綿羊骨骼肌特異表達(dá)miR-133前體在不同綿羊群體中的多態(tài)檢測(cè)

宋廣超，張 偉，許瑞霞，趙偉利，劉守仁,*，甘尚權(quán)

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，新疆 石河子 832000)

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綿羊骨骼肌特異表達(dá)miR-133前體在不同綿羊群體中的多態(tài)檢測(cè)

宋廣超1,2，張 偉1,2，許瑞霞1,2，趙偉利1,2，劉守仁1,2,*，甘尚權(quán)2,*

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，新疆 石河子 832000)

試驗(yàn)旨在研究骨骼肌中特異表達(dá)miR-133前體在不同綿羊群體中的多態(tài)，分析其與綿羊骨骼肌發(fā)育表型的相關(guān)性。采用PCR-SSCP技術(shù)對(duì)miR-133前體序列在特克賽爾羊、中國(guó)美利奴細(xì)毛羊、阿勒泰羊和湖羊四種不同產(chǎn)肉性能的綿羊群體進(jìn)行了多態(tài)性檢測(cè)，并分析多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)miR-133前體序列二級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及加工、成熟的影響。結(jié)果表明，miR-133前體序列下游194 bp(g.54047535)處檢測(cè)到A>G突變，并且該SNP與綿羊的產(chǎn)肉性能存在明顯的相關(guān)性，在特克賽爾羊中GG是優(yōu)勢(shì)基因型， G等位基因頻率高達(dá)0.86，是中國(guó)美利奴細(xì)毛羊群體該位點(diǎn)頻率的4倍。二級(jí)結(jié)構(gòu)的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，該SNP位點(diǎn)致使miR-133前體的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，自由能值降低3.2 kJ/mol。以上結(jié)果提示，綿羊miR-133前體序列的SNP(g.54047535)位點(diǎn)可能對(duì)miR-133前體的加工成熟具有重要影響，并最終影響綿羊的產(chǎn)肉性能。

pri-miRNA；pre-miRNA；miR-133；多態(tài)性；骨骼??；綿羊

miRNA(microRNA)是一類長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，通過(guò)調(diào)控其靶基因的表達(dá)水平而發(fā)揮重要的生物學(xué)作用[1]。miRNA的轉(zhuǎn)錄、加工、成熟需要諸多蛋白質(zhì)的參與，在細(xì)胞核中，miRNA先由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄(有少部分是由RNA聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄)產(chǎn)生一個(gè)長(zhǎng)約1 000 bp的初始轉(zhuǎn)錄本(primary miRNA, pri-miRNA)，然后由核酸內(nèi)切酶Drosha切割成為長(zhǎng)約幾十個(gè)堿基的前體，稱之為precursor miRNA(pre-miRNA)[2]，再由Exportin 5轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)。在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miRNA由另一種核酸內(nèi)切酶Dicer切割成為成熟的miRNA，并與Argonaut結(jié)合成為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex, RISC)發(fā)揮基因表達(dá)調(diào)節(jié)作用[3]。大量研究表明，miRNA在基因表達(dá)過(guò)程中發(fā)揮著廣泛而重要的調(diào)控作用[4-5]，人類約有30%的基因受miRNA的調(diào)控[6]。

核酸內(nèi)切酶Drosha和Dicer通過(guò)識(shí)別miRNA前體的特異構(gòu)象對(duì)其進(jìn)行切割加工[2-3]，所以miRNA前體序列的突變，必然會(huì)影響其構(gòu)象，進(jìn)而使其加工成熟發(fā)生變化，使成熟miRNA水平上調(diào)或下調(diào)，并最終影響到其對(duì)靶基因的調(diào)控，如果突變發(fā)生在"種子序列"，則有可能失去對(duì)原有靶基因的調(diào)控或者產(chǎn)生新的靶基因，使生物的相應(yīng)性狀發(fā)生改變甚至產(chǎn)生疾病[7]。例如，miR-146a(C>G, rs2910164), miR-149(T>C, rs2292832)和miR-196a2(T>C, rs11614913)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)與希臘人群中的胃癌發(fā)病率密切相關(guān)[8]，miR-185 的兩個(gè)SNPs(C>T, rs2008591和 A>G, rs887205)與非洲人群中乳腺癌的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)性[9]。

到目前為止，miRNA前體多態(tài)性的相關(guān)研究主要集中在其與疾病發(fā)生之間的關(guān)系上，而對(duì)其它的生物學(xué)功能研究較少。近期的研究結(jié)果表明，在哺乳動(dòng)物骨骼肌分化和增殖過(guò)程中，miRNA的調(diào)控發(fā)揮著重要作用[10-12]，本實(shí)驗(yàn)室前期高通量測(cè)序的結(jié)果也表明，在綿羊骨骼肌發(fā)育過(guò)程中大約有300種miRNA表達(dá)，但是其中的22種miRNA的表達(dá)量占到99.6%(該部分?jǐn)?shù)據(jù)未發(fā)表)?？梢酝茢?，這22種miRNA在綿羊骨骼肌的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

miR-133在哺乳動(dòng)物的骨骼肌和心肌中特異表達(dá)[15]，小鼠的miR-133和miR-1基因成簇排列于2號(hào)和18號(hào)染色體上，并同時(shí)被轉(zhuǎn)錄出來(lái)，其中一個(gè)初始轉(zhuǎn)錄本(pri-miRNA)長(zhǎng)約6 kb，經(jīng)兩次剪切加工后形成22 bp的成熟miRNA。miR-133通過(guò)調(diào)控其靶基因而促進(jìn)肌細(xì)胞的增殖[12]。綿羊的miR-133基因位于13號(hào)染色體上，本實(shí)驗(yàn)室的前期研究結(jié)果表明，miR-133在綿羊骨骼肌中高表達(dá)，但其在不同綿羊群體中的多態(tài)性檢測(cè)及其功能分析還未見(jiàn)報(bào)道?；诖耍疚囊詍iR-133為研究對(duì)象，采用PCR-SSCP檢測(cè)其在不同綿羊品種中的多態(tài)性，并分析其與綿羊產(chǎn)肉性能之間的相關(guān)性，為綿羊肌肉發(fā)育調(diào)控機(jī)理的研究及優(yōu)良肉羊品種的培育提供參考。

1 材料與方法

1.1 血樣采集及基因組提取

150份阿勒泰羊血樣采自阿勒泰富蘊(yùn)縣阿勒泰羊種群核心區(qū)，100份中國(guó)美利奴細(xì)毛羊血樣采自新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)八師150團(tuán)紫泥泉種羊場(chǎng)，144份湖羊血樣采自江蘇省泰州海倫羊業(yè)有限公司。所有血樣均通過(guò)頸靜脈采集，每只羊采集10 mL，1.5%的EDTANa2抗凝，酚-氯仿法抽提基因組。90份特克賽爾羊基因組樣品由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所儲(chǔ)明星研究員饋贈(zèng)。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

從miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.mirbase.org/)調(diào)取綿羊miR-133的成熟序列(MIMAT0014972，ID: oar-miR-133)，并與UCSC(http://genome.ucsc.edu/)綿羊數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)并截取左右側(cè)翼各500 bp序列，在成熟序列上下游各200 bp左右設(shè)計(jì)引物，上游引物：pri-133295U25：5'-TTGGTCACGTGACTGACCCTCAGAC-3'，下游引物：pri-133780L25：5'- GTGATGCTGTGGTGTGCAGCAGACA-3'，引物由上海生工合成。

1.3 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)采用25 μL體系：10×PCR buffer 2.5 μL, dNTPs(10 mmol/L) 2 μL, 上下游引物 (10 μmol/L)各0.5 μL, Taq DNA聚合酶(2.5 U/μL) 0.5 μL, 模板DNA (100 ng/μL) 1 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，64℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目標(biāo)基因擴(kuò)增片段為485 bp。

1.4 SSCP分型及測(cè)序

取2 μL PCR產(chǎn)物混合8 μL變性上樣緩沖液，98 ℃變性10 min，立即置于冰上5 min，經(jīng)10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分型鑒定。電泳條件：在4～15 ℃溫度下，300 V電泳5 min，然后110 V電泳16 h。凝膠經(jīng)固定、銀染、顯色并拍照，然后根據(jù)不同的帶型對(duì)各樣品進(jìn)行分型鑒定。

根據(jù)SSCP分型結(jié)果，挑選不同帶型的PCR產(chǎn)物，經(jīng)回收純化后送北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序，以確定突變位點(diǎn)及序列。

1.5 多態(tài)位點(diǎn)對(duì)miR-133前體影響的分析

Pri-miRNA和pre-miRNA通過(guò)鏈內(nèi)堿基配對(duì)形成帶有多個(gè)頸環(huán)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)，并被核酸內(nèi)切酶Drosha和Dicer識(shí)別切割。前體序列的堿基突變尤其是位于莖部的堿基發(fā)生突變可能會(huì)使原有的堿基配對(duì)發(fā)生變化，造成其最小自由能升高(G，C突變?yōu)锳，U)或者降低(A，U突變?yōu)镚，C)，使其穩(wěn)定性發(fā)生變化而最終影響其加工成熟。所以可以通過(guò)計(jì)算其最小自由能的方法對(duì)pri-miRNA和pre-miRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性進(jìn)行預(yù)測(cè)。本文采用RNAstructure軟件用Zuker算法對(duì)miR-133野生型和突變型前體序列最優(yōu)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，并通過(guò)能值△G的變化比較兩種構(gòu)象的穩(wěn)定性。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用PCR-SSCP技術(shù)共檢測(cè)150份阿勒泰羊基因組，100份中國(guó)美利奴細(xì)毛羊基因組，144份湖羊基因組及90份特克賽爾羊基因組，以檢測(cè)miR-133前體序列的突變及其在上述四種不同綿羊品種中的分布。采用SPSS 13.0軟件計(jì)算不同綿羊品種的基因型及等位基因頻率，并使用卡方檢驗(yàn)分析各群體中基因型是否處于Hardy-Weinberg平衡。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR-SSCP分型及測(cè)序

以上述綿羊基因組為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，得到大小為485 bp的特異性條帶，目標(biāo)片段與預(yù)期大小一致，證明引物的特異性及擴(kuò)增效率均較高，符合SSCP檢測(cè)要求，部分PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1A。

經(jīng)過(guò)非變性聚丙烯酰胺丙烯酰氨凝膠電泳檢測(cè)，在上述4個(gè)綿羊品種中共檢測(cè)到三種基因型，分別命名為AA、GG和AG。分別將上述三種基因型的PCR產(chǎn)物純化回收后進(jìn)行測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)綿羊miR-133基因位于13號(hào)染色體上，在其成熟序列下游g.54047535處有一個(gè)A>G突變，雜合子測(cè)序峰圖表現(xiàn)為套峰。部分樣品的SSCP和對(duì)應(yīng)的測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖1B和圖1C。

圖1 部分PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖、非變性聚丙烯酰胺聚丙烯酰氨凝膠電泳圖及測(cè)序峰圖

A.gel electrophorogram of PCR agarophyte sugar, lane M is 100bp marker; lane 1～11 are PCR products.B.gel electrophorogram of AA，AG and GG polyacrylamides;C.sequencing peaks of various genetic samples，singlet peaks are AA and GG homo

zygotes,and set of peaks are AG heterozygotes

從表1可以看出，miR-133前體序列中g(shù).54047535SNP位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率在不同產(chǎn)肉性能綿羊品種中存在明顯的差異。特克賽爾羊是從國(guó)外引進(jìn)的優(yōu)良的肉樣品種，肌肉豐滿，產(chǎn)肉性能好，GG基因型頻率和G等位基因頻率分別達(dá)到77.8%和0.861，屬于優(yōu)勢(shì)基因型，而阿勒泰羊和湖羊?qū)儆谖覈?guó)地方品種，產(chǎn)肉性能較差，中國(guó)美利奴細(xì)毛羊?qū)儆诿醚蚱贩N，AA基因型屬于優(yōu)勢(shì)基因型。遺傳平衡分析表明，阿勒泰羊在該位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)，而特克賽爾羊處于不平衡狀態(tài)(P<0.05)，中國(guó)美利奴細(xì)毛羊和湖羊處于極不平衡狀態(tài)(P<0.01)，表明這兩個(gè)群體受到雜交改良與選擇的影響。

2.2 等位基因及基因型頻率

PCR-SSCP分型后，利用SPSS 13.0軟件計(jì)算g.54047535 位點(diǎn)SNP在4個(gè)綿羊品種中的等位基因頻率和基因型頻率，以及各基因型在群體中的遺傳平衡性，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 pri-miR-133序列的物種同源性分析

從UCSC(http://genome.ucsc.edu/)在線數(shù)據(jù)庫(kù)中釣取綿羊、牛、馬、人、猩猩、海豚、豬、雞、貓、狗、大鼠、小鼠、兔pre-miR-133及其上游和下游各300 bp序列，使用DNAMAN6.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，并繪制進(jìn)化樹(shù)(見(jiàn)圖2)。結(jié)果表明， miR-133前體序列同源性可以精準(zhǔn)地反映物種間的進(jìn)化關(guān)系。miR-133的前體序列的同源性在人與猩猩(靈長(zhǎng)目動(dòng)物)、綿羊與牛(洞角科動(dòng)物)中均高度保守，而人、猩猩、綿羊和牛等高等哺乳動(dòng)物與小鼠、雞等物種在進(jìn)化上較遠(yuǎn)。但是以上各種物種的成熟miR-133序列均高度一致，提示miR-133在動(dòng)物骨骼肌和心肌的正常生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

表1 基因頻率和基因型頻率在不同品種綿羊中的分布以及Hardy-Weinberg平衡的卡方檢驗(yàn)

2.4 SNP位點(diǎn)對(duì)miR-133前體構(gòu)象及穩(wěn)定性的影響

用RNAstructure軟件對(duì)miR-133野生型和突變型前體序列構(gòu)象進(jìn)行預(yù)測(cè)，并通過(guò)能值△G的變化比較兩種構(gòu)象的穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖2 miR-133前體序列在不同物種間的同源性及進(jìn)化關(guān)系

圖3 miR-133 g.54047535 SNP位點(diǎn)突變型(A)

由圖3可知，當(dāng)miR-133前體序列g(shù).54047535位點(diǎn)由A突變?yōu)镚后，使其構(gòu)象發(fā)生明顯改變，能值由原來(lái)的-44.3 kJ/mol，降低為-47.5 kJ/mol，結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。同時(shí)，由于該突變位點(diǎn)發(fā)生在頸環(huán)結(jié)構(gòu)的頸部，從而造成其構(gòu)象的較大變化，這種構(gòu)象的改變可能會(huì)影響到核酸內(nèi)切酶Drosha和Dicer對(duì)前體序列的識(shí)別和切割加工，從而改變成熟miR-133的水平，并最終使其對(duì)靶基因的調(diào)控水平發(fā)生改變。

3 討 論

miRNA通過(guò)調(diào)控其靶基因的表達(dá)，在動(dòng)物肌肉發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用。最典型的例子是特克賽爾(Texel)羊中miR-1和miR-206對(duì)肌肉生長(zhǎng)抑制素基因(myostatin，MSTN)的調(diào)控。MSTN是肌肉細(xì)胞的自分泌因子，在動(dòng)物骨骼肌中特異性表達(dá)并對(duì)肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用[13]。特克賽爾羊MSTN基因mRNA的3'UTR區(qū)發(fā)生一處堿基突變，恰好成為miR-1和miR-206的靶位點(diǎn)，使MSTN基因的表達(dá)受到抑制，所以特克賽爾羊表現(xiàn)出典型的雙肌性狀[14]。miR-1和miR-133在哺乳動(dòng)物的基因組中成簇排列，共同被轉(zhuǎn)錄，在動(dòng)物的心肌和骨骼肌中特異表達(dá)[15]。miR-133通過(guò)調(diào)控其靶基因促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖，對(duì)小鼠的研究表明，miR-133在胚胎期心肌和骨骼肌中的表達(dá)量較低，出生后表達(dá)量逐漸升高，直至成年階段達(dá)到最大值并保持穩(wěn)定[12]。成熟miRNA的表達(dá)水平會(huì)由于前體序列的改變而發(fā)生變化，如果這種序列變化發(fā)生在其"種子序列"，則可能無(wú)法識(shí)別靶基因而失去對(duì)其的調(diào)控，或者產(chǎn)生新的靶基因，并最終引起性狀的改變甚至發(fā)生疾病[7-16]。已有的研究結(jié)果表明，miRNA基因的突變主要發(fā)生在其成熟序列的上游和下游區(qū)域，而成熟序列在物種間高度保守[18-19]，本文新發(fā)現(xiàn)的miR-133前體序列的突變發(fā)生在其成熟序列下游194 bp處，而在其成熟序列區(qū)域未發(fā)生突變，與上述研究結(jié)果相一致。

本研究發(fā)現(xiàn)的miR-133前體序列g(shù).54047535位點(diǎn)的A>G突變，與綿羊的產(chǎn)肉性能存在明顯的相關(guān)，特克賽爾羊是優(yōu)良的肉樣品種， G等位基因頻率高達(dá)0.861，是A等位基因頻率的6.19倍。阿勒泰羊?qū)儆谥境练e能力較強(qiáng)的品種，中國(guó)美利奴細(xì)毛羊?qū)儆诿醚蚱贩N，湖羊的產(chǎn)肉性能均較差，該三品種綿羊?qū)儆诘湫偷姆侨庥醚蚱贩N，均以AA基因型為優(yōu)勢(shì)基因型。對(duì)突變與野生型miR-133前體的二級(jí)進(jìn)行生物信息分析，提示該突變位點(diǎn)可能會(huì)影響miR-133前體序列的加工，并使成熟miR-133水平提高，從而改變其對(duì)靶基因的調(diào)控，最終影響肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育。這推測(cè)已有數(shù)據(jù)支持，如Jun-Seong Lee等[17]在約克夏豬、蘭德瑞斯豬和巴克夏豬群體中發(fā)現(xiàn)miR-133b g.72008C>T處的SNP與瘦肉率和肉質(zhì)性狀存在相關(guān)性，約克夏豬、蘭德瑞斯豬中C等位基因頻率分別為0.97和0.93，CC基因型屬于優(yōu)勢(shì)基因型，而使用熒光實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)不同基因型成熟miR-133b水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明TT基因型成熟miR-133b水平顯著高于CC基因型。相比較Jun-Seong Lee發(fā)現(xiàn)的位置，所發(fā)現(xiàn)的miR-133突變更加靠近成熟的miR-133序列，對(duì)miR-133成熟體生物量的合成可能影響更大。

miRNA前體序列多態(tài)性研究是近幾年miRNA研究的重要內(nèi)容，已發(fā)現(xiàn)了大量與生長(zhǎng)發(fā)育和疾病相關(guān)的SNP，并且可以通過(guò)NCBI dbSNP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)，miRNA SNP(http://www.bioguo.org/miRNASNP/)等平臺(tái)方便查詢，對(duì)其功能的研究也在不斷深入，同時(shí)也從另一個(gè)方面證實(shí)了miRNA的調(diào)控作用對(duì)生物性狀表現(xiàn)的重要性，對(duì)miRNA調(diào)控機(jī)理的研究也將產(chǎn)生積極地推動(dòng)作用。

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Detection and Structure Prediction of Polymorphism at Skeletal Muscle-specific Pri-miRNA-133 among Different Sheep Breeds

SONG Guang-chao1,2, ZHANG Wei1,2, XU Rui-xia1,2, ZHAO Wei-li1,2, LIU Shou-ren1,2, GAN Shang-quan2*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShiheziUniversity,Shihezi832003,China;2.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinary,XinjiangAcademyofAgriculturalandReclamationSciences,Shihezi，Xingjiang832000,China; )

To study the polymorphism of skeleton muscle-specific pri-miR-133 among different sheep breeds and analyze its correlation with the muscle phenotype, pri-miR-133 polymorphism among four breeds with different meat production performance (Texel, Chinese Merino Fine Wool, Altay and Hu Sheep), and the effects of the pri-miR-133b polymorphism on its secondary structure, stability and the capacity of mature miR-133 processing were detected and analyzed by PCR-SSCP. The result showed that there was a A/G transversion at 194 bp downstream of pre-miR-133b, and the SNP was clearly associated with its corresponding meat traits. In Texel flock, GG genotype was the preponderant genotype, and G allele frequency reached 0.86, the value of G allele frequency in Texel was four times the frequency of G allele in Chinese Merino flock. The Secondary structure further bio informatics analysis showed that the mutation significantly changed the secondary structure of pre-miR-133, and the free energy value was reduced by 3.2 KJ/mol. The above indicated that the SNP in pri-miR-133 may have a significant impact on the processing of mature miR-133, and affect the performance of sheep meat production.

pri-miRNA；pre-miRNA；miR-133；polymorphism; skeletal muscle; sheep

2014-07-21，

2014-09-23

國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)基金(31160452、31060303)；新疆農(nóng)墾科學(xué)院引導(dǎo)計(jì)劃(YYD2010-9)

宋廣超(1990-)，男，山東濟(jì)寧人，碩士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物生產(chǎn)學(xué)。E-mail：wosongtengchao@126.com

*[通訊作者] 甘尚權(quán)(1977-)，男，安徽安慶人，副研究員，研究方向：綿羊分子育種設(shè)計(jì)。E-mail：shangquangan@163.com

S811.6

A

1005-5228(2015)01-0018-06