分離出不同的條帶。結果如圖1所示。

圖1 PCR-DGGE指紋圖譜及Quantity one軟件處理圖

1.fresh fecal of test group; 2.fresh fecal of control group

由圖1可以看出，試驗組糞樣中細菌條帶有27條，對照組有22條，說明試驗組牛群腸道菌群多樣性和微生態(tài)穩(wěn)定性優(yōu)于對照組。

由表4可以看出，飼喂復合益生菌菌液之后，試驗組奶牛糞便菌群的Shannon-wiener指數比對照組增大，說明奶牛腸道中的菌群多樣性增大，群落的復雜程度增高；試驗組奶牛糞便菌群的均勻度指數比對照組在一定程度上增大，說明飼喂益生菌菌液后，牛群腸道菌群的微生態(tài)穩(wěn)定性增強。

表4 牛糞中微生態(tài)的多樣性指數

3 討 論

奶牛采食被霉菌毒素污染過的飼料時，會造成瘤胃代謝紊亂、繁殖率降低(流產率增加)[17-18]、牛奶中體細胞數增加和產奶量下降以及乳房炎、蹄病等的發(fā)生。這也是導致奶牛產奶量不高，奶品質量降低的重要原因[19-20]。而益生菌在進入奶牛胃腸道后，促進腸道菌群調整，使有益菌(主要是乳酸菌)占有生態(tài)位，成為優(yōu)勢菌群，抑制了霉菌的生長和霉菌毒素的產生。從而使奶牛乳房炎等疾病的發(fā)病率降低，提高了產奶量，并降低了牛奶中的體細胞數，提高了奶品質量。

在奶牛日糧中平均每頭牛添加50 mL益生菌菌液，在設有嚴格對照(條件完全相同)、氣溫平穩(wěn)、空氣質量較好的情況下，每頭牛比對照組平均每天可以多產2.9 kg牛奶。但考慮到一般奶牛養(yǎng)殖小區(qū)不可能同時挑選出在產奶量、產奶月份、胎次以及體重、健康情況完全相近的對照組與試驗組牛群，另外，也很難選擇氣溫穩(wěn)定、空氣質量較好的時間段。因此，綜合考慮其他因素的影響，在奶牛日糧中平均每頭牛添加50 mL益生菌菌液，確定增加產奶量在1.5～2.0 kg/天·頭為指標是適宜的。在日糧中添加復合益生菌菌液50 mL/(天·頭)，投入成本約為1.60元/(天·頭)；增加產奶量按1.5～2.0 kg/(天·頭)計，按照鮮奶市場價(3.5元/kg)計算，增加收益為5.25～7.0元/(天·頭)，因此，每天每頭奶?？啥嘣黾兪杖脒_3.65～5.4元，經濟效益顯著。

4 結 論

食用復合益生菌液的奶牛比對照組平均每天可以多產2.9 kg牛奶，提高產奶量14.8%;復合益生菌菌液可以促進腸道菌群調整，使有益菌-主要是乳酸菌成為優(yōu)勢菌群，并可抑制霉菌和降解霉菌毒素，降低牛乳中體細胞數，預防隱性乳腺(房)炎。復合益生菌菌液在奶牛養(yǎng)殖方面具有廣闊的應用前景。

[1] 王運亨.影響奶牛產奶量及原料奶質量的主要因素[J].中國奶牛,2003(6):10-13.

[2] 劉彩娟,孫滿吉,孫金艷,等.飼糧中添加復合益生菌對奶牛瘤胃發(fā)酵及纖維素酶活的影響[J].動物營養(yǎng)學報,2011,23(5):821-827.

[3] 張克春,徐國忠,吳顯實,等.日糧添加富硒益生菌對奶牛乳房炎和乳汁體細胞數的影響[J].上海交通大學學報:農業(yè)科學版,2010,28(1):59-63.

[4] 張志軍,劉 敏,馬光輝,等.日糧中添加復合益生菌對奶牛生產性能的影響[J].新疆農業(yè)科學,2012,49(4):760-764.

[5] Giri S S, Sukumaran V, Sen S S, et al. Effects of dietary supplementation of potential probiotic Bacillus subtilis VSG1 singularly or in combination with Lactobacillus plantarum VSG3 or/and Pseudomonas aeruginosa VSG2 on the growth, immunity and disease resistance of Labeo rohita[J].Aquaculture Nutrition,2014,20(2):163-171.

[6] Allameh S K, Yusoff F M, Daud H M, et al. Characterization of a Probiotic Lactobacillus fermentum Isolated from Snakehead, Channa striatus, Stomach[J].Journal of the World Aquaculture Society,2013,44(6):835-844.

[7] Zhang Q,Yu H,Tong T,et al. Dietary supplementation of Bacillus subtilis and fructooligosaccharide enhance the growth, non-specific immunity of juvenile ovate pompano,Trachinotus ovatus and its disease resistance against Vibrio vulnificus[J].Fish & shellfish immunology,2014,38(1):7-14.

[8] Gunasundari V, Kumar T T, Ghosh S, et al. An ex vivo Loom to Evaluate the Brewer's Yeast Saccharomyces cerevisiae in Clownfish Aquaculture with Special Reference to Amphiprion percula (Lacepede,1802)[J].Turkish Journal of Fisheries and Aquatic Sciences,2013,13(3):389-395.

[9] Prasad L, Nayak B B, Srivastava P P, et al. Use of Brewer's Yeast Saccharomyces cerevisiae as growth promoter in giant freshwater prawn (Macrobrachium rosenbergii De man) post larvae[J].Turkish Journal of Fisheries and Aquatic Science,2013,13:447-452.

[10] 趙 珺,黃玉珍.枯草芽孢桿菌與酵母培養(yǎng)物對奶牛產奶性能的影響研究[J].長春大學學報,2007,17(08M):52-56.

[11] 冷曉飛,姜海峰,劉小林,等.皺紋盤鮑腸道菌群組成及PCR-DGGE指紋圖譜分析[J].海洋科學,2013,37(5):10-14.

[12] 王春敏,佟麗波,韓桂華,等.利用PCR-DGGE技術分析抗生素對小鼠腸道菌群多樣性的影響[J].中國老年學雜志,2014,(8):2 154-2 155.

[13] 劉 峰,遲玉杰.乳房炎乳的檢測方法[J].現代食品科技,2005,21(1):129-131.

[14] 何 挺,毛超群,江興軍,等.一個高體細胞數牧場奶牛隱性乳腺炎病原菌的調查[J].中國奶牛,2010(8):38-41.

[15] 王希春,李 培,吳金節(jié).奶牛隱性乳房炎對牛奶中體細胞數及品質的影響[J].中國奶牛,2008(4):49-51.

[16] 劉海霞.牛乳體細胞數的檢測方法[J].中國乳品工業(yè),2004,32(6):31-34.

[17] 許英民.奶牛常見飼料中毒及其防治[J].今日畜牧獸醫(yī):奶牛,2012(2):64-66.

[18] 陳玉山,郭 鵬,陳 蓉,等.玉米霉變對奶牛養(yǎng)殖業(yè)危害及應對措施[J].新疆畜牧業(yè),2012(1):62-63.

[19] Bryden W L. Mycotoxin contamination of the feed supply chain: Implications for animal productivity and feed security[J].Animal Feed Science and Technology,2012,173(1):134-158.

[20] 高 潮,鄭云峰,楊正坤,等.模擬胃腸道環(huán)境對霉菌毒素吸附劑吸附效果評估[J].中國飼料添加劑,2014(2):24-28.

Effect of Probiotic Complex on the Milk Yield and Intestinal Flora of Dairy Cow

ZHANG Hai-rong1，HUANG Hua1，TANG Jing-chun1*，ZHANG Qing-min1,2，WANG Xi-nian2，XU Yan-long2

(1.CollegeofEnvironmentalScienceandEngineering,NankaiUniversity,Tianjin300071,China;2.JilinJIUFENGBiotechnologyDevelopmentCo.Ltd,Tonghua,Jilin134001,China)

To study the effect of Probiotic Complex on the milk yield, milk quality, physical condition and intestinal flora of dairy cow, twenty Holstein cows with substantially the same age, birth parity, lactation month and milk yield were selected and divided into test group and control group. The test group was fed with fodder mixed with probiotic complex, and its effect on intestinal flora of dairy cow was examined through plate count and PCR-DGGE. Califomia Mastitis Test (CMT) was conducted to investigate its effect on milk quality and physical condition of cows. Results showed that the cows fed with Probiotic Complex could produce 2.9 kg more milk than the control group, milk yield rose by 14.8%, the difference was significant (P<0.01) and this will make significant economic benefits. Probiotic Complex may help intestinal flora to adjust so that the beneficial bacteria mainly Lactobacillus become dominant. Furthermore, it will inhibit mildew and degrade mycotoxins, reduce the number of somatic cells in milk, and prevent recessive breast (room) inflammation.

probiotic complex; milk yield; PCR-DGGE; lactobacillus; mildew; somatic cell number

2014-07-07，

2014-11-25

國家自然科學基金(31270544)；國家高技術研究發(fā)展計劃(863)重大項目(2013AA06A205)

張海榮(1990-),女，山東菏澤人，碩士研究生，研究方向：生物修復。E-mail: zhanghairong1017@sina.com

*[通訊作者] 唐景春(1968-)，男，天津靜海人，教授，博士生導師，研究方向：生態(tài)修復。E-mail: tangjch@nankai.edu.cn

S811.6

A

1005-5228(2015)01-0042-04