雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)在蛋白質(zhì)相互作用研究中的應(yīng)用*

沈珂 吳群英 蔣曉山

細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)通常需要與其他蛋白質(zhì)或配體結(jié)合，形成瞬時(shí)或穩(wěn)定的復(fù)合體來(lái)實(shí)現(xiàn)其特定的功能，這種蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用（protein-protein interaction，PPI）在人類、酵母、植物、線蟲(chóng)等各種生物體的生命活動(dòng)中起著十分重要的作用[1-4]。目前，PPI研究技術(shù)發(fā)展迅速，常用的有免疫共沉淀、GST-pull down、表面等離子共振（SPR）、蛋白質(zhì)芯片等體外實(shí)驗(yàn)技術(shù)，以及酵母雙雜交、蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)（PCA）、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET） 技術(shù)等。近十余年興起的雙分子熒光互補(bǔ) （bimolecular fluorescence complementation，BiFC）技術(shù)由于無(wú)需試劑檢測(cè)，能夠通過(guò)熒光顯微鏡在接近活細(xì)胞生理狀態(tài)的條件下快速、直觀地檢測(cè)目標(biāo)蛋白是否具有相互作用，在PPI研究中的應(yīng)用正日益廣泛。

1 BiFC技術(shù)的原理

Regan（2000）和Kerppola（2002）兩個(gè)研究小組最早發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證了活細(xì)胞內(nèi) BiFC 現(xiàn)象。他們首先將1個(gè)GFP的突變子增強(qiáng)型黃色熒光蛋白（EYFP）從不同位點(diǎn)切開(kāi)，然后將一組相互作用、同向平行的亮氨酸拉鏈（bFos和bJun）分別融合到從Ala154-Asp155之間切開(kāi)的增強(qiáng)型黃色熒光蛋白（EYFP）氨基（N）片段和羧基（C）片段，導(dǎo)入大腸桿菌中共表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所構(gòu)建的一對(duì)融合多肽能夠在細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生YFP的熒光，他們將這個(gè)現(xiàn)象稱之為BiFC[5-6]。

除EYFP外，目前BiFC技術(shù)涉及的熒光蛋白已擴(kuò)展到綠色熒光蛋白（GFP）、青色熒光蛋白（CFP）、紅色熒光蛋白（RFP）及其突變體等多種熒光蛋白，其原理都是將熒光蛋白在特定的位點(diǎn)切開(kāi)，形成不發(fā)熒光的N和C端 2個(gè)多肽，稱為 N 片段（N-fragment）和C片段（C-fragment）。這2個(gè)片段在細(xì)胞內(nèi)共表達(dá)或體外混合時(shí)，不能自發(fā)組裝成完整的熒光蛋白。但是，當(dāng)這2個(gè)熒光片段分別融合到一組有相互作用的目標(biāo)蛋白上，在細(xì)胞內(nèi)共表達(dá)或體外混合這兩組融合蛋白時(shí)，由于目標(biāo)蛋白質(zhì)的相互作用，熒光蛋白的2個(gè)互補(bǔ)片段在空間上互相靠近，重新構(gòu)建成完整的具有活性的熒光蛋白分子，受到激發(fā)后發(fā)射出特定波長(zhǎng)熒光（圖1）。

圖1 BiFC原理示意圖注：NGFP，GFP-N 端；CGFP，GFP-C端；A與B，能發(fā)生相互作用的一對(duì)蛋白

2 BiFC熒光蛋白的發(fā)展

早期用于BiFC 實(shí)驗(yàn)的熒光蛋白主要為綠色熒光蛋白（GFP）及其突變體，包括 EYFP、EGFP、EBFP和ECFP[7-12]。由于它們必須在低溫下（30 ℃）預(yù)孵化0~24 h以促進(jìn)互補(bǔ)片段組裝形成成熟的色團(tuán)分子，因此，不利于生理?xiàng)l件下的胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的研究。2004-2008年，可應(yīng)用于生理?xiàng)l件下的黃色熒光蛋白Citrine和Venus以及青色熒光蛋白Cerulean熒光蛋白被相繼引入BiFC技術(shù)[13]。2006年，Lin等[14]利用紅色熒光蛋白 DsRed和eqFP578發(fā)展而來(lái)的mPlum，mKate，mKate2和Katushka熒光蛋白，構(gòu)建了一組遠(yuǎn)紅光熒光蛋白（far-red fluorescent proteins，F(xiàn)RFP）BiFC 系統(tǒng)。由于遠(yuǎn)紅光能量低、穿透力強(qiáng)、不易引起細(xì)胞自發(fā)熒光和不易被細(xì)胞吸收，因此，能夠克服在哺乳動(dòng)物中無(wú)法實(shí)現(xiàn)熒光蛋白在組織成像的問(wèn)題，在哺乳動(dòng)物的組織成像中具有巨大的應(yīng)用前景。2010年，梳狀珊瑚中發(fā)現(xiàn)了類似于GFP的綠色熒光蛋白Dronpa[15]。Dronpa猶如一個(gè)光開(kāi)關(guān)，在490 nm照射下發(fā)射出綠色熒光，而405 nm的波長(zhǎng)照射則會(huì)使其猝滅。目前，以Dronpa為基礎(chǔ)BiFC系統(tǒng)已用于揭示細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)間轉(zhuǎn)錄蛋白的作用機(jī)制、轉(zhuǎn)錄蛋白功能和蛋白質(zhì)二聚化等的研究[16-18]。

3 BiFC技術(shù)在PPI研究中的應(yīng)用

BiFC涉及的熒光蛋白不僅容易檢測(cè)到BiFC信號(hào)，還可通過(guò)對(duì)可視化的熒光進(jìn)行定量從而確定蛋白質(zhì)相互作用的強(qiáng)弱。熒光蛋白片段一旦重建成完整熒光蛋白后大多數(shù)不可逆，因而特別適用于檢測(cè)亞細(xì)胞環(huán)境中微弱的（mM級(jí)別） 和瞬時(shí)的相互作用[16]。2003年，Hu等[17]將 GFP，YFP，CFP，BFP分別在 155位或173位氨基酸處切開(kāi)產(chǎn)生的N端片段和C端片段任意配對(duì)，進(jìn)行熒光互補(bǔ)檢測(cè)，首次將BiFC技術(shù)觀應(yīng)用于活細(xì)胞中PPI研究。

2014年，任頁(yè)玫等[18]為了解S-periaxin蛋白在施旺氏細(xì)胞內(nèi)分子狀態(tài)，利用基于紅色熒光蛋白mCherry的BiFC系統(tǒng)構(gòu)建原核雙分子熒光互補(bǔ)分析載體 pS-periaxin-Cherry（1-159）和 pmCherry（160-237）-S-periaxin，真核雙分子熒光互補(bǔ)分析載體 pmyc-S-periaxin-MN1-159和 pMC160-237-S-periaxin ， 轉(zhuǎn)化到E.coli BL21，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在真核及原核系統(tǒng)均觀察到在 S-periaxin 蛋白介導(dǎo)下將mCherry 熒光蛋白的兩個(gè)片段重新組裝形成熒光復(fù)合物，發(fā)出紅色熒光，證明S-periaxin蛋白存在同源蛋白相互作用。郭曉令等[19]為了驗(yàn)證PAC1同源二聚化現(xiàn)象，采用基于EYFP黃色熒光蛋白的BiFC系統(tǒng)，用帶有EYFP N端基因標(biāo)記的PAC1與帶有EYFP C端基因標(biāo)記的PAC1共轉(zhuǎn)染 CHO細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)完整的EYFP熒光信號(hào)，表明PAC1可發(fā)生同源二聚化。

細(xì)胞內(nèi)存在著多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，借助BiFC技術(shù)，對(duì)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)中蛋白質(zhì)的相互作用進(jìn)行觀察與分析，可以進(jìn)一步闡明信號(hào)通路的傳遞機(jī)制及生理功能提供了有力的支持[20-22]。K-Ras蛋白是很多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的分子開(kāi)關(guān)，參與多種細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程的信號(hào)傳導(dǎo)及其調(diào)控，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和癌變過(guò)程中扮演著重要角色。一般認(rèn)為在信號(hào)傳遞過(guò)程中，位于細(xì)胞膜上的Ras蛋白將Raf1從胞漿招募到胞膜。2012年，Li等[23]通過(guò)BiFC實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Raf1和K-Ras在細(xì)胞內(nèi)的定位分別在胞漿和胞膜，當(dāng)Raf1從胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜并與膜上的K-Ras結(jié)合形成復(fù)合物時(shí)，細(xì)胞內(nèi)MAPK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)才會(huì)啟動(dòng)；該研究還認(rèn)為K-Ras/Raf1復(fù)合物的膜定位并不完全依賴K-Ras，K-RAS/Raf1的形成起著在這一過(guò)程中起關(guān)鍵作用，揭示了Raf1從胞漿到胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制。

2014年，Yu等[24]運(yùn)用BiFC證實(shí)PAC1為一種具有內(nèi)在二聚體活性的配體非依賴性細(xì)胞表面受體，且其二聚化與Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)，揭示了PAC1二聚體依賴的基礎(chǔ)活性，有助于理解PAC1的生理和病理作用，促進(jìn)了PAC1靶向藥物的發(fā)展。

4 多色熒光 BiFC 技術(shù)

多色熒光互補(bǔ)技術(shù)（multicolor fluorescence complementation，MFC）彌補(bǔ)了BiFC 技術(shù)只能檢測(cè)兩兩蛋白質(zhì)之間的相互作用的不足。Hu等在雙分子熒光復(fù)合物之間的光譜差異的基礎(chǔ)上，將bJun，bFos bATF2共 表 達(dá) 等 量 的bJunCC155和bFosCN173，bATF2YN173，所產(chǎn)生的青色熒光與共表達(dá)bJunCC155和bFosCN173相當(dāng)，而黃色熒光卻只有共表達(dá)bJunCC155和bATF2YN173的不到1%。換 用 bJunCC155，bFosCN155，bATF2YN1553實(shí) 驗(yàn)，得到相同結(jié)果。再次共轉(zhuǎn)bJunCC155，bFosCN155，bATF2YN1553入細(xì)胞，并過(guò)表達(dá) bJunCC155，就能同時(shí)檢測(cè)到青色熒光和黃色熒光。表明bFos，bATF2都能與bJun發(fā)生相互作用，并且bFos的結(jié)合能力遠(yuǎn)強(qiáng)于 bATF2，在bFos和bATF2同時(shí)存在時(shí)，bJun優(yōu)先與bFos結(jié)合[17]。

5 BiFC-FRET技術(shù)檢測(cè)多種蛋白質(zhì)間的相互作用

傳統(tǒng)的BiFC技術(shù)限于兩個(gè)分子之間的相互作用，有一定的局限性，因?yàn)楹芏嘈盘?hào)蛋白是以寡聚體形式發(fā)揮作用。為了克服這個(gè)難題，2008年，Shyu等[25]將BiFC技術(shù)和FRET技術(shù)結(jié)合起來(lái)，建立了基于雙分子熒光互補(bǔ)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（BiFC-FRET），該技術(shù)采用青色熒光蛋白Cerulean 和1個(gè)基于黃色熒光蛋白Venus的BiFC系統(tǒng)聯(lián)用，能同時(shí)檢測(cè)3個(gè)蛋白之間的相互作用。其做法是將 bJun和bFos分別和Venus熒光蛋白的N端C端片段相連，Cerulean 蛋白與NFAT1蛋白相連，bJun和bFos 的相互作用使得Venus蛋白重建；當(dāng)和 Cerulean 融合的蛋白NFAT1和bJun和bFos異源二聚體相互作用時(shí)，Cerulean 可以作為供體將能量共振轉(zhuǎn)移至重建后的 Venus 熒光蛋白，實(shí)現(xiàn)3個(gè)蛋白質(zhì)相互作用的共檢測(cè)。由于熒光互補(bǔ)技術(shù)依賴于熒光蛋白的自身性質(zhì)，并非所有熒光蛋白都能用于該項(xiàng)技術(shù)，因此蛋白選取和熒光性質(zhì)檢測(cè)是該技術(shù)的關(guān)鍵[26]。

6 BiFC 在流式細(xì)胞術(shù)定量分析中的應(yīng)用

Morell等[27]（2007年）采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)BiFC熒光蛋白復(fù)合物的熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，創(chuàng)建了一種實(shí)時(shí)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PPI的研究方法，即雙分子熒光互補(bǔ)流式分析技術(shù)（bimolecular fluorescent complementationflow cytometry， BiFC-FC）。由于流式細(xì)胞儀（FACS）能夠?qū)晒庑盘?hào)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和平均熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析，且能檢測(cè)到較弱的熒光信號(hào)，因此其檢測(cè)結(jié)果較傳統(tǒng)的熒光顯微鏡觀察方法更為可靠。最近報(bào)道了一種由DsRed-Experss2突變而來(lái) E2-Crimson，激發(fā)波長(zhǎng)為611 nm，發(fā)射波峰為646 nm，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，能夠用于超高分辨率受激發(fā)射減損（stimulated emission depletion，STED）顯微鏡觀察，在流式細(xì)胞檢測(cè)中具有很好的應(yīng)用前景[28]。Parvatiyar等利用BiFC-FC完成了HCV蛋白結(jié)構(gòu)域與干擾素誘導(dǎo)基因之間相互作用的篩選，建立了病毒蛋白與宿主因子相互作用的高通量篩選方法[29]。目前，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的BiFC信號(hào)進(jìn)行定量分析，正成為活細(xì)胞BiFC實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)手段。

7 BiFC的缺點(diǎn)及改進(jìn)

BiFC系統(tǒng)中重新形成完整活性蛋白的2個(gè)互補(bǔ)熒光蛋白片段，往往需要幾分鐘到幾小時(shí)的自體催化才能完成，因此觀察到的熒光信號(hào)滯后于蛋白質(zhì)的相互作用過(guò)程，不適用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè) PPI 及對(duì)蛋白復(fù)合體進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析[30-31]。另外，兩個(gè)不發(fā)光的BiFC熒光片段往往會(huì)自發(fā)融合成互補(bǔ)蛋白，導(dǎo)致背景熒光的產(chǎn)生并且降低信噪比（S/N）比。Liu等[32]采用一個(gè)新的 BEVL-BiFC系統(tǒng)——將mLumin 1-151（Ln）和mLumin 151-233（Lc）兩個(gè)熒光片段在雙表達(dá)載體中構(gòu)建BiFC 體系，結(jié)果表明該系統(tǒng)可以明顯降低BiFC體系中因非特異性結(jié)合而導(dǎo)致的假陽(yáng)性。Nakagawa等發(fā)現(xiàn)，特定位點(diǎn)缺失和定點(diǎn)突變可有效減少BiFC的假陽(yáng)性結(jié)果[33]。最近報(bào)道，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中以Venus熒光蛋白（共238個(gè)氨基酸）為基礎(chǔ)的BiFC試驗(yàn)中，對(duì)片段VN155（N堿基1-154黃色），VC155（堿基1-154藍(lán)綠色）第7和第10號(hào)β折疊上的堿基進(jìn)行定點(diǎn)突變，當(dāng)V150L、I152L、L201V、和L207V這幾個(gè)位點(diǎn)被替換掉后，將結(jié)合亮氨酸拉鏈實(shí)驗(yàn)構(gòu)成的互補(bǔ)片段bJun-VN/bFos-VC轉(zhuǎn)染到COS-1細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)自發(fā)熒光明顯減少，信噪比明顯改善[34]，值得注意的是V152L突變體在以Cerulean為熒光蛋白的BiFC實(shí)驗(yàn)中對(duì)信噪比的影響不大[35]，這提示筆者根據(jù)不同的BiFC系統(tǒng)應(yīng)選擇不同的突變體。在陰性對(duì)照選取困難的情況，采用競(jìng)爭(zhēng)性BiFC技術(shù)不失為一種有效手段。如在同向平行的亮氨酸拉鏈bJun-YN155和bFos-YC155融合蛋白實(shí)驗(yàn)中[6]，當(dāng)加入大量的單一亮氨酸肽鏈bJun或bFos后熒光互補(bǔ)現(xiàn)象被抑制，更進(jìn)一步證明了bJun和bFos之間的結(jié)合反應(yīng)。

8 展望

BiFC技術(shù)作為一種新近發(fā)展起來(lái)用于研究蛋白質(zhì)間相互作用的方法，不僅能夠直觀地檢測(cè)PPI、以及蛋白質(zhì)基團(tuán)之間相互作用的強(qiáng)弱關(guān)系，而且還可以檢測(cè)受體之間自身交聯(lián)反應(yīng)，有助于闡明這些受體的功能和作用機(jī)制然而，BiFC技術(shù)本身仍存在局限性，如基于熒光蛋白的BiFC信號(hào)被認(rèn)為是不可逆的[36]，雖然它的不可逆性有助于研究瞬時(shí)和較弱的蛋白相互作用現(xiàn)象，但也限制觀測(cè)動(dòng)態(tài)PPI。隨著B(niǎo)iFC研究的深入和新的性能優(yōu)異的互補(bǔ)片段的發(fā)現(xiàn)，BiFC技術(shù)必將在PPI研究中具有更加廣泛的應(yīng)用前景。

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