甜柿SSR擴(kuò)增反應(yīng)體系的建立

段國鋒，李麗娟，王爭(zhēng)爭(zhēng)，劉群龍*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 信息學(xué)院，山西 太谷 030800；3.山西省生物研究所，山西 太原 030000)

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甜柿SSR擴(kuò)增反應(yīng)體系的建立

段國鋒1，李麗娟2，王爭(zhēng)爭(zhēng)3，劉群龍1*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 信息學(xué)院，山西 太谷 030800；3.山西省生物研究所，山西 太原 030000)

本試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，對(duì)“陽豐”甜柿SSR-PCR體系中DNA模板濃度、MgCl2濃度、dNTPs濃度、引物、Taq酶用量等進(jìn)行了優(yōu)化，通過瓊脂糖凝膠電泳對(duì)譜帶進(jìn)行分析，結(jié)果表明體系10為最佳體系:20 μL擴(kuò)增反應(yīng)體系中，25 mmol·L-1MgCl2溶液1.4 μL，10 mmol·L-1dNTPs混合液0.4 μL，10 mmol·L-1引物1.1 μL，5 U·μL-1Taq酶液0.4 μL，10 ng·μL-1DNA溶液4.0 μL。所有參試因素中Taq酶對(duì)“陽豐”甜柿SSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果影響最大，dNTPs對(duì)PCR結(jié)果影響最小。

甜柿；SSR；PCR反應(yīng)體系

柿(DiospyroskakiThunb.，2n = 6x = 90)，中國為原產(chǎn)地。在我國有2000 年以上的栽培歷史，但我國長(zhǎng)期以來主要以澀柿生產(chǎn)為主[1]。柿品種間分類較為復(fù)雜，目前就甜柿而言，可主要分為非完全甜柿(non-PCNA)和完全甜柿(PCNA，Pollination-constant and non-astringent)兩類[2～5]。

我國早在1920年就開始從日本引進(jìn)甜柿品種栽培[6]。“陽豐”甜柿，屬于完全甜柿，于1990年在日本育成，親本為：富有×次郎，是產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)良的甜柿品種[7]，由于其具有很高的豐產(chǎn)性和優(yōu)良的品質(zhì)，目前在我國栽培面積逐年增加，但市場(chǎng)上其苗木非?；祀s。

SSR(Simple Sequence Repeats)，微衛(wèi)星DNA或小衛(wèi)星DNA。SSR分子標(biāo)記具有操作便捷、可靠性高、高重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，近年來，SSR已經(jīng)應(yīng)用于果樹品種檢測(cè)，Thomas[8]，Kijas[9]，Weising[10]利用SSR技術(shù)分別對(duì)葡萄、柑橘、獼猴桃等進(jìn)行了分析研究。Gannavarapur等對(duì)桃屬進(jìn)行了SSR擴(kuò)增研究，認(rèn)為大多數(shù)引物能進(jìn)行有效的SSR擴(kuò)增，結(jié)果能夠獲得理想的擴(kuò)增產(chǎn)物[11]。Guilford等利用SSR技術(shù)對(duì)蘋果品種進(jìn)行了多態(tài)性分析，所用引物中有兩條引物可以有效的將供試品種高效區(qū)分開[12]。Kentaro等利用S-RNase基因，并結(jié)合SSR引物對(duì)8個(gè)供試蘋果品種的親代與子代關(guān)系進(jìn)行了分析，結(jié)果表明SSR能很好的用于蘋果品種的親子代關(guān)系分析研究[13]，劉曉麗利用SSR技術(shù)對(duì)核桃屬進(jìn)行了研究，認(rèn)為中國是世界栽培核桃非常重要的起源中心之一[14]。畢紅園等以玉露香梨為材料進(jìn)行了SSR分析表明SSR技術(shù)在梨苗木檢測(cè)方面有很高的應(yīng)用價(jià)值[15]。本研究以“陽豐”甜柿為材料進(jìn)行了SSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化，以期為甜柿的苗木鑒定和育種工作提供一定的理論支持。

1 試驗(yàn)材料與儀器

試驗(yàn)在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院果樹學(xué)科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 材料

試驗(yàn)材料采自山西省臨猗縣8年生“陽豐”甜柿樹幼嫩樹葉，液氮冷凍，快速帶回實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器設(shè)備、藥品

1.2.1 儀器設(shè)備

天平、移液槍、恒溫水浴箱、GG322-TGL-16M臺(tái)式高速離心機(jī)、EDC-810PCR儀、北京六一DYCZ-30C 型電泳儀等。

1.2.2 藥品

提取液試劑：CTAB、Tris-HCL、NaCl、EDTA、β-巰基乙醇、氯仿-異戊醇(24∶1)。

引物為DKs83：正義引物為GAAGAACAGGGGAGAAGG、反義引物為TGGCAGCAGTAACAGCAT，GenBank收錄號(hào)：DC59761。

10×Buffer；氯化鎂(MgCl2)；dNTPs：(dATP、dCTP、dGTP、dTTP等濃度混合液)；Taq酶。

電泳試劑：0.5×TBE(Tris-HCl、EDTA、硼酸)緩沖液；溴化乙錠等。

2 方法

2.1 DNA的提取

提取液配方采用CTAB法，參考文獻(xiàn)[16]并略有改動(dòng)。

① 將甜柿幼葉片置于液氮環(huán)境中研磨，取適量，轉(zhuǎn)入已預(yù)熱的(700 μL)CTAB提取液的1.5 mL離心管中。

② 將離心管置于60℃的水浴鍋中，水浴30 min，期間上下輕輕晃勻數(shù)次。

③ 加入700 μL氯仿-異戊醇(24∶1)，輕輕混勻5 min，10 000 r·min-1離心15 min。

④ 取上清液轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管，分別加入500 μL冰冷的無水乙醇，輕輕混勻，用解剖針挑出呈絮狀的DNA轉(zhuǎn)入新的離心管。

⑤ 75%乙醇浸洗兩次每次5 min，去除酒精，將DNA 放置室溫陰干。

⑥ 將DNA加入適量的無菌去離子水溶解，置于-20℃冰箱，備用。

2.2 反應(yīng)體系的優(yōu)化

采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)SSR-PCR體系中的MgCl2、dNTPs、引物、Taq酶、模板DNA等進(jìn)行優(yōu)化。采用L16(45)正交表，5個(gè)因素，每因素4個(gè)水平，共16個(gè)處理，各處理重復(fù)4次，因素水平設(shè)置見表1。

表 1 PCR反應(yīng)體系因素和水平Table 1 The factors and level of PCR reaction system

注：dNTPs濃度為10 mmol·L-1，MgCl2濃度為25 mmol·L-1，引物濃度為10 μmol·L-1,Taq酶液為5 U·μL-1，DNA濃度為10ng·μL-1。表2同。

Note： MgCl2solution is 25 mmol·L-1,dNTPs mixture solution is 10 mmol·L-1,primers solution is 10 mmol·L-1,Taq enzyme solution is 5 U·μL-1,DNA solution is10 ng·μL-1.Table 2 is the same.

采用20 μL反應(yīng)體系，按表2中的因素水平安排試驗(yàn)(去離子水補(bǔ)充至20 μL)，并編號(hào)，每編號(hào)重復(fù)4次。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min，94℃變性35 s，56℃退火35 s，72℃延伸1 min,30循環(huán)，72℃延伸7 min[17]。對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 2 The factor level of orthogonal test design

3 結(jié)果與分析

由圖1可以看出，各反應(yīng)體系隨著因素的水平組合不同，PCR擴(kuò)增的效果也不相同。體系4、15雖有2～3條譜帶，但譜帶模糊不清；體系2、6、7、8、11、12、14基本上沒有譜帶擴(kuò)增出來；體系1、5、16僅擴(kuò)增出1條譜帶；體系9、13擴(kuò)增的譜帶雖然多達(dá)3條，但擴(kuò)增結(jié)果并不理想。體系3和體系10擴(kuò)增的效果基本一致，二者擴(kuò)增的譜帶多且豐富，譜帶數(shù)均為13條，均能夠進(jìn)行分析，但體系10擴(kuò)增的譜帶相對(duì)更為清晰，結(jié)合經(jīng)濟(jì)效益分析，體系10是擴(kuò)增效果最好的體系。該體系為：10 mmol·L-1dNTPs混合液0.4 μL，25 mmol·L-1MgCl2溶液1.4 μL，10 mmol·L-1prime 1.1 μL，5 U·μL-1Taq酶液0.4 μL，10 ng·μL-1DNA溶液1 μL。

圖1 正交體系瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of orthogonal system

結(jié)合圖1、表2和表3可以得出，Taq酶用量對(duì)擴(kuò)增結(jié)果影響較大，20 μL反應(yīng)體系2 U效果最好。Mg2+濃度對(duì)擴(kuò)增結(jié)果影響起伏較大，對(duì)于“陽豐”甜柿SSR-PCR擴(kuò)增時(shí)Mg2+濃度為1.75～2.0 mmol·L-1時(shí)，效果擴(kuò)增效果較好；所有參試因素中Taq酶對(duì)“陽豐”甜柿SSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果影響最大，dNTPs對(duì)PCR結(jié)果影響最小。

表3 PCR正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果直觀分析Table 3 Visual analysis of PCR orthogonal design of experiment results

4 討論與結(jié)論

SSR-PCR 反應(yīng)體系中，Taq酶用量對(duì)擴(kuò)增結(jié)果影響較大，20μL反應(yīng)體系2 U效果最好。Mg2+通過影響Taq酶對(duì)擴(kuò)增結(jié)果造成影響，濃度過低，出帶不亮，甚至不出帶；濃度過高，非特異性擴(kuò)增增加。模板DNA濃度過低，會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增條帶模糊，造成結(jié)果不穩(wěn)定；模板DNA濃度過高時(shí)容易導(dǎo)致dNTPs 與引物過早消耗完，擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定性差。一般來說，Prime濃度過高容易引起堿基錯(cuò)配率增加，非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生，容易形成二聚體，導(dǎo)致擴(kuò)增結(jié)果特異性和穩(wěn)定性差。在PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq 酶的濃度應(yīng)該盡量適中，過高不僅會(huì)造成試驗(yàn)成本的增加，而且極易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生；濃度過低則直接導(dǎo)致產(chǎn)物的合成效率下降[15,18],擴(kuò)增結(jié)果不穩(wěn)定。本試驗(yàn)所有參試因素中Taq酶對(duì)PCR結(jié)果影響最大，dNTPs對(duì)“陽豐”甜柿SSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果影響最小，這與畢紅園[15]，劉曉麗[14]，段國鋒[16]等的結(jié)論一致。

應(yīng)用單因素試驗(yàn)優(yōu)化反應(yīng)體系，需要進(jìn)行多批次試驗(yàn)，試驗(yàn)繁瑣，成本較高[15,19]。采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，可以減少繁雜試驗(yàn)規(guī)模，并且能非?？旖莸卣业阶顑?yōu)試驗(yàn)組合[20]，雖然正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是對(duì)部分處理進(jìn)行試驗(yàn)，但由于它具有以上兩個(gè)特征，因此非常適合進(jìn)行組合優(yōu)化試驗(yàn)，該試驗(yàn)運(yùn)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)可以充分實(shí)現(xiàn)對(duì)體系的篩選，是非常良好的反應(yīng)體系優(yōu)化方法。

與其它分子標(biāo)記技術(shù)相比,SSR標(biāo)記多態(tài)性更高、帶型更穩(wěn)定，技術(shù)條件要求不高,實(shí)驗(yàn)費(fèi)用相對(duì)較少,而且譜帶更便于識(shí)別，因此，SSR標(biāo)記將是一種高效的甜柿品種鑒定方法。此外，本試驗(yàn)引入變異系數(shù)對(duì)結(jié)果分析，雖然能更科學(xué)的說明一些問題，但是其評(píng)價(jià)依據(jù)數(shù)據(jù)來源過于直觀，會(huì)影響結(jié)果的可靠性。

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(編輯:馬榮博)

Establishment of SSR Amplification Reaction System of PCNA

Duan Guofeng1,Li Lijuan2，Wang Zhengzheng3,Liu Qunlong1*

(1.CollegeofHorticulture,ShanxiAgriculturalUniversity,TaiguShanxi030801,China; 2.CollegeofInformation,ShanxiAgriculturalUniversity,TaiguShanxi030801,China;3.BiologyInstituteofShanxi,TaiyuanShanxi030000，China)

In this experiment using the orthogonal experimental design method,the "Yangfeng" persimmon SSR-PCR system.DNA template concentration,MgCl2concentration,dNTPs concentration,primers,Taq enzyme dosage was optimized,and the results was analysed by agarose gel electrophoresis.The results showed that the 10th system was the best system.The 20 μL amplification reaction system consisted 25 mmol·L-1MgCl2solution 1.4 μL,10 mmol·L-1dNTPs mixture 0.4 μL and 10 mmol·L-1primers 1.1 μL,5 U·μL-1Taq enzyme 0.4 μL and 10 ng·μL-1DNA solution 4.0 μL.All the tested factors,Taq enzyme was the biggest factor of influence on the "Yang Feng" persimmon SSR-PCR,dNTPs with minimal impact on the results of PCR.

PCNA;SSR;PCR reaction system

2015-03-04

2015-04-24

段國鋒(1978-)，男(漢)，山西運(yùn)城人,講師,博士研究生，研究方向：果樹遺傳育種與采后生理

*通訊作者：劉群龍，副教授，碩士生導(dǎo)師。Tel：13935447606 ；E-mail:lql0288@126.com

國家林業(yè)局948項(xiàng)目(2012-4-67)

S661.2

A

1671-8151(2015)03-0236-05