蘋果斑點(diǎn)落葉病菌抗戊唑醇突變體細(xì)胞膜透性及麥角甾醇含量研究

任璐，姚眾，趙曉軍，韓巨才,劉慧平*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，山西 太原 030032)

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蘋果斑點(diǎn)落葉病菌抗戊唑醇突變體細(xì)胞膜透性及麥角甾醇含量研究

任璐1，姚眾1，趙曉軍2，韓巨才1,劉慧平1*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，山西 太原 030032)

為明確蘋果斑點(diǎn)落葉病菌抗戊唑醇突變體的生理生化特性，探討其抗性機(jī)理，比較了敏感菌株和抗性突變體的滲透壓敏感性、細(xì)胞膜透性及藥劑處理后細(xì)胞內(nèi)甾醇含量的差異。結(jié)果表明：1)敏感菌株與各抗性突變體對(duì)不同滲透壓的敏感性沒有規(guī)律性，且突變體抗性水平與滲透壓敏感性之間沒有直接聯(lián)系；2)戊唑醇處理后各菌株之間電導(dǎo)率的變化表明，低抗菌株細(xì)胞膜透性較敏感菌株低，而中抗菌株膜透性則較敏感菌株高，能在相同時(shí)間內(nèi)滲出更多電解質(zhì)；3)細(xì)胞內(nèi)麥角甾醇含量測(cè)定結(jié)果表明，藥劑處理后，敏感菌株甾醇含量顯著降低，低抗菌株甾醇含量沒有顯著變化，而中抗菌株甾醇含量顯著升高。研究結(jié)果表明蘋果斑點(diǎn)落葉病菌對(duì)戊唑醇產(chǎn)生抗藥性時(shí)，伴隨其他理化特性的改變，為進(jìn)一步研究該病菌對(duì)戊唑醇的抗藥性奠定了基礎(chǔ)。

蘋果斑點(diǎn)落葉病菌；抗藥性；脫甲基抑制劑；膜透性；麥角甾醇

蘋果斑點(diǎn)落葉病(俗稱早期落葉病)是蘋果生產(chǎn)中一種常發(fā)病害，其病原Alternariaalternariaf.spmali，屬半知菌亞門真菌。該病害幾乎所有蘋果產(chǎn)區(qū)都會(huì)發(fā)生，在發(fā)病嚴(yán)重的果園，往往造成大量果樹提早脫葉，影響樹的長(zhǎng)勢(shì)，造成果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量的下降[1]。目前，生產(chǎn)上防治蘋果斑點(diǎn)落葉病仍然是殺菌劑結(jié)合其他手段共同防治[2]。近幾年，由于過多依賴化學(xué)農(nóng)藥，殺菌劑使用量不斷加大，導(dǎo)致農(nóng)藥殘留超標(biāo)的同時(shí)，也使得該病害對(duì)一些常用殺菌劑的敏感性降低[3]。內(nèi)吸性殺菌劑戊唑醇是防治該病害的主要藥劑之一，盡管同類藥劑如三唑酮、三唑醇已在我國(guó)用于防治植物真菌病害多年，但病菌抗藥性問題依然是一個(gè)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，2012年以來(lái)，在山西省運(yùn)城地區(qū)的蘋果園中，已發(fā)現(xiàn)防效降低的問題，為病害的防治造成困難。

戊唑醇(Tebuconazole)為甾醇生物合成抑制劑類(SBIs)殺菌劑中C-14α-脫甲基抑制劑(14α-demethylation inhibitors,DMIs)中的三唑類(triazoles)殺菌劑，這類殺菌劑通過其含氮雜環(huán)上的氮原子與甾醇14α-脫甲基酶CYP51的血紅素-鐵活性中心以配位鍵結(jié)合，從而干擾或阻礙真菌麥角甾醇的生物合成，從而發(fā)揮抗真菌作用。這類殺菌劑高效、廣譜，對(duì)多數(shù)真菌病害有良好防效，成為目前頗具開發(fā)應(yīng)用潛力的藥劑[4]。但由于三唑類殺菌劑作用位點(diǎn)相對(duì)單一，長(zhǎng)期、頻繁、大量使用，易使病原菌產(chǎn)生抗藥性。目前，已有報(bào)道許多病原菌對(duì)其產(chǎn)生了抗性，有些老品種已失去防效，如三唑酮和三唑醇[5,6]。

戊唑醇?xì)⒕淖饔脵C(jī)制為抑制真菌細(xì)胞麥角甾醇的生物合成，從而改變細(xì)胞膜脂質(zhì)成分的組成，損傷真菌細(xì)胞膜及改變細(xì)胞膜通透性?，F(xiàn)有研究顯示，對(duì)戊唑醇產(chǎn)生抗藥性的植物病原真菌對(duì)滲透壓的敏感性及細(xì)胞膜的透性較敏感菌株減小[7]。本研究以蘋果斑點(diǎn)落葉病菌敏感菌株及室內(nèi)誘導(dǎo)的抗戊唑醇突變體為材料，比較了抗感菌株滲透壓敏感性、細(xì)胞膜透性及藥劑對(duì)麥角甾醇合成影響的差異，為研究該病菌對(duì)戊唑醇的抗藥性機(jī)理奠定基礎(chǔ)，也為藥劑的合理使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

敏感菌株YC10、YC11，由未施用過戊唑醇的蘋果斑點(diǎn)落葉病病葉上采集分離獲得；低抗突變體YC10R3、YC11R11，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室通過室內(nèi)紫外誘導(dǎo)獲得；中抗突變體YC11R14、YC11R15，通過藥劑馴化獲得。

1.2 供試材料

培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基、PDB液體培養(yǎng)基。

試劑：葡萄糖、氯化鈉、甲醇(色譜純)、雙蒸水、氯仿、氫氧化鉀、乙醇、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、石油醚(bp60～90℃)、98.0%麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品。

儀器：真空抽濾裝置、搖床、電導(dǎo)儀、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、分液漏斗、勻漿機(jī)、Waters600高效液相色譜儀、色譜柱Bondapak-C18column。

1.3 抗感菌株滲透壓敏感性

將敏感菌株和抗性突變體于PDA平板上25 ℃培養(yǎng)3 d，分別接入含NaCl及葡萄糖不同濃度的PDA平板上，25 ℃培養(yǎng)5 d后測(cè)量菌落直徑，每處理重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞質(zhì)膜透性測(cè)定

用5 mm打孔器分別在PDA平板上培養(yǎng)3 d后的抗感菌株的菌落邊緣打取直徑為5 mm的三個(gè)菌塊，接入PDB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，5 d后，取菌絲用重蒸水沖洗過濾，真空抽濾后稱取鮮重0.5 g菌絲放入試管中，加入20 mL重蒸水(使樣品完全浸在水中120 r·min-1振蕩20 min)，用DDS-AⅡ型電導(dǎo)儀測(cè)定5、15、30、60、90、120 min時(shí)的電導(dǎo)率值，最后將菌絲在沸水中煮5 min后，冷卻至室溫后，再測(cè)一次電導(dǎo)率值作為對(duì)照，每株重復(fù)測(cè)3個(gè)試管，求電解質(zhì)外滲百分率。

1.5 菌絲中麥角甾醇含量測(cè)定

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

稱取麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品0.0520 g，置于 50 mL容量瓶中，加入無(wú)水乙醇溶解、定容、搖勻，即得每1 mL含麥角甾醇1.04 mg的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.5.2 菌絲處理

收集PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)4 d的菌絲0.5 g置于PDB液體培養(yǎng)基中，25 ℃±2 ℃搖動(dòng)培養(yǎng)14 d。濕菌絲用吸水紙吸干后，分別稱取等量菌絲置于用無(wú)菌水配制的不同濃度藥劑中處理培養(yǎng)7 d待用。

1.5.3 供試品溶液的制備

精密稱取烘干研磨后的菌絲體干粉0.1 g，加5 mL無(wú)水乙醇浸提過夜，超聲提取40 min即得。上樣前用0.45 μm微孔濾膜過濾。

1.5.4 麥角甾醇含量測(cè)定

參考夏曉明等[8]的方法。配制系列濃度的麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品。以病菌麥角甾醇為樣品，在Waters600高效液相色譜儀上以甲醇和水(90∶10，體積比)為流動(dòng)相，色譜柱Bondapak-C18column(Waters Associates Inc.)、流速1 mL·min-1、檢測(cè)波長(zhǎng)282 nm、柱溫25 ℃條件下測(cè)定樣品中麥角甾醇含量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)采用Excel軟件整理，方差分析采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗感菌株滲透壓敏感性測(cè)定結(jié)果

由表1可知敏感菌株和突變體菌落直徑均隨葡萄糖濃度升高而增大，敏感菌株YC10 和YC11分別在葡萄糖濃度2%和4%時(shí)，菌落直徑即達(dá)到最大水平。而抗性突變體YC11R11/YC10R3和中抗YC11R14/YC11R15分別在葡萄糖濃度為8%和10%的平板上菌落直徑才達(dá)到最大水平，且與含有較低濃度葡萄糖平板生長(zhǎng)的菌落直徑差異顯著。這表明抗感菌株均對(duì)葡萄糖滲透壓不敏感，另外，培養(yǎng)基碳源相對(duì)含量增加時(shí)，敏感菌株生長(zhǎng)速率隨葡萄糖濃度的增加而速度增大，抗性突變體生長(zhǎng)速率增加較緩慢，在培養(yǎng)基葡萄糖濃度達(dá)8%及以上時(shí)與敏感菌株沒有顯著差異。

表1 不同濃度葡萄糖培養(yǎng)基上抗感菌株菌落直徑/cm

注：表中數(shù)據(jù)經(jīng)Duncan氏新復(fù)極差檢驗(yàn)，不同小寫字母表示5%水平差異顯著。YC10、YC11為敏感菌株，YC11R11、YC10R3為低突變體，YC11R14、YC11R15為中抗突變體，下表同。

Note： Data in the table were tested by Duncan’s multiple range tests; data in the same row followed by the different lowercases indicated significant difference at 5% level.YC10 and YC11 are sensitive isolates,YC11R11 and YC10R3 are low resistant mutants,YC11R14 and YC11R15 are moderate resistant mutants.Similarly hereinafter.

測(cè)定結(jié)果表明(見表2)，敏感菌株YC10、突變體YC10R3、YC11R11菌落直徑隨NaCl濃度升高而減小，YC11及YC11R14、YC11R15菌落直徑隨NaCl濃度呈先升后降趨勢(shì)，當(dāng)培養(yǎng)基中NaCl濃度大于3%時(shí)，抗感菌株菌落直徑均顯著降低。這表明抗感菌株對(duì)較高滲透壓均表現(xiàn)敏感。且敏感菌株與不同抗性水平突變體之間菌落直徑隨滲透壓變化沒有規(guī)律性，說明突變體抗性水平與滲透壓敏感性之間沒有直接聯(lián)系。

表2 不同濃度NaCl培養(yǎng)基上抗感菌株菌落直徑/cm

2.2 細(xì)胞質(zhì)膜透性測(cè)定結(jié)果

測(cè)定結(jié)果(表3)表明，抗感菌株在15～30 min之間相對(duì)電導(dǎo)率值均上升較快，30 min后隨時(shí)間的延長(zhǎng)變化不明顯。在30～120 min內(nèi)低抗菌株YC11R11相對(duì)電導(dǎo)率始終低于敏感菌株YC11，而中抗菌株YC11R15相對(duì)電導(dǎo)率值始終高于敏感菌株YC11。低抗菌株YC11R11的平均電導(dǎo)率值分別為 20.34%，低于敏感菌株YC11的平均電導(dǎo)率值31.51%，而中抗菌株的平均電導(dǎo)率值為41.29%，高于敏感菌株。這說明低抗菌株細(xì)胞膜透性較敏感菌株低，而中抗菌株膜透性則較敏感菌株高，能在相同時(shí)間內(nèi)滲出更多電解質(zhì)。

表3 抗感菌株細(xì)胞膜電導(dǎo)率比較

2.3 抗感菌株麥角甾醇含量測(cè)定

抗感菌株菌絲麥角甾醇含量測(cè)定結(jié)果(表4)表明，用戊唑醇處理的敏感菌株YC10和YC11菌絲麥角甾醇含量與未用藥劑處理的對(duì)照相比在5%及1%水平顯著降低，而低抗突變體YC11R11處理與對(duì)照沒有顯著差異，YC10R3菌絲藥劑處理后麥角甾醇含量5%水平較對(duì)照顯著降低，但1%極顯著水平?jīng)]有差異。中抗突變體YC11R14和YC11R15菌絲麥角甾醇含量較對(duì)照顯著增大。

表4 抗感菌株細(xì)胞內(nèi)麥角甾醇含量/μg·g-1

注：表中數(shù)據(jù)經(jīng)Duncan氏新復(fù)極差檢驗(yàn)，不同小寫字母表示5%水平差異顯著，不同大寫字母表示1%水平差異顯著。

Note： Data in the table were tested by Duncan’s multiple range tests; data in the same row followed by the different lowercases indicated significant difference at 5% level,different capital letters indicated significant difference at 1% level.

3 討論與結(jié)論

本研究比較了蘋果斑點(diǎn)落葉病菌對(duì)戊唑醇不同水平的突變體和敏感菌株的滲透壓敏感性和藥劑處理后的電導(dǎo)率變化。結(jié)果顯示，抗感菌株對(duì)高滲透壓均表現(xiàn)敏感，這與Ellis等[9]報(bào)道的菌體在高滲透壓環(huán)境中需要合成甘油來(lái)維持細(xì)胞膨壓，因而消耗能量生長(zhǎng)受到抑制的觀點(diǎn)一致。但夏曉明等[6]指出對(duì)戊唑醇敏感的禾谷絲核菌菌株對(duì)滲透壓較為敏感，抗性菌株的滲透壓調(diào)節(jié)能力大于敏感菌株。張永杰等[10]、任璐等[11]、石志琦等[12]分別比較了對(duì)二甲酰亞胺類殺菌劑產(chǎn)生抗藥性的不同病原菌的滲透壓敏感性，發(fā)現(xiàn)抗性菌株均表現(xiàn)為滲透壓敏感。而本文研究結(jié)果與以往報(bào)道不一致，作者認(rèn)為蘋果斑點(diǎn)落葉病菌抗戊唑醇突變體抗性產(chǎn)生及不同抗性水平與滲透壓敏感性之間沒有直接聯(lián)系，這種表現(xiàn)出無(wú)規(guī)律性的原因有待進(jìn)一步研究。與以往研究結(jié)果的差異與不同類型藥劑作用機(jī)理不同有關(guān)，也可能與不同病原菌本身差異有關(guān)。

電導(dǎo)率法可以衡量溶液中離子強(qiáng)度的高低，在生物學(xué)領(lǐng)域，電導(dǎo)率與溶液中離子濃度有關(guān)[13]。細(xì)胞膜透性大小可以用電導(dǎo)率來(lái)表示，電導(dǎo)率的高低反映了單位時(shí)間細(xì)胞膜通過物質(zhì)量的大小[4]。有研究表明，戊唑醇本身就能引起病菌細(xì)胞膜透性變化而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[14,15]，本研究抗感菌株電導(dǎo)率研究結(jié)果表明低抗菌株電導(dǎo)率低于敏感菌株，而中抗菌株則高于敏感菌株，說明低抗菌株細(xì)胞膜透性較敏感菌株低，中抗菌株則較敏感菌株高，中抗菌株表現(xiàn)出的比敏感菌株單位時(shí)間可以滲出較多電解質(zhì)這一結(jié)果與張永杰等[10]、石志琦等[12]和葉滔等[4]的研究結(jié)果相一致，說明短時(shí)間內(nèi)中抗突變體能夠更快速地將殺菌劑排出，這可能是該病菌對(duì)戊唑醇產(chǎn)生抗藥性的生理機(jī)制之一。但與Gyung等[16]報(bào)道的灰葡萄孢敏感菌株滲透值大于抗乙烯菌核利突變體的結(jié)果不同。Gyung等[16]報(bào)道的結(jié)果與本研究中低抗菌株膜透性表現(xiàn)出的結(jié)果一致，表現(xiàn)出與中抗菌株相反的結(jié)果。因此，不同抗性水平突變體藥劑處理后電導(dǎo)率的穩(wěn)定時(shí)間還有待進(jìn)一步研究。

麥角甾醇是真菌細(xì)胞膜的主要成分，由于甾醇類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，其測(cè)定存在一定難度[17]，皂化是提取麥角甾醇的關(guān)鍵一步，本研究采用醇?jí)A皂化分離麥角甾醇，用高效液相色譜法成功檢測(cè)出抗感菌株麥角甾醇含量，該法操作簡(jiǎn)單快速，靈敏度高。研究結(jié)果得出，麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間約為13.5 min，抗感菌株樣品均能在13.5 min出峰。敏感菌株經(jīng)戊唑醇處理后，菌絲內(nèi)麥角甾醇含量顯著降低，而抗性突變體藥劑處理后菌絲麥角甾醇含量沒有顯著降低，表明該類殺菌劑確實(shí)作用于真菌麥角甾醇生物合成途徑。

另外，由于本研究通過蘋果斑點(diǎn)落葉病菌室內(nèi)的抗性誘導(dǎo)，只獲得了低抗和中抗突變體，未得到高抗突變體，因此，結(jié)果只能初步反映出該病菌低中抗突變體對(duì)戊唑醇的抗藥性生理機(jī)制，而高抗突變體的抗性機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

[1]時(shí)春喜,樊民周,段雙科,等.阿米西達(dá)防治蘋果黑星病和斑點(diǎn)落葉病的效果[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2004,13(4):55-58.

[2]李順江,周建欣.蘋果早期落葉病的發(fā)生與防治[J].河北果樹,2012(5):38-39.

[3]李東鴻,趙政陽(yáng),趙惠燕,等.蘋果早期落葉病發(fā)病規(guī)律與藥劑防治研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2005,33(5):76-80.

[4]葉滔,馬志強(qiáng),畢秋艷,等.植物病原真菌對(duì)甾醇生物合成抑制劑類(SBIs)殺菌劑的抗藥性研究進(jìn)展[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào),2012,14(1):1-16.

[5]詹家綏,吳娥嬌,劉西莉,等.植物病原真菌對(duì)幾類重要單位點(diǎn)殺菌劑的抗藥性分子機(jī)制[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,47(17):3392-3404.

[6]夏曉明,王開運(yùn),范昆,等.抗戊唑醇禾谷絲核菌的滲透壓敏感性及相對(duì)滲率變化研究[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào),2005,7(2):126-130.

[7]姜莉莉,王紅艷,夏曉明,等.草莓枯萎病菌抗戊唑醇突變體ZY-W的生理生化特性[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào),2012,14(1):42-50.

[8]夏曉明,王金花,王開運(yùn),等.反相高效液相色譜法分析禾谷絲核菌菌絲中麥角甾醇和羊毛甾醇的含量[J].分析化學(xué),2007,35(2):255-258.

[9]Ellis SW,Grindle M.Effect of osmotic stress on yield and polyolcontent of dicarboximide-sensitive and resistant strains of Neurospora crassa[J].Mycol Res,1981,95:457-464.

[10]張永杰,高俊明,韓巨才,等.抗速克靈灰霉病菌菌株電導(dǎo)率變化及對(duì)滲透壓的敏感性[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2004,24(1):34-36.

[11]任璐,劉慧平,韓巨才.番茄早疫病菌抗感異菌脲菌株特性研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,32(2):283-288.

[12]石志琦,周明國(guó),葉鐘音.核盤菌對(duì)菌核凈的抗藥性機(jī)制初探[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào),2000,2(2):47-51.

[13] 陳因良,陳志宏.細(xì)胞培養(yǎng)工程[M].上海：華東化工學(xué)院出版社,1992:85-86.

[14]史建榮,王裕中,陳懷谷,等.小麥紋枯病的菌絲融合群及其致病力測(cè)定[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)——麥紋枯病專輯,1993:25-29.

[15]陳茹梅,李金玉,邵映田,等.戊唑醇對(duì)小麥紋枯菌超微結(jié)構(gòu)的影響[J].菌物系統(tǒng),2000,19(3):389-398.

[16]Gyung JC,Hee JL,Cho KY.Lipid peroxidation and membrane disruption by vinclozolin in dicarboximide-susceptible and-resistant isolates ofBotrytiscinerea[J].Pestic Biochem Physi,1996,55:29-39.

[17]謝和金,盧毅,邱詠梅,等.高效液相色譜法測(cè)定酵母中麥角固醇含量[J].生物工程進(jìn)展,2000,20(4):75-76.

(編輯：武英耀)

Characteristic of Cytomembrane and Determination of Ergosterol in ResistantAlternariaalternariaMutants to Tebuconazole

Ren Lu1，Yao Zhong1，Zhao Xiaojun2，Han Jucai1，Liu Huiping1*

(1.CollegeofAgriculture，ShanxiAgriculturalUniversity，TaiguShanxi030801，China；2.InstituteofPlantProtection，ShanxiAcademyofAgriculturalSciences，TaiyuanShanxi030006，China)

To determine the physiological and biochemical characteristics of tebuconazole-resistant mutants ofAlternariaalternaria,and calculate the resistance mechanism,changes of the sensitivity to osmolarity,cell membrane permeability and intracellular ergosterol content were compared between resistant mutants and the sensitive isolates treated by tebuconazole.The results showed: 1) the sensitivity of mutants and sensitive isolates to different osmolarity has no regularity,and resistance level of mutants has no direct link to osmotic pressure sensitivity.2)the results of ergosterol determination showed that the intracellular ergosterol content of sensitive isolates decreased and moderate resistant mutants increased significantly after tebuconazole treatment,which of low resistant mutants had not significant change.3)the results of cytomembrane permeability showed that,the relative leakage of low resistant mutants were lower than that of the sensitive isolates,and moderate resistant mutants could leak more electrolyte than the sensitive isolates at the same time.The conclusion indicated that the development of tebuconazole resistance ofAlternariaalternariawas accompanied by the changes of the physiology and biochemistry charateristics,layed the foundation for further study.

Alternariaalternariaf.spmail; Resistance;Demethylation inhibitors;Membrane permeability;Ergosterol

2015-01-29

2015-03-27

任璐(1982-),女(漢),山西太原人,博士,研究方向：農(nóng)藥毒理學(xué)與生物農(nóng)藥

*通訊作者：劉慧平，教授，博士，博士生導(dǎo)師。Tel:0354-6288679,E-mail:sxndlhp@163.com

山西省自然科學(xué)基金(2013011032-2)；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金(201220)

S481+.4

A

1671-8151(2015)03-0253-05